构建质粒热激后加了抗性培养基摇3个小时有影响吗_百度知道
构建质粒热激后加了抗性培养基摇3个小时有影响吗
我有更好的答案
我犯过这个错误，用的是DH5α，可能是转化效率过低的缘故转化子数目较少而且几乎没有蓝斑，但是还是挑出了想要的克隆。
采纳率：98%
为您推荐：
其他类似问题
换一换
回答问题，赢新手礼包
个人、企业类
违法有害信息,请在下方选择后提交
色情、暴力
我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
&&XL10 Chemically Competent Cell （XL10化学感受态细胞）
XL10 Chemically Competent Cell （XL10化学感受态细胞）
&丁香通采购保障计划，让您的采购更放心。
供应商信息
商家诚信度：
成立时间：2014年
入驻丁香通年限：6年
商家等级：金牌客户
产品信息完整度：63%
联系人：顾磊
若您通过QQ未能联系到商家，您可以给商家发送站内信，与其取得联系。
扫一扫微信联系商家
电话：021-
地址：上海市沪闵路6088号龙之梦大厦8楼806室
该商家已通过实名认证
数据正在加载，请稍候...
电话: 021-
联系人: 顾磊 （联系我时请说在丁香通看到的）
30秒填写信息，方便商家与您及时沟通
您未登录，
或，即可保存询价历史
给商家留言
我对您在丁香通发布的“XL10 Chemically Competent Cell （XL10化学感受态细胞）” 非常感兴趣。请联系我并提供报价。
让更多商家联系我
你可能感兴趣的产品
丁香通采购热线：400-
Copyright (C)
DXY All Rights Reserved.当前位置： >>
首都师范大学硕士学位论文美洲商陆抗真菌蛋白(PaAFP)基因在烟草及玉米中的遗传转化
首都师范大学 硕士学位论文美洲商陆抗真菌蛋白（PaAFP）基因在烟草 及玉米中的遗传转化姓名：刘爽 申请学位级别：硕士 专业：细胞生物学 指导教师：赵琦目录第一篇美洲商陆抗真菌蛋白(PaAFP)基因在烟草中的遗传转化 摘要 英文摘要 第一部分绪论 第二部分材料和方法 第三部分结果和讨论 第二篇美洲商陆抗真菌蛋白(PaAFP)基因在玉米中的遗传转化 摘要 英文摘要 第一部分绪论 第二部分材料和方法 第三部分结果和讨论 参考文献： 附录Ⅰ化学药品的配制 附录Ⅱ PaAFP 基因正义链全序列 附录ⅢPaAFP 基因 cDNA 序列 附录ⅣPaAFP 基因 cDNA 植物表达载体测序图 附录Ⅴ pCAMBIA1300 载体图 附录Ⅵ硕士期间发表或接受的论文 致谢3 3 4 5 13 31 43 43 44 46 57 62 71 77 79 80 81 82 83 84第一篇 　　 美洲商陆抗真菌蛋白（ａ Ｆ ） ＰＡ Ｐ基因在烟草中的遗传转化Ｐ Ｆ （ ａｅｃ ａ　ｉ ｇ Ｐ ｔ ） 从 洲 　　　　ｍｒａ Ａｔ ｎ ｌ　 ｉ 是 美 商陆 （ ｙ ｌｃａｅｃ ａ　 种 ａ Ｐ　 ｉｎ ｎｆ ａ ｒｅ Ａ Ｐ ．　 ｕ ｏ ｎ Ｐ ｔａ ａ　ｒａ Ｌ的 ｈｏｃ ｍ ｉｎ ． ）子中分离出的一种抗真菌蛋白。 ａ Ｆ 从萌发的种子中 ＰＡ Ｐ 释放出来， 形成抵抗病原菌的抑制 区域，以 抵挡微生物的危害。 ａＦ 具有强碱性，极强的热稳定性，富含 ６ ＰＡ Ｐ 个半肤氨酸。 该蛋白 具有 ｋｏｉ 折叠结构，即一个小型 ３股反向平行 Ａ ｎｔ ｓ ｔ ｎ 一 折叠片，半肮氨酸序列结构摘 要 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（． ． Ｃ． ． ） Ｃ　 ． ． ． 组成二 框架和其采用的 ． ． ．． ． Ｃ ＣＣ Ｃ 硫键 配对形 １ ｝２ ，　 ）它对 式（１，　 ３ 。 包括立 － －５ －６枯丝 菌Ｒｉｃｎ ｓａ） 的 种 状 菌 革 阳 菌生 很强 抑制 用。 核 （ ｚ ｔｉ ｏｎ在内 多 丝 真 和 兰氏 性 长有 的 作 ｈｏｏａ　 ｉ ｌ目前还没有将 ＰＡ Ｐ蛋白转化植物的报道。 ａＦ烟草是生物学研究中的模式植物。 　　　　 具有生长周期短，易培养等多种优势。 本实验以 美洲商陆的叶片为材料提取基因组Ｄ Ａ 利用 Ｐ Ｒ技术扩增 ＰＡ Ｐ Ｎ， Ｃ ａ Ｆ 基因， 切除内含子， 连接第一外显子和第二外显子， 得到 ＰＡ Ｐ ａ Ｆ 基因ｃ Ｎ Ｄ Ａ片段。 ＰＡ Ｐ 将 ａ Ｆ 前体蛋白基因与 Ｕ ｉ ｂ启动子、Ｎｓ终止子同时克隆于质粒 ｐ Ａ ＢＡ ３０中，构建成为植物表达载体 ｏ Ｃ Ｍ Ｉ１ ０ｐＡ Ｂ １ ０ ａＦ。 组 粒 入 杆 Ｂ ４ ４ ， Ｃ Ｍ Ｉ ３ － ＡＰ 将重 质 转 农 菌ＬＡ４ 中 通过叶 法 烟 通 Ａ ０Ｐ ０ 盘 侵染 草， 过 组培， 转 植 提 转 烟草 Ｎ ， Ｃ ，　 － ｕｅ ｂ ｔ ｇ 得到 基因 株。 取 基因 总Ｄ Ａ 经ＰＲ ＰＲ ｏｔｍ　 ｔ 证实， Ｃ Ｓ ｈ ｌｉ ｏｎＰＡ Ｐ ａＦ 基因已 整合到烟草基因组中。Ｒ Ｐ Ｒ检测证明， ａＦ 基因已 Ｔ　 Ｃ ＰＡ Ｐ 在转基因烟草中 转录成ｍ Ｎ ，　Ｓ Ａ Ｅ电 Ｒ Ａ Ｓ － Ｇ 泳中出 ＤＰ 现了与目 的蛋白 相应分子量的蛋白 条带。 转基因植株苗期抗立枯病试验表明，转基因烟草植株对立枯丝核菌表现出了抗性。关键词：ＰＡ Ｐ ａＦ 基因， 烟草， 根癌农杆菌，抗真菌，立枯丝核菌，白斑Ｔ ｅ　 ｓ ｒ ａｉ ａｄ　 ｒ ｓ ｎ　 ａ Ｆ Ｇ ｅ　 ｏａｃ 　　 ｒｎｆ ｍ ｔ ｎ　 Ｅ ｐ ｓｏ ｏＰＡ Ｐ　ｎ ｉＴｂｃｏ ｈ Ｔａ ｏ ｏ ｎ ｘｅ ｉ ｆ　 ｅ ｎ　ＰＡ Ｐ　 ｎ　 ｆ ｇｌ　 ｅ ｉ ａｄ　 ｔ ｅ ｏ ｈｔａ ａ　 ｒａａ　 ｈ ｐ ｅ ｉ 　　　　ａ ａ ｉｎａ ｐ ｔｎ　ｌｅ ｆ ｍ　 ｓ ｄ　Ｐｙ ｌ ｃ ａ ｅｃｎ Ｌ Ｔｅ　ｔｎ　 ａＦ ｉ ｓ　 ｎ ｕ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ ｔ ｒ ｈ ｅ ｆ　 ｏ ｃ ｍ ｉ ｏ ｏ ｅ　 ．　 ｒ ｉ ｓ ｏ ｓ ｄ ｐｃｉａｄ　ａ ｄ　 ｔ ｇｒｉ ｔｇ　ｄ　ｈ ｓｉｏ　 ａ　ｔ ｔｎ　ｅ　ｉｔ　 ｏｅｓ ｅ － ｅ ｆ ｎ ｒｅ ｅ ｆｍ　 ｅ ｍａｎ ｓ ｔｔ ｏ ｔｆ ｍ　 ｒｅ ｉ ｚｎ ａａ ｓｐｔ ｇｎ ｅｓ ｉ ｃ　 ｅ ｓ ｒ ｈ ｌ ｏ ｅ　 ｎ ｉ ｅ ｏ　 ｌ　 ｒ ｐ ｃｏ ｏ ｇ ｎ ａ ｅ ｅ　 ｏ ｏ ｈＴｅ　 ｌ ｙｔｎ－ｃ ｐ ｔｎ　 ｉ ｌｂｓ ａｄ　 ｍ ｓｂ ，　 ｈ　 ｓｔｏ３ ａ ｉ ａｉｒ ｉ ｅｗｔ ｈ ｓａ ｃｓ ｉ ｒｈ　 ｅ ｉ ｇ ｙ　ｉ ｎ ｔ ｒ ｏｔ ｌ ｗ ｉ ｃｎｉｓ　 ８　 ｎ ｃ ｅ ｄ ｓ　 ｍ ｌ　ｅ ｅｉ ｒ ｉ ｓ　 ｏ ｈ ｈ ａｃ　 ｈ ｅ ａ ｅ ｈ ｏ ｓ ｆ　 ｍ ｏ　 ｓ ｕ ｉ ｃ ｄ　 ｈ ｓ ｃｓ ｉ ．　 ａ ｅｏ ｃｎ ｉ ａ　 ｌ ｉｅ ｔｎｅ ａｔａ ｌｌ　ｅｔ　 ｄ ｕ ｈ ｅ　 ｄ　 ｅｏ ｉ ｙｔｎ Ｉ ｆｍ ｗ ｒ ｏｔｎ ｓ ａ ｔｐ －ｒ ｄｄ　ｉ ｒ ｅＢ ｈｅａｄ　 ｌ ｉ ｂｎ ｆ ｍ ｗ ｒ ｘ　 ｅ ｅ ｔｒ ｓ　 ｋ　 ａ ｓ　 ｌ　 ｓａ ｍ ｒｌ ｎｐ ａ － ｓ ｎ ｉ ｐｄ ｏ ｒ ｓ ａ ｋＡｂ ｔａ ｔ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｓｒ ｃｗｔａ　ｓ ｓ ｓ ｕｎ 　 ．Ｃ． Ｃ． ＿Ｃ ａｄ　 ｐｉ ｇ　ｅ 　 ，　 ，　 ）　 ｓ　 ｉ ｃ ｅ ｕ ｅ ｅｃ （ ． ．Ｃ ．Ｃ ）　 ｔ ａｉ ｐｔｒ（ ｈ　 ｎ ｎ ｓ　 ｅ Ｃ　 ． ． ｏ ｑ ． ｎ ｈ ｒ ａｎ １ ｅ　 ｎ ｔ －４ ２ －５ ３ ｓ ｗ ａ －６ ｈ ｏｋｏｉｔ ｅ　ｃ ｒ ｍ ｔ ＰＡ Ｐ　 ｉ ｓ ｉ ｉｔ ｈ ｇ ｗｈ　 ｈ ｏｔ ｉ ｓｌ ｉ　 ｎ　ｖｒ．　 ｎｔ －ｐ ｓ ｔａ ｏｆ ａ Ｆ ｏｖ ｕ ｙ　ｂｓ　 ｒ ｔｏＲ ｉ ｃ ｎａ　ａ Ｋｉ ｉ ｉｏＩ ｎｙ ｔ ｕ ｌ　ｉ ｕ ｒ ．　 ｂ ｏ ｌ ｎ ｉ ｔ ｏ ｆ　ｚ ｏ ｏ ｎ ｉ ｎ　 ｎ ｈ ｅ　 ｈ ｔ ａｄｉ ，　ｈ ｉ ｔ ｇ ｗｈ　ｏ ｅ ｓｌｏ ｅ　 ｏｅｉｆ ｇａｄ　ｅ ｌ　 － ｓｉ ｂｃｒ．　 ｄｉ ｎｉｎｉｔ ｈ ｒ ｔｏ ｔ ｒ　－ ｒ ｐｔ ｇｎ ｕ ｉ　 ｓ ｒ ｇ ｍｐ ｉ ｅ　ｔｉ Ｔｅ ｔ ｔ　ｂｓ　 ｏ ｏ ｉ ｅ　 ｆ　 ｏ ｂ ｈ ｉ ａ ｈ ｃ　 ｎ ｅ ａ ｒ ｏ ｔ ａ ｅａ ｈ ｎ ｖ ａ ｖｐ ｔｎ　 ｙｔ ｓｅ ａ ａ　ｃｒ ｒ　 ｐ ｃｓ ｄ　 ｉ ｍ ｔ ｅ　ｍ　 ｔ ｐ ｃ ｓ　 ｅｒｉ ．　ｆ ｏ ｉ ｓ　 ｈ ｉ ｓ　ｒ ｓ ｎ ｒ ｅ ｎ ｔ ｕ ｏ ｎ　 ｏ ｒｅ ｉｓｎ ｅｚｄ　 ｐ ｕ ｏ ａｄ　 ｅ ｓ ｉｏ　 ａ ｒ ｆ ｉ ｈ ｒ ｓ ｏ ｓ ｅ ｏ Ｓ ａ ｅ ｏ ｔ ｓ　 ｒ ｅ　ｅ ｆ　 ｔｎ ｏ　 ｃ ｒ ｔ ｒｓ　ｎ　 ａｙ　 ａ ｈ　ｔｎｆ ｍｎ ＰＡ Ｐ　 ｅ　 ｐ ｎ ． ｈ ｅ ｂｅ ｎｔ　ｒ ｅｒ ｏ ｒ ｓ ｒｉ ａ Ｆ ｇｎ ｉｏ　 ｔ ｅ ＇ ｅ ｏ ｎ ｅ ｃ ｎ　 ｏ ｇ　 ｓ ａ ｅ ｎ ｌｓ ｔ ａＴｂ ｃ ｉ ｍ ｄ ｌ ｔ　ｉｏ ｃ ｒ ｅ ｃ．　 ｅ　 　 ａｖ ａ ｓ　 ｈ ｕｉ ｔｎ　ｏ ｃ ， 　　　　ａ　 ｅｐ ｎｉｂ ｌ ｉｌ　ａ ｈＴｅ ａ ｓ ｅ　ａｔ ｅｆ ｔ ｃｌ ａｏ ｏｔ ａ ｏ ｏａ ｏ　 ｏ ｌ　 ｎ　 ｇ ａｅ ｒ ｈｒ ｒ ｏ ｄ ｎ ｇ ｏ ｅ　 ｖ ｉ ｆ　 ｃ ｃ ｓ　 ａ ｏ ｓ ｅ ｍ ｒ　 ｔ ｂｓｃ ａｒ ｉｇ ｗｈ　 ｅ ｙ　 ｅ ｃｌｃｌ ａｏ．　 ＰＡ Ｐ　 Ａ　 ｅ　 ｅｔｃ ｄ　 ｔ ｌ ｖｓ　 ｕｈ　ａ ｄ　 ｔａｄ　 ｌｇ－ ａ ｕｉ ｔｎＴ ｅ　 Ｆ ｃ Ｎ ｇｎ ｗ ｓ　ａ ｅ ｆ ｍ　 ｅ ｅｏ ｓ　 ｒ ｐ ｏ ｎ ａ ａ ｓ ｅ　 ｖ ｉ ｈ ａ ｓ ｒ ｔ Ｄ ｅ ａｘ ｔ ｒ ｈ ａ ｆ ｒ ｏ ｅ　Ｐｙ ｌ ｃ ａ ｅｃｎ Ｌ　ｄ　 ｏ ｎ ｅ ｒｓ ｎ　 ｔ ｐ Ａ ＢＡ ３０ ａＦ ｃｎ ｉｎ ｔ ＰＡ Ｐ ｈｔａ ａ　 ｒａａ　 ａ ａ　ａｉ ｘｅ ｉ ｖ ｏ Ｃ Ｍ Ｉ１ － Ａ Ｐ　 ｔｎ ｇ　 ａ Ｆ ｏｃ ｍ ｉ ｎ ｂｔ ｃ　 ｓｏ ｅ ｒ　 ｐ ｃ ０Ｐ ｏ ａｉ ｈ ｅ　ｃ Ｎ ｇｎ ｗｓ　 ｓｕｔ ，　 ｔ ｒ ｏ ｂ ａｔ　 ｍｄ　ｓ　 ｓ ｒ ｅ ｉｏ　ａ ｏ　Ａ ｔ 咖ｃ ｎ Ｄ Ａ　 ｅ　 ｃｎｔｃ ｄｔ ｎ　 ｅ ｍ ｉ ｎｐ ｓ ｉｗ ｔｎｆ ｍ ｄ　 ｔ ｃ ｂ ．　 ｉ ｓ ｅ ａ ｏ ｒ ｅ ｈ ｈ ｃ ｎ ｌ ｅ ｅ　 ａ ａｒ ｏ ａ ｎ ｏ ｃ ｙ　 ｕ ｔ ｂ ｎ ｒ ｅ Ｌ Ａ ４４Ｔ ｎ ｅｉｐ ｎ ｗ ｒｒ ｅｅ ｔ ｗｔｔｓｅ　ｕ ｔ ｈｏ ｇ ａｐ ａ ．　 ｇｎｍ Ｄ Ａ　ｓ Ｂ ４０．　 ｓ ｎ ｌ ｔ ｅ ｅ ｎｒｅ ｉ ｉｕ ｃｌｒ　 ｎｌ ｙ　ｒ ｃ Ｔ ｅ　ｏ ｅ　 ｗ ｒ ｇ ｃ　 ｓ　ｅ　 ａ ｄ　ｈ　 ｕ ｅ ｅ ｏ ｐｏ ｈ ｈ ｅ ａ ａ ｇ ｓ ｔ ｃ Ｎ ａ ｅｔｃ ｄ　 ｔｎｆｍ ｄ　ａ ｏ　 ｅ Ｉ ａｐ ｖｄ　ｔ　 Ｆ ｃ Ｎ ｇｎ ｈｓ　ｎ　 ｇａ ｄ　 ｔ ｘ ａｅ ｆ ｍ　 ｓ ｒｅ ｔ ｃ ｌ ｖｓ ｔ　 ｒ ｅ ｔ ＰＡ Ｐ　 Ａ　 ｅ　 ｂｅ ｉｅｒｅ ｉｏ　 ｒｔ ｒ ｒ ｏ ｏ ａ ｏ ｃ ｅ ．　 ｓ　 ｂ ａ ｗ ｏ ｈ ａ ａ Ｄ ｅ ａ ｅ ｎ ｔ ｎ ｈ ｔ ｔ ｅ ｔ ａ ｏ　 ｏ ｅ　 Ｐ Ｒ Ｐ ＲＳｕ ｅ 　ｏ ｉ ａａ ｓ．　 ｗ ｏ Ｒ Ａ　ｔｃ ｄ　ｍ　ｅ　ｖｓ　 ｏ ｃ ｇｎｍ ｂ Ｃ ，　 － ｔ ｒ ｂ ｔ ｇ　 ｌ ｉ Ｔｅ　 ｌ Ｎ ｅｒ ｔ ｆ ｔ ｌ ｅ ｏ ｂｃ ｅ ｙ　 Ｃ ｏ ｈｎ ｌｔ ｎ ｙ ｓ ｈ ｈ ｅ　 ｎ ｘａ ｅ ｒ ｈ ｅ ｏ ａ ｆｒ ｓ ｎ ｌ ｔａｄ　 Ｔ　 ｒｕｓ　ｆｍ ｄ　 ｔ ａＦ ｃ Ｎ ｇｎ ｗｓ　ｓ ｉｅ ｎ ｍ Ａ ｔｎ ｅｉｐ ｎ ，　ｔ Ｒ Ｐ Ｒ　 ｌ ｃｎｒｅ ｔ ｔ　ＰＡ Ｐ　 Ａ　 ｅ　 ｔｎ ｒｔ ｉｏ　Ｎ ． ａ ｇ ｃ　 ｓ ｎ ｈ ａ ｅ　 Ｃ ｅ ｔ ｏ ｉ ｓ ｈ ｈ ａ ｅ　 Ｄ ｅ ａｒ ｃｐ ｄ　 Ｒ ａ ｔ Ｓｌ ｌｐ ｔｎｗｒｉｌｅ ｆｍ　 ｌｖｓ　ｈ ｐ ｎ ａｄ　ｒ ｕ ｏＴｉ ｒｉ － Ｓ Ａ Ｅ　ｗｄ ｏ ｂ ｒｅ ｓ　ｅ　ａｄ　 ｔ ｅ ｅｏ ｔ ｌ ｔ ｎ ｔ ｅ ｌ ｆ　－ ｉｎ Ｓ － Ｇ ｓ ｅ ｕ ｅ　 ｉ ｅ ｓ ｔ ｒ ｈ ａ ｆ　 ａ ｓ　 ｈ ｓ ｔ　ｒ Ｔ ｃ ｅ Ｄ Ｐ ｏ ｏ ｏ ｅ　 ｅ　 ｅ　 ｓ ｈ ｏ ｔ ｓ ｅ　ｅ ｌ ｗｉ ｔ　ｅ ａＰＡ Ｐ　ｈ ｔｎ ｅｉｔ ａ ｏｎｔ　ｏ－ａ ｇｎ ｔ ａ ｏＯ ｔ ｈ ａ ｍ ｌ ｕ ｒ　 ｈｐ ｔｎ　 ａＦ ｉｔ ｒ ｓ ｎ ｏ ｃ ，　ｉｎｎｒ ｓ ｉ ｏ ｃ ．　 ｈ ｅ　 ｏ ｃ ａ ｅ ｒ ｉ ｓ　 ｍ ｇ ｏ ｎ　 ａ ｇ ｃ　 ｃ ｏ ｎ　 ｔｎ ｅ ｃ　 ｃ ｎ　 ｅ　 ｂ ｂ ｅ ｗ ｏ ，　ｖａｄ　 ｔ ＰＡ Ｐ　 Ａ　 ｅ　 ｂｅ ｔｎ ａｄ　 ｔ ｐ ｔｎｂｔ　ａ ｎｔ　 ｉｔ　 ｈｌ ｉ ｅ ｌ ｔ ｔ　 ａＦ ｃＮ ｇｎ ｈｓ　ｎ　 ｓｔ ｉｏ　 ｒｅ ，　 ｅ　 　 ｓ 　 ｉ ｅ ｔ　 ｅ ｈ ｈ ｒｅ ａ ｅ　 Ｄ ｅ ａ ｅ ｒ ｌｅ ｎ ｈ ｏ ｉ ｕｗ ｒ ｏ ｕ ｆ　 ａ ｔ ｅ　 ｅ ｅ ｒ ｉｓＰＡ Ｐ　ｅ　 ｃｏ ａ ａ ｉ ｉ ｔ ｔ ｔ　ｓ　ＰＡ Ｐ　 ｓ ｎ ｔ ａｃ ｐ ｎ ｅｈ ｉ ｇ　ｉａｃ　 ａ Ｆ Ｔ ｉｅｔｎ　 ｙ　 ｃ ｅ ｈ ｐｒ ｏ ａ Ｆ ｔｎ ｅｉ ｏ ｃｏ　 ｔ ｘｉｔ ｒ ｓｎ ｔ ｈ ｎ ｉ ｓ ｎ ａ ｄ　 ａ ｆ　 ｆ ｓ ｄ ａ ｔ ｒ ｇ ｃ　 ａ ｂ ｌ ｓ　 ｂｉ ｅ ｔ ｅ ｏ ａ ｎ ｓｆ ｇｌ　ｏｅ Ｒｉ ｃｎ ｓｌ ｉ ｈｓ ｔｎ ｅｉｔ ａ ｏ　 ｔｓ ｗｄ　 ｔ　 ｈｅ　ｔｉｔ ｉｏ ｕ ａｐｔ ｇ ｈｏ ｏｉ ｏ ｎ Ｔｅ ｒ ｓ ｎ ｏ ｃ ｐ ｎ ｈ ｅ ａ　ｏｗ ｉ ｓ ｓ　ｈ ｒ　 ｎ ａ ｎ　ｚ ｔ ａ　 ．　 ｅ　 ｇ ｃ　 ｃ ｌ ｓ　 ｈ ａ ａ ｂ ａ ｏ ｌ ｆ　ｔ ｐ ｎ　 ｌ ｏ ｏ ｅ ｄｌａ ｅ ． ｅｖ ｓＫｙ　ｄＰＡＰｏａｏ ｇ ｂｃ ｒｍ　 ｅｃｎ ａｔｕｇｌ ｈ ｏｔ ｉｓ ａｉ ｈｅ　ｔ ｅｗｒ：　 ，　 ｃＡ ｒ ａｔｉ ｔ ｆ ｉｓ ｎｆ ａＲ ｉ ｃ ｎ ｏ ｎ ｗ ｉ ｓ ｏ ａＦ ｔ ｃ ， ｏ ｅｕ ｕ ａｅ ，　 ｎ ，　 ｏ ａ　 ，　 ｐ ｂ ｍ ｉ ｚ ｌ ｔ ｏ
第二部分 材料和方法３ 试验材料 ．３ 植物材料 ． １ 美 洲商陆： Ｈｔａ ａ　ｒａ Ｌ ｎ 中国 ｐｙ ｌｃａｅｃ ａ　 ， 科学院 物研究 ｏｃ ｍ ｉｎ ｉ ｎ 植 所提供 烟草： ｉ ｔｎ ｔ ａ ｍ　ｓ ｎｎ　 本实验室培养 Ｎｃ ｉ ａ　 ｃ Ｗｉｏｓ ３， ｏａ ａ ｕ ｂ ｃ ｉ８ ３ 菌种和质粒 ． ２３ ．菌种 ．１ ２Ｔ ｂｅ ：　ａｎ ｉｖ ｌｅ ｉ ｔｅ　 ｒ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ａ ｌｌ Ｓｒｉｓ　 ｏｖ ｄ　 ｈ ｗｏｋ ｔ ｎ ｎ　表 １菌种 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　菌株Ｅ ｃ ｌＤＨ－ａ ．ｏｉ　 ５Ｅ．ｏ ｉ　 ０ ｃ ｌ ＨＢ１ １基因型来源ｄｏ ｐ ａ，　Ｅ ４ｈｄ ７ｒ ４ ， 　　，　 Ａ Ｓｐ ４，　 １，　 １ ｅＰ Ｈ ｕ ｓＲ ｅ ｅ 本实验室 　　 ｅｄ ，　 ９，　 ｒＡ 　　　　　　 ｉ ，　１ ｎＡｇｒ ６ｔ－ ｅ ｙ Ａ ｈ１ ｌ ｓ Ｅ ４ ｄ２，　 １，　 １，　 ２ｌ Ｙ， 中国科学院植 ｕ ４汤ｓＳ０ｒ Ａ ３ａ － ｐａ ，　 ｌ ｐ ｅ ｃ ｒ ４ｒ ａ ａ Ａ ｃ 物研究所 　　 ｇＩ２ｒ Ｌ０ｘｌ ｍｌ，　 ，　 　　 ，　 ２，　 ，　１ ｅ ６ｔ－ ａ ｐ Ｋ ｓ ｙ ５ ｔ ＩＢ ｈ １ － － ｕ ｉ本实验室 ＲｆＫ ｎ Ｓ ｀ 　　　　　　　　　　　　 　　 ｉ ａ｀ ｍ ，　 ，　 四川农业大学 玉米研究所Ａｔ ｅ ｃ ｎ ｕ ｆ ｉｓ ｍ ａｅＲ ｉｏ ｔｎａ　 ｌｎ ｈ ｚ ｃｏ ｉ ｓ ａ ｉ ｏＡ －Ｉ Ｇ１Ａ －３ ．质粒 ．２ ２表 ２质粒Ｔ ｂｅ ：　 ｓ ｄ ｉｖ ｌｅ ｉ ｔｅ　 ｒ ａ ｌ２ Ｐａｍｉｓ　 ｏｖ ｄ　 ｈ ｗｏｋ ｌ ｎ ｎ　质粒名称大小〔 ｋ ｂ３０ ５ ．１用途 克隆载体抗性标记ｐ Ｅ Ｔ　 ｙ Ｇ Ｍ－ ｅｓ ａ ｐ Ａ Ｉ ３０Ｕ ｉ Ｃ ＭＢＡ１０－ ｂ呵 Ｋａｎｒ Ｋａｎｒ来源 Ｐｏ ａａ ｒｍ ｇ 公司 　　１． １２含Ｕ ｉ ｂ启动子的表达载体含完整 ＰＡ Ｐ前体蛋白 ａＦ ｃＮ Ｄ Ａ基因的表达载体王昌涛博 士构建 本文作者 构建 　　ｐ Ａ Ｉ ３０Ｐ Ａ Ｐ　 １． Ｃ ＭＢＡ１０ －ａ Ｆ 　　　　　 １ ４３ 酶和生化试剂 ． ３ 表 ３酶和生化试剂 　　　　　　Ｔｂ ３ Ｒ ａｅｔｕｅ ｉｔ ｗ ｒ ａｌ ：　ｇｎ ｓｄ　ｈ ｏｋ ｅ ｅ ｓ　 ｎ　 ｅ　名称 Ｔ Ｄ Ａ 连接酶 ４　 Ｎ 来源 备注普洛麦格（ ） 北京 生物技术有限 公司鼎国生物技术发展中心 　　　　 大连宝生物（ａａａ 　　　　 ＴＫＲ） 公司Ｔｑ　 ａＤ Ａ聚 Ｎ 合酶限制性内切酶 　　Ｄ Ａ分子 Ｎ 标准标记物Ｐ Ｒ引物合成 　　　　 Ｃ Ｄ Ａ回收及纯化试剂盒 ＮＤＧ　 ｈ　 Ｄ 　　Ｈｇ Ｐｉｅ　Ａ Ｉ ｉ ｒ ｍ Ｎ Ｌｂｌｇ　 Ｄ ｔ ｔｎ ａｅｎ ａｄ　 ｅ ｉ ｉ ｎ ｅ ｃｏＳａｔ ＫｉＩ 　　　　　　　　 ｔｒ ｒ　ｔ　 ｅ鼎国生物技术发展中心 　　　　 上海生工生物工程公司 　　　　大连宝生物（ ａａ 　　　　 ＴＫＲ） ａ 公司 ｓ Ｈｍ ｉｉｃ ｏ 尼 膜＋ｙ ｎ － 龙 （ ｂ ｄ Ｎ Ａ ｅｈｍ　ａ ａａ　ｅｈ Ｈ ｏ ＇ ） ｍ ｒ ａ ｐ ｒ ｃ ｂ ｔ 公司 Ｒｃｅ　 ｌｄ　 ｎｅ ｏｈＡ ｐｅＳｉ ｃ公司 ｐｉ ｃ ｅ 普洛麦格（ 生物技术有限公司 北京）华美生物技术有限公司，欣经科生 物技术有限公司，天为时代生物技 术有限公司 　　　　　　　　　　　　 分析纯Ｒ Ｐ Ｒ试剂盒 　　　　 Ｔ　 Ｃ其他生化试剂 其他无机药品３ 抗生素和生长激素 ． ４表 ４抗生素和生长激素 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　名称Ｔｂ ４Ａ ｔｉｉ ａｄ　ｗｈ　ｍ ｎ ｕｅ ｎ　 ｏ 　　　　　　　　　　　　　　　　ｓ ｉｔ ｗ ｒ ａｌ ：　ｂ ｔｓ　 ｇ ｔｈｒ ｏｅ　ｄ　ｈ ｅ　 ｎ ｏｃ ｎ ｒ ｉ ｏ ｏ ｅ　 ｋ 储藏浓度 工作浓度英文名称 缩写ｔ 以 Ｕ 七 ａ Ｖ 甘 ｇ ｎ ）氨节青霉素 狡节青霉素 卡那霉素 潮霉素 　　 ６ － 氨基喋吟 蔡乙酸 　　３ 仪器 ． ５Ａ ｐ ｉｉ ｍ ｉｌｎ ｃｌＫ ｎｍｙｉ ａａ ｃ ｎ５０ ５０ ５０ ５０ ０．５ ０．５５ 　　 ０ １０ 　　 ０ ５ 　　 ０ ５－５ － １６ ｅｚｌ ｉ ｕｉ 　　ｎｙ ｍｎｐｒ ｅ － Ｂ ａ ｏ ｎ Ｎ ｐ ｔ ｌ ｅ　ｔ ａｉ ａＨｈ ｅ ａｅｃ　ｄ ａｎ ｃ ｉ ｃ表５ ：仪器６ ＢＡ －ＮＡ Ａ０５ ２ ．－０５ ２ ．－Ｔｂ ５Ａ ｐｒｕ ｕｅ ｉｔ ｗ ｒ ａｌ ：　 ａ ｔｓ　ｄ　ｈ ｏ ｅ　 ｐ ａ ｓ ｎ　 ｅ　 ｋ名称 Ｐ Ｒ仪 　　　　 Ｃ 型号及公司 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　紫外分光光度计 低温离心机 　　 电泳仪 　　　　 紫外凝胶成像仪匀浆机Ｇ ｎ ｏ ｐｎ Ｌｍｔ Ｐ －０ 　　 Ｃ ｍ ａｙ　 ｉｄ　Ｃ２０ ｅｅ　 ｉ ｅ Ｔ Ｂ ｃｍ ｎ　 ６０　 ｃ ｏＨ ｔ ｅ ｒ ｅｋ ａ Ｄ ４ Ｓｅｔ ｐ ｏ ｍ ｔ Ｕ　 ｐ ｒ ｏ ｅ Ｂｃ ａＡ ａｔ ０　 ｔｆ ｅ 　　ｍ ｎ　 ｎ ３ Ｃｎ ｉ ｇ ｅｋ ｖ ｉ　 ｅ ｒｕ Ｂｏ ａ 公司 　　　　　　　　　　 ｉ－ ｄ Ｒ Ｂｏ ａ 公司 　　　　　　　　　　 ｉ－ ｄ Ｒ 不详３ 引物 ． ‘Ｐ Ｆ 前体蛋白 第一外显子引 （ 物１ 物２ 　　　　 ａＰ Ａ 基因 物： 引 ，引 ）Ｕ ｐｒ　 ｒ　 ＇　 Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ　 　　　　 ｅ ５Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ ３ ｐｅＰｉ 　 ｒ ｍ Ａ ＇　 １ｍｅ 　 ８ ｒＬ ｗｅ Ｐ ｉ 　 ＇　 Ａ Ａ ＡＧＴＣ 　　　　　　 ｒ　 ３ ＣＧＣ ＴＴ Ｔ ｏ ｒ　 ｍｅ ｒ ＧＡＣＧＣ　　　　 ７ ｒ ５ ＇　 １ ｍｅＰＡ Ｐ ａＦ 前体蛋白 第二外显子引 （ 物３ 引 ） 基因 物： 引 ， 物４Ｕ ｐｒ　 ｅ ５Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ ３ ｐｅＰｉ ｒ　 ＇　 Ｃ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ　 １ｍ ｒ ｒ 　 ｍ Ｃ ＇　 ８ ｅ 　　　Ｌ ｗｅ Ｐｉ ｒ　 ３ １ －ＧＧＣ Ｔ Ｃ Ｃ ｏ ｒ　ｍｅ　 ＇　 １　 ＧＡ ｒ － １ Ｔ ＧＡＧＣ ５ Ａ　 ＇　 １ ｍｅ ８ ｒＰＡ Ｐ ａＦ 前体蛋白 基因ｃＮ 物： 引 ，引 Ｄ Ａ引 （ 物５ 物旬Ｕ ｐｒ　 ｒ　５ ０ ０ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ ＇ ｐｅＰｉ 　 ＇ ０ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ３ ｒ ｍｅ ＧＬ ｗｅ Ｐｉ ｒ　 ＹＡＣＧ　 Ｔ１ ＧＧＣＧＡ ＣＴＣＧＡＧＧＣ　 ｏ ｒ　 ｍｅ　 ｒ ｒ １ ＂ １ Ｔ ５ ＇ ２ ｍｅ ３ ｒ２ ｍｅ ３ ｒ４ 实验方法 ．４ 培养基 ． １４ ．原 物培养 伍奥斯伯等， ０１ ．１ 核生 １ 基 ２０ ）表６原核生物培养基 　　　　　　　　Ｔｂ ６Ｃ ｍ ｏｅｔｏ Ｌ ａｄ　Ｂ　 ｄ ａｌ ：　 ｐｎｎ ｆ　 ｎ Ｙ ｍ ｉ ｅ　 ｏ ｓ　 Ｂ　 Ｅ ｅ ａ培养基 Ｌ Ｂ培养基 Ｙ Ｂ培养基 Ｅ胰蛋白陈 １０ ５成分（Ｌ １） １ 酵母提取物 ＮＣ ａ ｌ 蔗糖Ｍ Ｓ ４ 牛肉膏 ｇＯｐ Ｈ１ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ０　 ７０ ． ５　 　　　　　　　　　　　　 　　　 ０２ 　　　　 　　　　　　 ．４　 ５　 ７２ ．（ 在９ ｍ 离 水中 解各 分， ａＨ调 Ｈ至 值， 容 １ ０Ｌ １ ５ Ｌ去 子 溶 成 用ＮＯ 节ｐ 规定 定 至 ０ ｍ ， ） ０ ０１３ １ 　　ｘ护帕高压蒸汽下灭菌 １ 分钟。 ．４ ０ ５ （ 添加１ ％ ２ ） ． 琼脂可配成固体培养基。 ５（ 液 培 基 抗生 需 却 加 固 培 基 菌 至 能 摸的 度 ５０ ３ 体 养 加 素， 冷 后 入； 体 养 在灭 冷却 手 触 温 （ Ｃ ） ０左右） 　　 加入抗生素并混匀。 ４ ．真菌培养基的配制 ．２ １表７ 铃薯培养基 　　　　 ：马Ｔ Ｏ：　 ｐｎｎｓ　 Ｄ ｍ ｄ Ｗ Ｃ ｍ ｏｅｔｏ Ｐ Ａ　 ｉ ｏ ｆ　 ｅ ａ培养基类别马 铃薯成分（Ｌ Ｆ） ／ 蔗糖 或葡 ） 琼脂 （ 萄糖１ ２ ５ ０ｐ Ｈ将 铃 去 ， ０ ， 成 ｃ３ 小 放 ５ ｍ 的 烧 煮 ０ｉ 马 薯 皮 取２ ｇ 切 约２ 的 块， 入１ ０１ 大 杯中 沸３ ｎ ０ ｍ ０ ｍ，注意 璃棒搅拌， 层纱 用玻 双 布过滤， 滤液加 定容至 １ ０ １ １３ｘ护帕高 糖， ０ ｍ．　 ４１ ０ ． ０ 压蒸汽下灭菌 巧 分钟。４． ．３烟草培养基的配制 １表 ８ ＭＳ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ：　 培养基母液配制 Ｔｂ ８Ｃ ｍ ｏｅｔｏＭＳ　ｄ ｍ　 ｃ ｓｌｉ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ａｌ ：　 ｐｎｎ ｆ　 ｍ ｉ ｓ ｋ　ｕｏ ｅ ｏ ｓ　 ｅ ｕ ｔ ｏ ｔｎ ｏ母液 大 量兀成 分规 量 扩 倍 件 量 （ ｔ）　配３） 量 定 大 数 （取 ４ 　　　　　吸 １　 ｒ取 ｆ （ ）　 　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍ　 ｍｇ　　　　　　　　　　　　　　 ｍｇ ）　 ， （ ＭＫ Ｏ 　　　　 Ｎ ３　 １０ 　　　　　　　　　　　　　　 ９ ０　 １０ ０ ９０ Ｎ ４ ０ 　　　　　　 　　Ｎ ３　 １５ 　　　　　　　　　　　　　　 Ｈ ６０　 １５ ０ ６０ＩＭｇＯ． ２　　　０　 （ ｘ Ｓ ４ Ｈ０　 ３ 　　　　 ）　 ３０　　　０　　　　０ ７ ７ １ 　　　　 ０　 １ ０　 １ ０ ７ ０ ０Ｋ ２Ｏ 　　　　　　　 　　Ｐ ４　 Ｈ １０　 ７　　　　　　　　　　　　　　 １０ ７０ Ｃ Ｃ２ Ｈ ０　 ４ ０　 ａ １２ ２ 　　　 ４　　　　　　　　　　　　　　 － ４０ ４０ ＭＩ Ｏ ． ２ 　 ２ ． Ｉ ４ Ｈ ０　 ２ 　　　　　　　　　　　　　　 Ｓ ４ ３　 ２３ ２０ Ｚ Ｓ ４ １ ０　 ８ 　　　　　　　　　　　　　　 ｎ ０ ． １ 　　 ． ７２ ６　 ８０ ６ Ｈ １ 　　　　　　　 　　 ３　 ３０ ３ ６ 　　　　　　　　　　　　　　 ． ２　 ６０ ２素微 Ｉ 量 Ｉ兀Ｋ　　　　　　 　　　　 ０ ３　 （ ０）　 Ｉ　 ． 　　　　ｘ ８ １ 　　　８　　　　０　 ０ ３　 １０　　　　　 ０ １ ０Ｎ ２ ４　 ０ ５　 　　 Ｏ 　　　　　 ａ Ｍｏ ． 　　　　　　　　　　　　　　 ２ ２ ５ Ｃ Ｓ ４ Ｈ ０　 ０ ２　　　　　　　　　　　　　　 ｕ Ｏ－ ２　 ５ ． ５　 ０ ２ ． ５ Ｃ Ｃ２ Ｈ ０　 ０ ２　　　　　　　　　　　　　　 Ｏ １６ ２　 ． ． ５　 ０ ２ ． ５素Ｉ Ｉ铁盐ＦＥ２ ３ （） 粼 １ １ ＮＤ　　　　　 ｅ－　　 １ ＳＴ ２ ０ ａＨ ７ ０ ＯＡ　． ｘ ２ ０　　　　　 ０ ０ ４ ４ ３　 ８ ０ ０　 　　　　　甘氨酸 　　 盐酸毗哆素 ２ 　　　　　　　　　　　　　　 ． ０　 １０ ０ ０ 　　　　　　　　　　　　　　 ． ５　 ２ ５Ｗ有 机 物盐 硫 酸 胺素烟酸 　　 肌醇 　　０　　　　　　　　　 １ ０　 １ ． １　 （ ｘ ５ ）　 ５ ０ 　　　　　 ０ 　　　　　 ０ ００ 　　　　　　　　　　　　　　 ． ５　 ２ ５ １０　 ０　　　　　　　　　　　　　　 ５０ ００（ Ｍ 基本培养 １ Ｓ ）　 基的配 取母液Ｉ　ｍ ， 液Ｉ Ｉ，　 ｌ Ｌ 蔗 ３ｇ 琼 制： １ Ｌ 母 Ｉ Ｉ Ｎ各 Ｏ ， 糖 ０， 脂 ０ ０ 、 ｍｌ 溶 ０ Ｌ 离 水中 用ＮＯ 调 Ｈ ． 右， 容 ０ ｍ ，　 ｘ 　　于８ ｍ 去 子 ， ａＨ 节ｐ 至５ 左 定 至１ ０Ｌ１３ １ ｏ ｇ ０ ８ ０ ．４ 护 ０帕高 　　　　 压蒸汽下灭菌 巧分钟。（ 筛 Ｔ 、 化 Ｔ） 生 娜 ） 养 配制： ２ 选（ 分 （ 及 根 培 基的 ） Ｏ ２Ｔ ：　 固 　　 Ｓ 体培养 ＋－ （５ ｇ ） Ａ （ ｇ ） ｌＭ 基＋ Ｂ ０ ｍ ／ ＋ Ａ２ （ ６Ａ ． Ｌ Ｎ ｍ ＬＴ ：　 体培养基＋ ｙ（ ｍ ／ ＋ ｂ ０ｍ ／ ＋－ （ ｇ ）Ｎ Ａ　 ｍ ／ 　　Ｍ 固 ２ Ｓ Ｈ ｇ ０ ｇ ）Ｃ（ ０ ｇ ）６ Ａ２ ／ ＋　 （５ ｇ ） ２ Ｌ ５ Ｌ Ｂ ｍＬ Ａ ０ Ｌ ．”： 固 　　 Ｓ 体培养 Ｈｇ ０ ｇ ） ｂ ０ｍ ／ Ｍ 基＋ｙ（ ｍ ／＋ （ ０ ｇ ） ８ Ｌ Ｃ５ Ｌ 备注： 铁９的配制是称 ５７ ＦＳ４Ｈ０和 ７５ ＮＺ Ｔ ．ｇ　 Ｏ． ２ ５ ｅ ７ ．８　 Ｅ Ａ分别加热溶解，再将 ４ ａＤＦＳ ４Ｈ０缓缓注入ＮＺＤ Ａ中， ｅＯ． ２ ７ ａ Ｔ Ｅ 煮沸５ 分钟， 冷却后定容至１， Ｌ 配制培养基时 ｍ 取５ ｌ即可。４ ＰＡ Ｐ前体蛋白基因 ｃ Ｎ ． ａＦ ２　 Ｄ Ａ的获得４ ．商陆 Ｎ 提取（ ．１ 总Ｄ Ａ的 （ ２ Ｊ ． 萨姆布鲁克等， ０ ；　 ２０ Ｆ ２ 奥斯伯等， ０１ ２ ） ０１试剂：１ ６２ ＣＴ ｘ ＡＢＣＴ ＡＢ２（ ％ ＷＭｌｏ ｏ ｍｍｏ凡 ｌ １４ 　　 ｌ ．ｍｏ／ ＬＴ ｓ ｉ ＨＣＩ ｒ－Ｎａ ＣｌＰ ＶＰ１（ ） 　　 Ｖ ％ Ｗ／２步骤：（ 在离 管中 ＯＬ　 ＴＢ ０ Ｌ １ ） 心 加ｌ ２ＣＡ 和４０ 疏基乙 ６℃ 浴 ｍ ｘ ｕ ， 醇， ０ 水 预热， 适 美 商陆 取 量 洲 叶片， 　　　　 液氮研磨至粉末状， 用灭菌的不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中， 总体积达 １ Ｌ ｍ，混匀后置 ５ 　　　　６℃水浴中保温 ４－０ ｉ，并轻轻转动试管。 ５６ｍｎ（ 加入 ２ ） 等体积氯仿 屏戊醇（ ／溶液， ２１ ４） 轻轻地 颠倒混 静置５ ０ 匀， － 分钟， １ 分离水 相和有机相。 　　　　（ 室温， ２　ｒ ， 心１分钟。 ３ ） １ＯＯ ｍ 离 ０ Ｏｐ （ 幻加入２ 积的１ ％ 醇或０ 倍体积的 醇， 现絮状沉淀， 倍体 ０ 乙 ０ ． ７ 异丙 出 冰上放置１ ｉ－ － ０ ｎ２Ｃ ｍ （０ 放置３ ｍｎ 一 放置１ ｉ， 温， ２　ｒ ， 　　 ０　 或 ８℃ ｉ ０ Ｏ ｎ 室 １ＯＯ ｍ 离心１－ ｍｎ 收Ｄ Ａ沉淀。 ｍ） Ｏｐ ０ ５ｉ １ ，回 Ｎ （ 用７％ 醇 ５ ０ 乙 清洗沉 ） 淀两次， 超净台 吹 中 干后溶于 适量的 灭菌ｄＨ０ Ｅ ｄ２ 或Ｔ 缓冲液中。 （ 取２Ｌ　Ａ样品， ． ６ ，Ｄ ） ｕ Ｎ ０ ％琼脂糖凝胶电 检 Ｎ 子的 ８ 泳， 测Ｄ Ａ分 完整性。 时 ， 稀 同 取５Ｌ ｕ释６ 倍， 　　　　测定Ｏ ２／Ｄ８ 检测Ｄ Ａ含量及质量。 ０ Ｄ６Ｏ ２， ０ ０ Ｎ［ 意ｌ ｔ ｉ ａ有时Ｄ Ａ中含有酚和多糖类呈褐色，会影响酶切和 Ｐ Ｒ效果。 Ｎ Ｃ 所以 需要检测 Ｄ Ａ产 Ｎ量和质量。 　　ｂ　 Ｂ溶液 １℃以下会产生沉淀，所以含ＣＡ ＣＡ ｆ ５ ＴＢ的溶液必需预热且不能低温离心。ｃ使用冻存材料不能 直接研磨， 冻存粉末应在化冻前取用， 避免内 源性Ｄ ａ 降 Ｎｓ 解基因组 ｅＤＮＡ． 　　４ ．ＰＡ Ｐ ．２　 Ｆ 前体蛋白 ２ ａ 基因的扩增利用 ＰＡ 前体蛋白基因全长引物， 　　　　 Ｐ ａＦ 以美洲商陆基因组Ｄ Ａ为模板扩增 ＰＡ Ｐ Ｎ ａ Ｆ 前体 蛋白全长基因。（ 按如下反 １ ） 应体系 加样： 依次ｄＨ 　　　　　　　　　　 ｄ刃 １ 如ＬｌｘＣ 　　　　　　　　 ＯＰ Ｒ反应缓冲液 ＺＬ ｕ ｄ Ｔ 　（Ｏ Ｍ）　 　　　　　　　　 Ｎ Ｐ　ｌｍ 　　　　　　　　　　　　 ０＃ ．Ｌ ５ 上游引物 （ 物５　　　　　　　　 　　　　　　　　 引 ）　 ０ｕ ．Ｌ ５ 下游引物 （ 　　　　　　　　 引物６ ）　 　　　　　　　　 ０ｕ ．Ｌ ５ 商陆基因组Ｄ Ａ　 　　　　　　　　 Ｎ 　　　　　　　　　　　　　　 ＺＬ ｕ 总体积 　　　　　　　　 １． Ｌ ９ｕ ５混匀， 　　　　 快速离心。 预变性５ ｉ 加入Ｔｑ　Ａ　ｙ ｅ ｓ０ 。 ｍｎ ， ａＤ Ｐｌ ｒｅ　 最终反应体系２ Ｌ Ｎ ｏｍ ａ ． 和Ｌ ０ ａ ｕ ，Ｃ （ 按照下列参数进行 Ｐ Ｒ扩增： ２ ）９０ 　　　　　　　　　　 ４Ｃ ５ ｎ ｍｉ｝ ９０ 　　　　　　　　 ４Ｃ 勺 」 ５０ 　　　　　　　　　　 ７Ｃ －、Ｏ〕 ｓ７０ 　　　　　　　　　　 ２Ｃ ７０ 　　　　　　　　ｎ ２Ｃ ｌ ｍｉ 　　　　 ｏ黑 ３ｃ Ｊ０ｌ ｃｓ ｙ； ｅ（ 扩增完毕， ｌｕ 进行电 ３ ） 取 ０Ｌ ， 泳分析 ４ ．琼脂糖凝胶的制备 ．３ ２（ 取ＳｘＡ 缓冲液２ｍ 加水至１ ０ Ｌ 配制 ｘＡ 稀释缓冲液， １ ＯＴ Ｅ ） ０Ｌ ０ ｍ ， 成１ Ｅ ０ Ｔ 待用。（ 胶液的 备： ｇ ２ ） 制 称ｌ琼脂糖， ０ｍ １ Ａ 稀 取１ Ｌ　 Ｅ 释缓冲液， 熔化， ０ Ｘ Ｔ 加热 摇匀， 制成１％ 　　　　 琼脂糖凝胶液。口 胶板的 ） 制备： 封好玻 璃胶板， 把冷却至５－ ℃的 脂糖凝胶液倒 ００ 琼 ６ 进胶板 模具， 形成均匀的胶层。 　　　　） ’ （ 加样： 在样品 加入和Ｌ　ｋ ，　 扩增 依次 孔中 Ｍ ｒｒ１ Ｌ 产物与２Ｌ　 ａｎｂｆｒ ａｅ Ｏ ｕ ， ６ｌｄ ｇ　ｅ混匀物。 ｕ ｘ ｉ ｕ ｏ（ 电 ５ 泳：电 －Ｖｃ ，电 ０ Ａ 待样品 ） 压５６／ － ｍ 流４ｍ 。 标记泳 到凝胶２ 处， 动 ／ ３ 停止电 泳。（ 观察：电 完毕 ６ ） 泳 后将凝 胶移入Ｅ （Ｓｇ 助 液， ＢＯ，／ 溶 染色２－ 分钟后， ． ｍ ｕ ０５ ２ 在紫外灯下波长为 ２４ 　　　　 ｍ观察 Ｄ Ａ． ５ｎ Ｎ（ 乃根据Ｍ ｒ ｒ ａ ｅ估算目 片段的 ｋ 的 分子量。４ ．目 ．４ 的片段回收 ２ ４ ．１从琼脂搪凝胶中回收Ｄ Ａ片段： ．４ ２． Ｎ（ 从琼脂 １ ） 糖凝胶 上切下 所需Ｄ Ａ片 放在１ｍ Ｅｐ ｄｒ Ｎ 段， ． Ｌ　 ｅ ｏ 管中。 ５ ｐｎ ｆ 准确加入３ 积 倍体的溶胶液，室温下放置５ 分钟或５℃保温 １ 分钟，轻摇至胶完全溶化。 ０ ０（ 加入１ Ｌ 璃奶佣前混 ） 摇匀， 浴１分钟 隔２ 分钟摇匀一次 。 ２　ｒ ２ ） ０ 玻 Ａ 匀， 冰 ０ （ － ３ ） １ ＯＯ ｍ Ｏｐ离心３ 秒，弃上清． ０（ 加２ ｕ 漂 液使 前 浓 液： 水乙 ＝：　 制 ， 匀 １ Ｏ ｒ 心３ ３ ５ Ｌ 洗 （用 按 缩 无 醇 ３ ７ ） 混 ， ２　 ｐ ） ０ 配 Ｏ ｍ离 ０ Ｏ秒，弃上清。 　　　　（ 重复步 ， 漂洗液再离 １秒钟， ４ ） 骤３ 弃去 心 ０ 将漂洗 液吸取 干净。 沉淀在３℃ 至白 ７ 干燥 色。 （ 沉淀加适量 ５ ） 洗脱液， 混匀， ０ 水 分钟， ２　ｒ 心 １ ６℃ 浴５ １ＯＯ ｍ离 Ｏｐ 分钟。 步 ， 重复 骤５ 提高回收率。 　　　　４ ．２ ．４ 回收Ｄ Ａ小片段（ ０ｐ以下） ２． Ｎ （ ｂ １ ０利用回收 Ｎ 　　　　Ｄ Ａ片段试剂盒。１ ８４ ． 的片段与Ｔ载体连接 ．５目 ２ （ 按如下反应体系进行连接： １ ）２　 ａｉＬｇｔ ｎ　 ｆｅ Ｘ　ｐ ｉ ｉ ｂ ｒ Ｒ ｄ　 ａｏ ｕ卒Ｌｐ Ｅ －Ｅｓ Ｇ Ｍ Ｔ　 ｙ ａ Ｐ Ｒ　 ｄｃ Ｃ ｐ ｕｔ ｒ ｏ 琴Ｔ Ｄ Ａ　ａｅ ４　 ｌ ｓ Ｎ ｉ ｇ扭Ｌ Ｌ功Ｌ总体积 　　　　　　　　１ｕ ０Ｌ ，（ １℃反应 １ｈ 上或４ 过夜。 ２６ ）　 ６以 ℃ ４． ．６　 ２ Ｔ载体转化大肠杆菌４． 大 杆 Ｈ５感受 胞的 备（ 姆 鲁 等， ０２ ． ． 肠 菌Ｄ － ２１ ６ ａ 态细 制 （ 布 克 ２ ） Ｊ ． 萨 ０具体的操作步骤如下：（ 挑取活化的Ｅｃ ｉ　５ 单菌 接种于３ ｍ Ｌ 液体培养基中， ７ 振荡 １ ） ．　 Ｄ － ｏ Ｈ ａ 落， ｌ － Ｌ　 ５ Ｂ ３℃ 培养１ ２小时， 　　　　 至对数生长期。 将菌悬液以 １ ０－５ 的比例接种于 １０ Ｌ　 ： ０１ ０ １ ： ０ｍ Ｌ Ｂ培养液中， ７ ３０ Ｃ振荡培养 ２ 　　　　 －小时至 Ｏ ６　 ０ 左右。 ３ Ｄ ＝． ｗ ５（ 将 养液 入５ Ｌ 心 冰 ０ 钟 ４ ，　 ０离 ０ ２ 培 转 ０ 离 管， 浴１分 后， ０ ５０ 心１分钟。 ） ｍ Ｃ ０ｇ （ 弃 清， 预 ３ 上 用 冷的Ｏｍｌ 的ＣＣ２ ） ． ｏＬ ａＬ 溶液１ Ｌ 轻 浮 ｌ ／ Ｏ 轻 悬 沉淀， ０ ５　 离 ０ ｍ ４ ，　 Ｏ 心１ Ｃ　Ｏ ｇ Ｏ分钟。 　　　　（ 弃去上 加４ Ｌ 叼 清， ｍ 预冷的Ｏ ｍ ｌ 的ＣＣ 溶液， ． ｏＬ ａ１ ｌ ／ ２ 轻轻悬 冰上放置几分钟， 成 浮， 即感受态细胞悬液。 　　　　（ 在感受 ５ ） 态细胞 ２０Ｕ ） 加入１ 甘油， ７０ （ ， 份 中， ０ ｕ ５ ％ 一 ０ ｒ存半 Ｃ 年至一年。４ ．２蓝白 ．６ ２． 筛选平板的 制备（ 在 抗菌 预制 脂 （ ） 央 加４ Ｌ　 －ｌ ｕ ２ 的Ｉ Ｇ １ 含有 素的 琼 板 Ｌ 中 滴 ０ ２ Ｘｇ 和７Ｌ　 Ｐ ． ） Ｂ ｋ ％ ａ ０ ％ Ｔ（ 用无菌的 器分散Ｘｇ 溶液， ７ 温育至液 ２ ） 涂布 －ｌ ａ ３℃ 体消失。 ４． ．６ ２． ３质粒对 大肠杆菌的 热击转化 （ Ｊ － 萨姆布 等， ０ ） 鲁克 ２０ ２ （ 取２ ， 感受 １ ０ Ｌ 态细胞悬液， 冰上解冻。 ） ０ 置 （ 加入连接 咭量小于５ ｇ １ｕ） 轻轻摇匀， ２ ） 产物 ０ ，　Ｌ， ｎ ０ 冰上放置３分钟。 ０归 ４℃ ）２ 水浴热激９ 秒或３℃ ０ ７ 水浴５ 分钟后迅速 冰浴３ 分 － 钟。 ５） ’ （ 加入１Ｌ　液体培养基 无抗生 ） 混匀， ７ 振荡１ ｍＬ Ｂ （ 素， ３℃ 小时， 恢复正常增殖， 细菌 可表达质粒编码的抗性基因。 　　　　（ 取上述菌液１ ， ５ ） ０Ｓ ０Ｌ涂于蓝白 平板上， 朝上放置半小时 筛选 正面 后倒置培养皿， ７ 培 ３℃养 １－４ 　　　　 ２２ 小时。１ 　　　　　　　　 ９（ 取筛选平板于４ 放置数小时， ６ ） ℃ 使蓝色充分显色。做两组对照： 　　　　对照组 １ ：以等量无菌双蒸水代替连接产物，操作同上。对照组２ 等量无菌 ：以 双蒸水 连接产物， 代替 取知Ｌ 菌液涂布于 无抗生素的Ｌ 平 Ｂ 板。４．质粒的 ．７ ２ 提取伍奥斯伯等， ０１ ２ ） ０碱裂解法提取质粒 　　　　（ 将一定 含抗生素 因 １ ） 量的 （ 质粒而定， 浓度见表４ Ｂ液体培养 ） 的Ｌ 基加入无菌 试管， 接入 单菌 挑 　　　　 色单菌落 ， ７ 振荡过 落（ 取白 ） ３０ Ｃ 夜。（ 大肠杆菌菌液与甘油适量混和均匀，一 ℃保存。 ２ ） ０ ５口 取１ｍ 培养 ） ． Ｌ 物放入 ５ 离心管， －，　０ｇ 离心１ 钟， 培养液， 细菌沉淀 ４ １ ０， Ｃ ２ ０ 分 去除 使 干燥。 　　　　（ 重复 ２ － 遍。 ４ ） （１２ ） （ 将细菌 重悬于１ ， 预冷的 ５ ） 沉淀 ０Ｌ ０ ｕ 溶液Ｉ 剧烈振荡。 中，溶液 １ 　　　　　　　　　　　　５ｍ ｏ 葡萄糖 　　　　　　　　 ０ｍ 呱 ２ｍ ｏＬ　 － （ ８ ） 　　　　　　　　 ． ５ ｍ Ｖ Ｔ ｓ ｌＨ ０ ｒ Ｃｐ ｉ１ｍ ｏＬ　Ｔ （ ８ 　　　　　　　　 ） ０ ｍ ｌ Ｅ Ａｐ ． ／ Ｄ Ｈ０溶液 Ｉ ． ５ １４ａ 　　　　６ ９ｘ０Ｐ 下蒸气灭菌 １ 分钟，４ 在 ８ ５ Ｃ贮存。（ 加２０Ｌ ６ ０ｕ 新配制的溶液Ｉ ） ， Ｉ溶液 Ｉ 　　　　　　　　　　　　　　 Ｉ０２ ｌ Ｎ Ｏ 　　　　　　　　　　 ． ／ ａＨ ｍｏ Ｌ　１ ＤＳ 　　　　　　　　　　 ％Ｓ口 手摇混匀， ） 冰浴３５ － 分钟， － 可见离心 管盖和管内 现“ 丝连” 现象。 会出 藕断 的 （ 加１ ， 用冰预 溶 ｕ ８ ５Ｌ ） ０ ｕ 冷的 液ｌ溶液Ｉ 　　　　　　　　　　　　 Ｉ５ ｏ Ｌ乙酸钾 ６ｍ 　　　　　　　　 Ｌ ｍｌ ／　 ０ 冰乙酸 　　　　　　　　ｍ １． Ｌ １ ５ 水 　　　　　　　　５ Ｌ ２． ８ｍ盖紧管口，倒置振荡 １ 秒钟，溶液ｍ与细菌裂解物充分混合，冰浴 ５７ 　　 ０ － 分钟，出现白色絮状沉淀。 ℃ 　　 ４ 离心， ２０ｇ ５ 种， １ ０＞　 ０ 分 将上清转移到另一离心 管中。 （ 加等量酚： （ ９ ） 氯仿 大约４０功， ０ｕ 振荡混匀， ℃ ， ４ 离心１ ０ｇ　 ２ ０２ ０ 分钟， 上清转移到 另一离心管中。 ２ 　　 用 倍体积的无水乙醇于一２℃沉淀双链 Ｄ Ａ ０ Ｎ 。振荡混合，于一２℃放置 １ ０ ０分钟。 ０ １ Ｏｇ　 离心１ 分钟。 　　 ４ ，　ＯＯＸ， Ｃ　２　 ０２ ０（） １ 弃去上清液，除净附于管壁的 ０ 液滴。 １ ｌ０ 乙醇于４ 用 ｍ ７％ ℃洗涤双链Ｄ Ａ沉淀， Ｎ 在超净台上干燥核酸沉淀。 　　　　（ ） 适量无Ｄ ａ 的 Ｎｓ（，／Ｌ的Ｔ 重新溶 １用 １ Ｎｓ 胰Ｒ ａ ２ｕｍ ） Ｅ 。 ｅ　 ｇ ０ 解核酸， ２℃ 存。 － ０ 储 琼脂糖电 泳检测。 　　　　４ ．质粒 ＰＡ Ｐ前体蛋白全长基因连接的Ｐ Ｒ鉴定 ．８ ２ ａＦ Ｃ（ 按如下反应体系依次加样： １ ）ｄＨ ０ ｄ２ｌｘＣ ＯＰ Ｒ反应缓冲液ｄ Ｔ 　 （Ｏ Ｎ Ｐ　 ｌ ｍＭ　 ）上游引物 〔 ５ 引物 ） 下游引 （ 物 引物６ ）质粒１／ ４Ｌ ｉ 知Ｌ 　　 ０， ．Ｌ ５ ｕ ０， ．Ｌ ５ ｕ ０， ．Ｌ ５ ｕ弄 　　 比Ｔｑ　Ａ　ｌ ｅ ｓ ａＤ Ｐ ｙ ｒｅ Ｎ ｏｍ ａ总体积 　　　　　　　　０ ． 和Ｌ２ 助Ｌ混匀，快速离心。 　　　　（ 按照下列参数进行Ｐ Ｒ扩增 ２ ） Ｃ９０ ４Ｃ ９０ ４Ｃ ５０ ７Ｃ ７０ ２Ｃ ７０ ２Ｃ５ ｎ ｍｉ（扩 ３ 增完毕， ０Ｌ ） 取１ 反应产 泳 Ｕ 物电 检测。４ ．质粒Ｐ Ａ Ｐ ．， ２ ａ Ｆ 前体蛋白 全长基因连接的酶切检测（ 按如下反应体系进行酶切： １ ）ｄＨ２ 　　　　　　　　　　 ｄ ０１ Ｘ　ａｔ ｎ　ｆ ｒ 　　　　　　　　　　　　 ０　 ｃ ｏ ｂ ｆ ｅ ｒ ｉ ｕｅＢＳ 　　　　　　　　　　　　 Ａ琳 秘 啦 １０ｇｈ产 井 － 加 月Ｄ Ａ　ｍ ｌ 　　　　　　　　　　 Ｎ Ｓ ｐ ａ ｅＢｍ Ｉ 　　　　　　　　　　　　 ａ Ｈ　Ｓ ｃ　 　　　　　　　　　　　　 ａ ＩＬ Ｌ － 几总反应体积（ ３℃ 温４， ０Ｌ 应产物电 ２ ７ 保 ｈ 取１ 反 ）　 ｕ ， 泳检测。４ ． ＰＡ Ｐ ．１ ａＦ 前体蛋白 ２ ０　 全长基因的测序鉴定测序由宝生物工程有限公司完成。 　　　　４ ． 第一外显子Ｐ Ｒ扩增及回收 ．１ ２１ Ｃ（ １ ）按如下反应体系依次加样：ｄ ＨＯ ｄＺ３， ５Ｌ ｕｌｘＣ ＯＰ Ｒ反应缓冲液ｄ Ｔ 　 （Ｏ Ｎ Ｐ　 ＩｍＭ ）助 儿 乃 和 ２５ 和　Ｌ 　 　Ｌ 　 Ｌ上游引物 （ 引物 １ ）下游引物 （ ２ 引物 ） 连有 ＰＡ Ｐ ａ Ｆ 基因片段的Ｔ载体乃 和 勿 蛇 ２５ 劝ＬＴｑ　Ａ　ｌ ｅ ｓ ａＤ Ｐ ｙ ｒｅ Ｎ ｏｍ ａ总反应体积 　　　　　　　　５， ０Ｌ ｕ（ 按下列参数进行Ｐ Ｒ ２ ） Ｃ 扩增：９ ０　　　Ｓ ｎ 　　　　　　　　 ４Ｃ　 ｍｉ ９ ＇　　　３ ｓ 、 　　　　　　　　 ４Ｃ　 ０４０ 　　　　　　 冲Ｏｙｌ ； ９ 　　　０ Ｃ　 ３ｓ ｃｃ ｓ ｅ７０ 　　　　　　　　 ２ 　　　 ５ Ｃ　 １ｓ７ ０　　　１ ｍｉ 　　　　　　　　 ２Ｃ　 Ｏ ｎ（ 扩增产物， １ ％ ３ ） 用 ． 琼脂糖电 ３ 泳检测。（回 ４ 收第一 ） 外显子： ． ．的 按４ ． 方法回 Ｎ ２２ ４ 收Ｄ Ａ小片段。４ ． 第二外显子Ｐ Ｒ扩增及回收： ．１ ２２ Ｃ（ 按如下反应体系依次加样： １ ）ｄＨ ０ 　　　　　　 ｄ２３， ５Ｌ ｕｌｘＣ 　　　　 ＯＰ Ｒ反应缓冲液ｄ Ｔ 　（ Ｏ 　　　　　　Ｍ ） Ｎ Ｐ　 ＩＭ、份 呼啊 恙 一５０ｇｈ上游引物 引物 ） 　　　　 （ ３ 下游引物 引 ） 　　　　〔 物４ 连有ＰＡ 基因片段的Ｔ 　　　　Ｐ ａＦ 载体Ｔｑ　 Ａ　 ｙ ｒ ｅ 　　　　Ｐｌ ｅ ｓ ａＤ Ｎ ｏｍ ａ总反应体积（ 匀按下列参数进行Ｐ Ｒ Ｃ 扩增：９ ０　　　 ５ ｎ 　　　　　　　　 ４Ｃ　 ｍｉ９ １　　　３ ｓ 、 　　　　　　　　 ４Ｃ　 ０５｀ 　　　　　　　　 ｙｌ ； ０ 　　　０ ｝０ ｃ ｓ Ｃ　 ３ｓ　 ｃ ｅ ３７ ０　　　 ２ ｓ 　　　　　　　　　　 ２Ｃ　 ０７ ０　　 １ ｍｉ 　　　　　　　　 ２　 Ｃ　 Ｏ ｎ（ 扩增产 用 １％ 糖电 ３ ） 物， ． 琼脂 泳。 ３Ｎ ） ’ （ 回收 二外显子： ． ．的 法从普通琼 第 按４ ．１ 方 ２ ４ 脂糖凝 回收Ｄ Ａ片段。 胶中４ ． 单酶切第一外显子： ．１ ２３（ 按如 应体系依次 样： １ ） 下反 加ｄ Ｈ２ ｄ ０１ Ｘ　ａ ｔ ｎ　 ｆ ｒ ０　 ｅ ｃｉ ｂ ｅ ｒ ｏ ｕＢＳ Ａ１． １ 印Ｌ弧 啊 ２０ｐｅ竺 ４ＤｒｔＦ ｓｅｏ Ｄ Ａ　 ｐ ｉｔ　ｎ　 ｓ ｌ ｒ ｘ Ｎ ａ ｅ ｍＡｌ Ｉ ｕ　总反应体积（ ３℃ ２ ７ 保温６ ）　 小时。 ． 琼 １％ 脂糖凝胶电 ２ 泳。（ 回 ３ 收第一 子酶切片 按４ ． 的 ） 外显 段： ． ． 方法回 Ｎ 片段。 ２２ ４ 收Ｄ Ａ小４ ． 单酶切第二外显子及回收： ．１ ２４（ 按如下方应体系依次加样： １ ）ｄＨ ０ 　　　　　　　　　　 ｄｚ１ Ｘ　ａ ｔ ｎ　 ｆ ｒ 　　　　　　　　　　 ０　 ｃｉ ｂ ｆ ｅ ｒ ｏ ｕｅＢＳ 　　　　　　　　　　 Ａ１． １ 印Ｌ 如Ｌ ０ ． 匆ＬＳｃｎ ｅｏ Ｄ Ａ　 ｐ 　　　　　　　　ｍ ｌ ｅｏｄ　ｎ　 Ｓ ｅ ｘ Ｎ ａＰ ｕ　 　　　　　　　　　　 ｖＩ Ｉ总反应体积（ ３℃ 温６ 时。 ． 琼 糖凝 泳。 ２ ７ 保 小 １％ 脂 胶电 ）　 ２（ 回 ３ 收第二 ） 外显子酶切片 段：按４ ． 的方 ． ． 法回收Ｄ Ａ小片段。 ２２ ３ Ｎ４ ． 连接第一外显子和第二外显子酶切片段及回收： ．１ ２５ （ 按如下反应体系依次加样 １ ）ｄＨ刃 　　　　　　　　 ｄ１ Ｘ　 ｆ ｒ 　　　　　　　　　　 ０　 ｕ ｅ ｂ１ ． 和ＬＦ ｓｅｏ ｓ ｍ ｎ 　　　　　　　　 ｉｔ　ｎ　 ｅｔ ｒ ｘ ｅ ｇ Ｓｃｎ ｅｏ ｓｇ ｅ 　　　　　　　　 ｔ ｅｏｄ　 ｎ　ｍ ｎ ｘ ｅ Ｔ Ｄ Ａ　ａｅ 　　　　　　　　 ４　 ｌ ｓ Ｎ ｉ ｇ总反应体系２， ．Ｌ ５ ｕ １， ０Ｌ ｕ１ Ｌ 伽（ １℃ ２ ６ 连接１ 小时。 所获产 ） ６ 连接 物为ＰＡＰ 体蛋白 的ｃＮ ａＦ 前 基因 Ｄ Ａ片段。（ 产物 ３ ） 利用Ｔ ａａ 试剂 ａ Ｒ 公司 盒直接回 连接片 Ｋ 收 段。４． Ｐ Ｒ扩 ．１ Ｃ 增连接片 ＰＡ Ｐ ２６　 段（ Ｆ 前体蛋白 ａ 基因的ｃＮ Ｄ Ａ片助 ：（ 按如下反应体系依次加样： １ ）ｄＨ ０ ｄ２ｌｘＣ ＯＰ Ｒ反应缓冲液ｄ Ｔ 　 （Ｏ Ｎ Ｐ　 Ｉ ｍＭ ）上游引物 （ 引物 ５ ）３ｕ ５Ｌ ５Ｌ 　　 ｕ １ 和Ｌ ． ２ １ ５Ｌ ．ｕ ２ １ ５Ｌ ．ｕ ２ ５Ｌ 　　 ｕ １ ５Ｌ ．ｕ ２５ｕ ０Ｌ下游引物 （ ６ 引物 ）Ｄ Ａ片段 ＮＴｑ　 Ａ　ｌ ｅ ｓ ａＤ Ｐ ｙ ｒｅ Ｎ ｏｍ ａ总反应体积 　　　　　　　　Ｃ （按下夕参数进仃 Ｐ Ｒ扩增 ： ２ ） Ｊｍ ｍ ９０ 　　　　　　　　 ４Ｃ ３０ ９０ 　　　　　　　　 ４Ｃ５０ 　　　　　　　　 ７Ｃ ７０ 　　　　　　　　 ２Ｃ ７０ 　　　　　　　　ｎ ２Ｃ １ ｍｉ 　　　　 ０３０ ３０． 琼脂糖电泳检测。 ０ （扩增产物，１ ％ ３ ）） ’ （ 回收Ｄ Ａ片段：按４ ．１ Ｎ ．４ 的方法从普通琼脂糖凝胶中回收Ｄ Ａ片段。 ２． Ｎ４ ． －．１ 连接 Ｔ载体，转化大肠杆菌，提取质粒方法同４ ． ．７ ．１ －２ ， ２ ７４ ． ．５４ ． ２ ２ ４ ． ＰＡ Ｔ前体蛋白基因 ｃ Ｎ ．２ ａ Ｆ ２ ０　 Ｄ Ａ片段的 Ｐ Ｒ检测 Ｃ（ 按如下反应体系依次加样： １ ）ｄＨ ０ ｄ２１ｕ ４Ｌｌ Ｐ Ｒ反应缓冲液 Ｏ Ｃ ｘｄ Ｐ　 １ ｍＭ ） ＮＴ 　 （ Ｏ上游引物 （ 引物 １ ）下游引 （ 物 引物２ ）质粒２Ｌ 　　 ， ｕ ０ｕ ．Ｌ ５ ０ｕ ．Ｌ ５ ０ｕ ．Ｌ ５ ２１ 　　 ｕ．Ｔｑ　 Ａ　ｌ ｅ ｓ ａＤ Ｐ ｙ ｒ ｅ Ｎ ｏｍ ａ总体积０， ．Ｌ ５ ｕ２， ０Ｌ ｕ混匀，快速离心。（ 按照下列参数进行Ｐ Ｒ扩增： ２ ） Ｃ９０ ４Ｃ ９＇ ４Ｃ ５０ ７Ｃ） 飞 ） 飞５ ｎ ｍｉ一勺０５ ０５ 伪７＂ ２Ｃ ７０ ２Ｃ１ ｍｉ ０ ｎ（ 扩增完毕， １Ｃ进行琼脂糖电 ３ ） 取 ０Ｌ ， 泳检测， 分析结 果。４ ． －．２ＰＡ Ｐ ．２ ４ ． ａ Ｆ 前体蛋白 ２ １ ２２ 基因ｃ Ｎ Ｄ Ａ片段的酶切鉴定，ａ Ｆ 前体蛋白 ＰＡ Ｐ 基因ｃＮ Ｄ Ａ片段的测序检测方法同 ４ ． ４ ． ０ 　　　　 ．９ ．１ ２－ ２ ０４ 表达载体ｐ Ａ ＢＡ ３０ ａ Ｆ 的构建 ． ３ Ｃ Ｍ Ｉ１０－ Ａ Ｐ Ｐ ４ ．提取连有ＰＡ Ｐ ．１ ３ ａ Ｆ 前体蛋白 基因ｃＮ Ｄ Ａ片段的Ｔ载体质粒及ｐＡ ＢＡ３ －ｂ质粒， Ｃ Ｍ Ｉ１ ０ ｉ ０Ｕ 用 Ｓｃ　 ｍ １ 　　　　 ａ Ｈ　 ａ Ｉ　 ／ Ｂ 双酶切两种质粒，回收ＰＡ Ｐ　Ｎ ａ Ｆ ｃ Ａ片段和 ｐＡ Ｂ １ ０ ｂ质 Ｄ ＣＭ Ｉ ３ － ｉ Ａ ０Ｕ粒大片段。方法同４ ．和 ４ ．１ 　　　　 ．， ．４ ． ２ ２．４ ．连接 ＰＡ Ｐ前体蛋白 ．２ ３ ａＦ 基因 ｃＮ Ｄ Ａ片段和ｐ Ａ Ｉ１ ０ ｂ载体： Ｃ ＭＢＡ ３ － ｉ ０Ｕ（ 按 １ 如下反 ） 应体系 加 依次 样：ｄＨ ０ 　　　　　　　　　　 ｄ２ １ Ｘ　ｆ ｒ 　　　　　　　　　　 ０　 ｕ ｅ ｂＰＡ Ｐ前体蛋白基因ｃ Ｎ ａＦ Ｄ Ａ片段ｐＡ Ｂ １ ０ ｂ质粒大片段 ＣＭ Ｉ ３ － ｉ Ａ ０ＵＴ Ｄ Ａ　ａｅ ４　 ｌ ｓ Ｎ ｉ ｇ－ ．纳 群群Ｌ Ｌ 一 无总反应体系（ １０ ２ ６　 １ 小时。 ）　 温育 ６ Ｃ４ ．重组质粒转化大肠杆菌 ．３ ３４ ．１大肠杆菌Ｄ ５ 电 ３３ ． Ｈ ａ 击感受态细胞的制备：（ 取菌 平板（ 培 １ ） 种划 Ｉ 养基， ． Ｂ 无抗生素 ， ７ 温育１ 小时。 ） ３℃ ６ （ 挑取单菌落于 ５ １ Ｂ液体培养基中，３０振荡培养过夜，时间 １ ２ ） ｍＳ Ｏ ７ Ｃ ０小时以下， －５ ｐ 　　　　 ｒ ． 巧０２０ ｍ口 取 ０ｍ（ 中培养菌液至 １ ｍＳ Ｂ液体培养基中，３℃振荡培养 ２ ） ． １） ５ ２ ０ １ ０ Ｏ ７ ． ５小时，２０２０ ｍ 　　　　 ，至Ｏ ３－５ｒ ｐ Ｄ值为０ ． ． ８） ’ 浴１ ｎ 将菌 分 进２ ０ 灭 离心 ４ ４０ｐ 心１ ｎ （ 冰 ５ ｉ后， 液 装 个５ １ 菌 管， ｒ，　０ ｍ离 ０ｉ ｍ ｍ － ０ｒ ｍ．（弃 ５ 上清， 心管 ） 离 倒置于 无菌滤纸上。（ 每 加２１ 冷１ 灭 甘 混 转 到 个 管中 ４　０ ｒ 离 ｏｉ ６ 管 ｍ预 ０ 菌 油， 匀， 移 另一 离心 ，Ｃ　 ０ｍ 心ｌ ｎ ） ％ ０４ ｐ ，　 ０ ｍａ （ 弃 清， 加 ｍ 预 ０ 甘油， 匀。 去 清， 回 剩 甘 与 体 合 ７ 上 再 入３１ 冷１ ） ％ 混 倒 上 将 流 余的 油 菌 混后，分装， 　　　　 每管２ Ｌ － ℃ ０ 。８ 保存． ｕ ， ０ ４ ．２质粒对大肠杆菌的电 ．３ ３． 击转化方法： （ 预冷所有电 １ ） 击器皿。（ 冰 化大 杆菌 受 胞。 ０Ｌ －．Ｌ 连 物混 后， 入电 杯 ２ 上融 肠 感 态细 取２ 与１１， 的 接产 合 加 击 槽 ） ｕ ， ５ ｕ中包括阳 　　　　 照和阴 （ 性对 性对照 。 ）（ 按照电 压： ５Ｖ 电 ２Ｏ 容： （ ， 抗 ３ ） 击电 ３０ ， 阻： ｋ ，电 ３ 枷Ｆ 低阻 等参数。 启动电 击仪， 注意观察是否发生弧光放电。 　　　　２ 　　　　　　　　　 ５） ’ （ 脉冲结 取出电 杯， １１ 液体培养基 束， 击 用 ｍＬ Ｂ 洗脱， 液体转移至 １ｍ 离心管。 ７ ．１ ５ ３０ Ｃ温育１ 　　　　 小时，１ ｒ ． ０ｐ ０ｍ（ 将菌 涂布于含Ｋｎ ０１ ｌ Ｂ ５ ） 液 ａ（ ，ｍ） ５ ／ 的Ｌ 培养基上， ７ 培养 ｕ ３０ 过夜。 Ｃ４ ．重组质粒 ｐ Ａ Ｉ１０－ Ａ Ｐ ．４ ３ Ｃ ＭＢＡ ３０ ａ Ｆ 的检测方法同４ ． －．２０ Ｐ ．２ ４ ． ２ ０ ２２ ４ ． ４转化烟草 ４ ．三亲杂交法将质粒转化入根癌农杆菌 ．１ ４（ 接种受体农杆菌Ｌ Ａ ４４ １ ） Ｂ ４０ 在含有利福 １ ，ｍ） Ｅ 培 平（ ０Ｕ １ ０ Ｕ 的Ｙ Ｂ 养基上， ８ 培养， ２℃ 挑选一个单菌落接种在液体培养基中，２℃振荡培养。 　　　　 ８（接 ２ 种含有“ 助” ） 协 质粒的 肠杆菌Ｈ １１ 体Ｌ 养基上， ７ 培养， 大 Ｂ０ 在固 Ｂ培 ３℃ 挑选一个单菌落接种在液体培养基中， ７ 振荡培养。 　　　　 ３１ Ｃ（ 挑 有目 基因 ３ 选带 的 质粒的 ） 大肠杆菌的 单菌落在含 有卡那 霉素（＃ｍ） 液体Ｌ 培 ５ １ｌ ０／ 的 Ｂ 养基中３０ 　　　　 ７ 振荡培养。 Ｃ（ 三种菌 长到Ｏ ６为０ 左右时， ４ ） 生 Ｄｏ ． ｏ ５ 等体积混匀， 涂布于不 何抗生素的Ｙ Ｂ固 含任 Ｅ 体培养基上，２℃过夜培养。 　　　　 ８（ 用 种 将长出 菌 转 含 福 （ ０／ｌ 卡 素５ １ １ 体Ｙ Ｂ ５ 接 针 ） 的 落 接到 有利 平 １ ，ｍ） 那霉 （＃ｍ） ０１ 和 Ｕ ０／ 的固 Ｅ 培养基上，２℃培养 ３４ 　　　　 ８ － 天，长出单菌落。（ 将 的 菌 再 转 含 利福 （ ０／ｌ 那 （ｐｍ） Ｅ 固 培 ６ 长出 单 落 次 移到 有 平 １ Ｕｍ） ） ０ １ 和卡 霉素５ ｌ ｌ Ｂ 体 养 ０／ 的Ｙ基上，２ 　　　　Ｃ培养。 ８（ ＰＲ 酶切检 乃 Ｃ， 测方法同４ ．－．２ ．２ ４ ． ２０ ２ １４ ．农杆菌介导对烟草的 ．２ ４ 遗传转化（ 叶盘法）４ ． 烟草无菌苗的 ．． ４１ ２ 培养 （ 取 １ 烟草种子 ） 适量， 菌的ｄＨ０ 用灭 ｄ２浸泡１ ２ 分 ０ ０ 钟或更长的时间。 － （ 用无水乙 迅 ２ ） 醇 速冲洗一 而后 ｄ２测 遍。 遍， 用ｄＨ０ 洗２（ 用１％ ３ ） ０ 的次氯 钠浸泡１－。 酸 ５３ 分钟， 蒸 无菌 馏水洗五 遍。 ） ’ （ 用ｌｌ 移 ｍ 的 液器吸 ０３粒左右的 种子喷 取２－０ 烟草 洒在培 养基上 平皿 ， 培养基 （ ）借助 上方的水将种子均匀分布。 　　　　价 ２℃ 养２３ 然后转移到光 暗 ）５ 培 －天， ／ 周期为１８ 的 ６ 小时 光照培养箱中 ／ 培养， 长至６７ －片真叶时备用。 　　　　４ ．２ ．． ４ 根癌农杆菌的 ２ 培养 （ 从农杆 １ ） 菌储存 （０ ２％ ） 量菌 液（ 度， ０ 甘油 取少 液在相 － ８ 应抗生素的平 板上划线， ８ 避光 ２０ Ｃ２ ６培养长出 ｍ 　　　　 ｌ ｍ大小的菌落，大约需要 ３ ６小时。（ 取单菌 ２ ） 落转接于 １ ｌＥ Ｏ Ｙ Ｂ液体培养基中，含有相应抗生素， ｍ （ 建议使用 １ ｍ 三角 ０ １ ０瓶） Ｃ ２帅 　　＇，　 ｍ震荡 ２ ８ ２ 培养过夜， 大约需要１ 小时。 ７ 然后按１５ 的 ：　 接种量转接于Ｙ Ｂ ０ Ｅ 液体培 　　 养基中， 继续震荡４ 小时， － ８ 摇至Ｏ Ｄ值约０ ．． ５０ｒ ， ． ０ ，　０ ｍ 低温离心１ 分 ４ ６ ０ ｐ ０钟，用等体积的 １ Ｍ 培养基重新悬浮沉淀，用于转化。 　　　　 ／ Ｓ ２ ４ ．３ ．２ 叶盘法转化烟草 ４．（将 １ 无菌烟草叶 剪成ｌ ） 片 ｃ ｍ见方， 在菌液中 浸泡１ 分钟． 叶片 － ３ 取出 用无菌滤 干。 纸吸转入 Ｔ 培养基中于 ２ ℃暗培养 ２３ 　　　　 ｌ ５ － 天。（ 将叶 入Ｔ 培养基， ５　１８ 光 Ｒ周期培 每两周转一次培 ２ ） 盘转 ２ ２Ｉ，　 小时 ／ Ｃ ６ ／ 养， 养基， ５２ １ ０ －天即可观察叶片边缘长出愈伤组织或丛生芽，一个月左右芽长至 １ ｃ ． 　　　　 －ｍ ２归 将长出的 ２３ｍ芽切下转入 ７ 培养基中，两周后开始生根，待幼苗长出 ） －ｃ ３ 根系后， 将幼苗转至温室培养。 　　　　Ｔ培 ｌ 养基： ｓ 体培养 ＋－ （５ ｇ ， Ｎ Ａ２　Ｌ ｍ 固 基＋ Ｂ ０ｍ ／ 十 Ａ （ｍ ／ ６Ａ ． １ ） ｇ） Ｔ 培养基： Ｍ 固 培养基 ｋ （ ｍ （ ＋ｂ ０ｍ ／＋－ （ ｇ ）Ｎ Ａ（ ｍ Ｌ ２ Ｓ 体 ＋ａ ８ ｇ ，Ｃ（ ０ ｇ ） Ｂ ２ ／ ＋　 ｖ ．　 ） ｎ０ １ ５ ） Ｌ ６ Ａ ｍＬ Ａ ０ ｇ ５ ／ ” 培养基： Ｓ 体培养 ｋ （ ｍ ／＋ｂ ０ｍ ／ Ｍ 固 基＋ａ ８ ｇ ） （ ０ ｇ ） ｎ０ Ｌ Ｃ ５ Ｌ４ ．４ ．２ 烟草的移栽 ４． （ 将烟草从培养瓶中取出， １ ） 用水洗净培养基。（ 移栽 ２ ） 入营养土中 营 （ 养土： ＝：　 用塑 蛙石＝ １ １ ） ， 料膜盖住， 光或者暗 避强 培养２１天， －０ 然后转入光下培养。 　　　　４ 转基因植株外源基因转化情况的监测 ． ５４ ．转 植 ．１ 基因 株的Ｐ Ｒ检测 Ｊ 姆布鲁克 ２０） ５ Ｃ （萨 ． 等， ０２分别以 　　 非转基因植株和转基因植株基因组Ｄ Ａ以 Ｎ 及载体质粒Ｄ Ａ为模板， Ｎ 进行Ｐ Ｒ Ｃ扩增反应 。（ 依次 下列试剂 １ ） 加入ｄＨ０　 　　　　　　　　 ｄ ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 １ｕ ４Ｌ ，ｌ ＰＲ反 冲液 　　　　　　　　 Ｏ Ｃ 应缓 ｘ２Ｌ ， ｕｄ Ｔ　（Ｏ Ｍ）　 　　　　　　　　 Ｎ Ｐ　ｌｍ 　　　　　　　　　　　　 ０， ．Ｌ ５ ｕ上游引 （ 物５ 　　　　　　　　 物 引 ）　 　　　　　　　　 ０， ．Ｌ ５ ｕ 下 物 （ 物６ 　　　　　　　　 游引 引 ）　 　　　　　　　　 ０， ．Ｌ ５ ｕ模板Ｄ Ａ 　　　　　　　　 Ｎ总反应体积 　　　　劫Ｌ１． １ ９＃ ５混 匀 ，快速 禺心 。预变性５ ｉ 加人Ｔｑ　 Ｐｌ ｅ ｓ０ ｕ 。 ｍｎ ， ａ Ｄ Ａ　ｙ ｒｅ　 Ｌ 最终反应体系２ Ｌ Ｎ ｏｍ ａ ． ５ ０ ｏ ｕ ，２ 　　　　　　　　 ７（ 按照下列参数进行Ｐ Ｒ扩增： ２ ） Ｃ９０ ４Ｃ ９０ ４Ｃ ５０ ７Ｃ ７１ ２Ｃ７＇ ２Ｃ（ 扩增完毕， １ Ｌ ３ ） 取 ０ 反应物进行电 ｕ ， 泳分析。４ ．转基因 ． ５ ２ 植株的Ｐ ＲＳｕ ｅ 检测（萨姆布鲁克等， ０２ Ｃ － ｔｒ ｏｈｎ （ Ｊ ． ２０） ＰＲ电 束后， Ｃ 泳结 将凝胶 进行Ｓｕ ｅ 迹杂 （萨姆布鲁克 ２０） ｏｔ ｍ印 交。Ｊ ｈ ． 等， ０２４ ．１凝胶 ．． ５ ２ 变性滋变性淘碱变份 转移缓冲液： 　　　　Ｎａ ＣｌＮａ ＯＨ１ Ｕ ｍａ Ｌ加入碱变性了 　　　　 转移缓冲液至胶完全浸没，摇床轻轻摇动 １ｍｎ ５ｉ ，弃去变性液，再加新的 碱变性准 移缓冲液，处理２ｍｎ ０ｉ ｏ４． Ｓｕ ｅ 印 （ 姆 鲁 等， ０ ；　 斯 等， ０１ ． ． ｏｔｒ 迹Ｊ 布 克 ２ ２ Ｆ 伯 ２ ） ５ ２　 ｈ ２ ｎ ． 萨 ０ 奥 ０１ ． 试剂：灭菌超纯水 碱变性麟 移缓冲液：Ｎａ Ｃｌ Ｎａ ＯＨｌ ｌ ｍｏ／ Ｌ中和液ｎ：Ｔ ｓ 　　 ． ｌ ｉ ａ　 ０５ ／ ｒ－ ｍｏ ＬＮａ 　　　ｍｏ Ｌ Ｃｌ　 １ Ｙｐ ７ （ ０） 　　　　Ｃ Ｈ　 ２ ． ０ ２２ 骤 略毛 转 法 步 从 （细 移 ）转膜需 ８２ 小时，转膜完毕将膜翻转， 　　　　 ４ － 剪去一角作记号．室温下将膜于置中和液１ １ 中 浸泡 １ｍｎ 　　　　 ．凝胶在 Ｅ ５ｉ Ｂ中染色３ｍｎ ０ｉ ，紫外灯下检测是否转移完全。４． ．２ ５． ３探针制备（ 加１ｇ 板Ｄ Ａ于灭菌 １ Ｆ模 Ｎ ） ｃ 双蒸水中， 最后反 应体积 １ １ ６＜ ， （ 在ＰＲ ２ ） Ｃ 仪上１ ℃ ０ 变性１ ｉ 迅速放冰 ０ ０ｎ ｍ， 水浴中 冷却变性。（ 把４１ ３ ） ， 地高辛抗原加到变性的Ｄ Ａ中，混匀，离心。 ７ ，　Ｒ仪保温 １ 小时后， ｕ Ｎ ３＇ Ｐ Ｃ Ｃ ２２ ９６ ℃加热 ｏ ｉ，终止反应。 　　　　 ｌｍ ｎ ５４ ．４杂交 ．２ ５．（将 １ 尼龙膜 Ｎ 面朝内， ） 有Ｄ Ａ的 加入５ｍ ２ＳＣ 润湿尼龙 弃去２ＳＣ ０ １ｘＳ 溶液 膜， ｘＳ 溶液。 （ 将杂 预热到４０。 在杂交 预杂交３ｍｎ ２ ） 交液 ２　 样品 Ｃ 管中 ０ｉ ．（将 ３ 制备的 辛标记 ） 地高 探针在ＰＲ Ｃ 仪上１ ℃ ０ 预热５ ｉ 然 ０ ｍｎ 后快速 ， 在冰水中 冷却变性。 ） ’ 变性的 （将 探针加入预热到４℃的 交液中， 混匀， 气泡产生。 ２ 杂 充分 避免（ 弃去预杂 ５ ） 交液， 探针 杂 加入 ／ 交液的 混合液， ２ 杂交过夜。 ４＇ Ｃ４ ．５洗膜 ．２ ５．（ １ ２Ｃ， 足的２ＳＣ ０ ％ Ｄ 溶液 １ ５ ５ 用充 ）－ ｘＳ ，　 Ｓ Ｓ 洗两个１分钟， ． １ ０ 保持搅 动。（ ６ ６Ｃ， ． ＳＣ　１ ＳＳ 液 ２ ５ ８ 用０ｘＳ ０ ％ Ｄ 溶 濒热 洗 温 ） 两 ５ 钟， 搅 ）　 － ５ ． 到 膜 度 洗 个１分 保持 动。４ ．６免疫检测 ．． ５ ２ （ 用洗脱缓冲液漂洗膜，１５ ｉ １ ） ．ｍｎ ｏ （ 在ｌ０ｉ ２ ） ０ｎ 封闭液中 ｌ 温育３ｍｎ ０ｉ ． （ 在２ｍ 抗体液中 ３ ） ０１ 温育３ｍｎ ０ｉ ｏ仔 在１ ｍ 洗脱液中 个１ ｉ ） ０ １ ０ 洗两 ５ ｎ　 ｍｏ贷 在２ ］ ） ０ 检测液中 ｍ 平衡２５ ｉ －ｍｎ ． （ 在暗处， ６ ） 将膜静置温育在ｌ ｌ 鲜的 色液中。 ｏ 新 显 ｍ（ 条带 后， ｍ 无菌的 ７ ） 显色 加５ １ 超纯水洗膜５ ｉ 终 应， ｍｎ 止反 扫描或照相。 ，４ ．Ｒ Ｐ Ｒ检测 ．３　 Ｃ ５ Ｔ　４ ．１转基因植株总Ｒ Ａ的 ．３ ５． Ｎ 提取参照ＴＩ］试剂说明书 ＲＭ４ ３２　 Ａ模板第一条链的合成以及 ＰＡ Ｐ ． ．ｃ Ｎ ５ Ｄ ａ Ｆ 前体蛋白 ｃ Ｎ Ｄ Ａ的Ｐ Ｒ扩增 Ｃ（ 按照 １ ） 下列体 系依次 加样：Ｎｕｌ ｓ－ｒｅ　 ｔ ｃ ａｅＦｅ Ｗａ ｒ ｅ ｅ２０９１ １０９ ？ １２５９ 啊 ＂ ？ ？ １２．５ｙｔ５， ０１ ｕＡ Ｖ聊５Ｒ ａ ｉ Ｂ ｆｒ Ｍ ／ ｘ ｅｃｏ ｕ ｅ ｔｎ　ｄ Ｐ　ｉ ＮＴ Ｍ ｘＤ ｗ ｓｅｍ　ｉｅ ｏ ｎｔａ ｐ ｍ ｒ ｒ ｒ Ｕ ｓｅｍ　ｉ ｅ ｐｔ ａ ｐ ｍ ｒ ｒ ｒ２ｍ Ｍ Ｓ ４ ５ Ｍ　 Ｏ ｇＡ Ｒ ｖｒ Ｔａｓ ｉａ ＷＶ　 ｅ ｅ　ｎ ｒ ｔ ｅ ｅ ｓ ｒ ｃｐ ｓ塑Ｄ Ａ　 ｍｒｅ Ｎ ｐｙｅｓ ｏ ｉ ｌＲ Ａ　 ｐ ｔ Ｎ ｔ ｌｅ ｅ ａ ｍ总反应体系（ 按照下列参数进行合成反应及Ｐ Ｒ ２ ） Ｃ 扩增：４＇ ５Ｃ ９０ ４Ｃ ９０ ４Ｃ ５０ ７Ｃ ６０ ８Ｃ ６０ ８Ｃ４ ｍｉ ５ ｎｎ ｉ － ７ ＇（ 取知１ ３ ） 反应产物电 泳检测。４ ．转基因植株总蛋白Ｓ Ｓ Ａ Ｅ分析 ．４ ５ Ｄ－ Ｇ Ｐ４ ．１转 植 溶性总蛋白 提取（ 尧君， ０１ ． ． 基因 株可 ５ ４ 的 郭 ２０） 取适量 　　　　 植株叶片， 转基因 加液氮研磨并 入１ｍ 离 收 ． Ｌ 心管， ０ Ｌ ５ 加２ ｙ 新配匀 ０ 浆缓冲液，混 １ＯＯ ｍ ４ 离心１分钟， 匀， ２　ｒ ，　 Ｏｐ １ Ｃ ０ 取上清， ２℃ 一 ０ 保存。匀浆缓冲液 　　　　蔗糖 　　　　　　　　　　　　　　 ０Ｍ ． ４Ｍ９ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　 ＣＺ　 ｌｍｍ ｏＴ ｓ　８ ）　 ｌ ｍ 　　　　　　　　　　　　 ｉｐ ０ ｒ （ ．　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｈ ０ ｍ ０ 疏基乙 　　　　　　　　　　　　 醇 ４ｍ ０Ｍ４ ． Ｓ Ｓ Ａ Ｅ电 郭 ． ． Ｄ － Ｇ 泳（ 尧君， ０１ ５ ２　 Ｐ ４ ２０） Ｔｓ ｒｉ Ｓ － Ｇ 凝胶配制及电 　　　　－ Ｓ Ａ Ｅ ｒ－ｉ ｅ Ｄ Ｐ ｉ ｃ Ｔ ｎ 泳分析 按照郭 尧君（ ０ 的 ２ １ 方法及相关资 ０） 料。４ ．转基因 ５５ 植株（ 的抗真菌检测 ｍ草）将 　　　　 （ ｉｃｎ ｓａｉ 立枯丝核菌 Ｒ ｚ ｔ ｉ ｏ ｎ接种到４０ １ ｈｏｏ ａ　 ） ｌ ０ｍ 液体Ｐ Ａ培养 Ｄ 基中， ５ １ ｒ ２Ｃ　 ｐ Ｏ ｍ振荡 Ｏ培养６ 收集菌丝体， 天， 用滤纸吸干， 称重， 韦林搅拌器低速搅拌菌丝体２３， －ｓ 加入新鲜 －的ＰＡ培 基， 丝体浓 Ｄ 养 使菌 度为Ｏｇ ｌ菌丝体 ．／ ， ｉｍ 悬浮液同 土壤棍 使 匀， 其浓度达到２菌 ｇ丝体几 上壤，待烟草苗长至 ４ 叶期时， 移栽到温室，继续培养 ７１ 天后，将其转至接种 －０ － 有立枯丝核菌的土壤中，在 ２＊　 ５８％ ３ ，　 ０ 相对湿度条件下，观察抗菌情况。 Ｃ ７－
Ｔ ｅ　 ｓ ｒ ａ ｏ ａｄ　 ｒ ｓ ｎ　 ａ Ｆ Ｇ ｅ　 ｉ 　　 ｒｎｆ ｍ ｔ ｎ　 Ｅ ｐ ｓｏ ｏＰ Ａ Ｐ　ｎ ｉＭａ ｅ ｈ Ｔａ ｏ ｉ ｎ ｘｅ ｉ ｆ　 ｅ ｎ　 ｚＰＡ Ｐ　 ａ ｉｎａｐ ｔｎ　ａｄ　 ｔ ｅ ｏＰｙ ｌ ａ　 ｒａ Ｌ ｈ ＰＡ Ｐ　 ｅ ｉ 　　　　ｎ　ｆ ｇｌ　ｅ ｉｌｅ ｆ ｍ　 ｓ ｄ　 ｈｔａｃ ａ ｅｃ ａ　Ｔｅ　 Ｆ ｐ ｔｎ　 ａ Ｆ ｉａ ｎ ｕ ｓ　 ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ ｔ ｒ ｈ ｅ ｆ　 ｏ ｃ ｍ ｉ ｎ ． ｏ ｏ ｅ　 ．　 ａ ｒ ｉｓ ｏｓ ｄ ｐｃｉａｄ　 ａ ｄ　 ｔ ｇｒ ｉ ｔｇ　ｄ　ｈ ｓｉｏ　ｍ　 　ｔ ｔｎ　 ｅ　ｉ ｔ　 ｏｅｓ ｅ － ｅｉ ｎ ｒｅｓ ｆ ｍ　 ｅ ｎ ｉ ｓ ｔｔ ｏ ｔｆ ａ ｒｅ ｉ ｚｎ ａａ ｓｐｔ ｇｎ ｅｓ ｆ ｃ　 ｅ ｅ ｒ ｈ ｍ ａｎ ｅ ｏ　 ｌ　ｏ ｐ ｃｏ ｏ ｇ ｎ ａ ｌ ｏ ｅ　 ｅ ｅ　 ｒ ｏ ｈ Ｔ ｅ　 ｌ ｙｅ ｅｉ ｐ ｔｎ　 ｉ ｌｂｓ ａｄ　 ｍ ｓｂ ，　 ｈ　 ｓｔｏ３ ａ ｉ ａｉｒ ｉ ｅｗｔ ｈ ｓ ａ ｃｓ ｉ －ｃ ｒｅ ｉｈ ｈ ａｃ　 ｔ ｒｏｔ ｌ ｗ ｉ ｃｎｉｓ　 ８　ｎ ｃ ｅ ｄ ｓ　 ｍ ｌ　 ｎ ｒｈ　 ｉ ｓ　 ｙ　ｉ ｎ ｈ ｔ ｏ ｇ ｅ ａ ｅ ｈ ｏ ｓ ｆ　 ｍ ｏ　 ｓ ｕ ｉ ｃ ｄ　 ｈＡｂ ｔａ ｔ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｓｒ ｃｓ ｃｓｉ ．　 ａ ｅ ｏ ｃｎ ｉ ａ　ｌ ｉｅ ｔｎｅ ａｔａ ｌｌ　ｅ ａｄ　 ｌ ｉ ｂｎ ｆｍ ｗ ｒ ｉ ｙｅ ｅＩ ｆｍ ｗ ｒ ｏｔｎ ｓ ａ ｔ ｌｓａ ｄ　ｐｒｌ Ｂ ｈｅ ｎ ｄｕ ｈ ｅ　ｄ　 ｅ ｏ ｘ　 ｎ ｔ ｔ ｓ　 ｒ ｋ　 ａ ｓ　 ｌ　 － ｄ ｎ ａｅ － ｔ　 ｉ ｐ ｄ ｏ ｒ ｍ ｒ ｐ ｒ ｉ ｓ ｓ ａ ｋｗｔａ　 ｅ ｕｓ ｕ ｃ（．Ｃ　 Ｃ　 ．ｑ ａ ｔ ｐｉ ｇ　ｅ 　 ，　 ，　 ）　 ｓ　 ｉ ｃ ｓ ｓ ｅ ｅ ｅ　． ．Ｃ ．Ｃ． ｎ ｈ ａｉ ｐｔ （ ｈ　 ｎ ｎ ｓ　 ｎ Ｃ　 ． ． ． ｄ　 ｒ ａ ｒ １ ｏ ｑ ．　 ．　 ．　 ｅ　 ｎ ｔ －４ ２ ｎ －５ ３ ｓ ｗ ａ ６ － ｈ ｏｋｏｉｔ ｅ　ｃ ｒ ｍ ｔ．　Ｆ ｏｖ ｕ ｙ　ｂｓ　ｇ ｗｈ　 ｈ ｏｔ ｉ ｓｌ ｉ　ｈ ｉｖｒ．　 ｎｔ －ｐ ｓｕｕ ｌ　ｉＰＡ Ｐ　 ｉ ｓ ｉ ｉｔｔ ｒ ｔｏＲ ｉ ｃ ｎａ　ａ Ｋｉ ｎ　ｏＩ ｎｙ ｔ ｔａ ｏｆ ａ ｒ ｂ ｏ ｌ ｎ ｉ ｈ ｏ ｆ　ｚ ｏ ｈ ｅ　 ｏ ｎ ｉｎ　 ｉ ｎ ｔ ａｄｉ ，　ｈ ｉ ｔ ｇ ｗｈ　ｏ ｅｓｌｏ ｅ　 ｏｅｉｆ ｇａｄ　ｅ ｌ　 － ｓｉ ｂｃ ｒ．　 ｄｉ ｎｉｎｉｔ ｈ ｒ ｔｏ ｔ ｒ　－ ｒ ｐｔ ｇｎ ｕ ｉ　 ｓ ｒ ｇ ｍｐ ｉ ｅ　ｔｉ Ｔｅ ｔ ｔ　ｂｓ　 ｏ ｏ ｉ ｅ　 ｆ　 ｏ ｂｎ ａ ｈ ｉ ｈ ｃ　 ｎ ｅ ａ ｒ ｏｔ ａｅａ ｈ ｎ ｖ ａ ｖｐ ｔｎ　 ｙｔ ｓｅ ａ ａ　ｃｒ ｒ　 ｐ ｃｓ ｄ　 ｉ ｍ ｔｅ　ｍ　 ｔ ｐ ｃｓ ｏ ｓ ｒｉ ．　ｆ ｒｅ ｉｓ ｈ ｉ ｄ　 ｐ ｕ ｏ ａｄ　 ｅ ｅ ｉｏ　 ａ ｒ ｆ ｉ ｈ ｒ ｅ ｆ　 ｅｏ Ｓ ａ ｏ ｉ ｓ　 ｅｚ ｓ　ｒ ｓ ｎ ｒ ｓ ｎ ｔ ｕ ｏ ｎ　 ｏ ｓ　 ｅ ｔｎ ｏ　 ｎ ｅ ｏ ｔ ｓ　 ｒ ｅ　 ｃ ｒｔ ｒｓ　 ｎｔ　ｒｅ ｃ ｏ ｔｎ ｏ ｉ ＰＡ Ｐ　ｅ　 ｐ ｎ ． ｈ ｅ ｂｅ ｏａ ｅ ａ ｈ　 ｒ ｓ ｒ ｎ ａＦ ｇｎ ｉｏ　 ｔ ｅ＇ｅ ｎ　 ｎ ｓ ｒ ｎ　 ｆ ｍ ｇ　 ｙ　 ａ ｅ ｎ ｌｓ ｔ ａ Ｂｎｅ Ｌ ｆ　 ｈ ｔ Ｂｉ （ＩＢ ｏ ａ ｅ　ｕｅ ｉ ｔ ｉ ｉ ｒ ｉ ｅ　 ９６　 ｂｄ 　　　　ａ ａ Ｓｅｈ　ｇｔ　Ｓ ）　ｍ ｉ ｏｃ ｒ ｆｓｙ　Ｊｉ ｐ ｖ ｃ ｉ １６ ａｄ　 ａ ｄ　 ｎ ｄ ｅ ｄ　 ａ ｌｈ Ｂ ｆ　ｚ ｃ ｒｄ　 ｌ ｎ　ｎ　 ｎ ｎ　 ｎ ａ ｒ ｌ ｏ ｂ ｏ ｅ　 ｒｕ ｄ ｅ ｅ　 ａｙ　 ｚ ｐ ｄｃｏ ａ ａ ｏＣ ｉ ｉ１７ｓＴｅ　 ｏ ｉ ｎｐｔ ｇｎ　 ｅ ｍ ａ　ｏｓ　 ａ ｉｍ ｎ ｍ ｉ ｒ ｕ ｉ ｒ ｓ　 ｈ ａ　 ９０．　 ｐ ｄｍｎ ｔ　ｏｅ ｏ ｃ ｓ ｉ ｉ ｓ ｎ　 ｅ ｓ ａｅ　 ｔｎ　 ｆ　ｎ ｎ　 ｏ ｅ ｈ ｒ ｅ ａ ａ ｈ ｆＢ Ｓ ｉＲ ｉｃ ｎ ｓｌ ｉｔ ｒ　 ｎ ｅ ｅｔ ｌ　ｒ ｃ ｔ ｐ ｖｎ ｔ ｆ ｇｌ　 ｃｏ ａｄ　 ｔｌ　 Ｉ Ｂ　 ｈ ｏｔ ｉ ｏ ｎ ｈｅ ｉ ｏ　 ｃ ａ ａｐ ａｈ　 ｒ ｅｔ　 ｕ ａｉｅｔｎ　 ｃｎ ｔ ｓ　ｚ ｏ ａ　ａ ，　 ｓ　 ｆ ｕ ｐｏ ｅ ｆ ｏ　 ｅ ｈ ｎ ｎ ｉ ｎ ｏｒ ｈ ｅ　 ｆ ｏ ｅ ｄｅｓ Ｓ ｗ ｔ 　ａｏｔ　ｔｎｇｎ ｔ ｈｏ ｇ ｔｉ ｅ ｔ ＰＡ Ｐ　 ｅ　 ｍ ｉ ｇｎｍ ，　ｒ ｒ　 ｉａ ．　 ｅ　ｔ ｄｐｔ ｒ ｓｅｉ ｅ ｎｌ ｙ　ｎ ｒ ｈ ａ Ｆ ｇｎ ｉｏ　 ｚ ｅｏ ｅｉｏ ｅｔ ｓ ｅ ｏ　 ｒ ｏ　 ｈ ａ ｙ ｅ　 ｃ　 ｏ ｏ　 ｔ　 ｃ ｓ ｅ　 ｅ ｎ ａ ｅ　 ｔ ｎ　 ｏ ｄ ｄｖｌ ｒ ｉａｔ　 ｄ　 ｓ　 ｆ ｄ　 ａ　 ｗ ｙ　 ｏｔ ｌ　ｄ ｅｓ ｅｅ ｐ　ｓｎｉ ｒ ｌｅａｄ　 ｏｔ　ｗ　 ｔｃｎｏｔ ｉａ ． ｏ ｅ ｔ ｎｅ ｉ ｎ ｉ ｕ ｎ ａ ｏ　ｒ ｈ ｓ ｅ ｓ ｂ ｎ ｎ ｅ ｅ　Ｔ ｅ　Ａ ｃ Ａ　 ｅ　 ｅｔｃ ｄ　 ｔ ｌ ｅ ｏ ｈｔａ ａ　 ｒ ａａ　 ｎ ａ　 ａ ｃ 　　　　 Ｐ　 Ｎ ｇｎ ｗ ｓ　 ａｔ ｆ ｍ　ｅ　ｖｓ　 Ｐｙ ｌ ｃ ａ ｅｉ ｎ Ｌ ａｄ　ｂｔ ｉ ｈＰ Ｆ Ｄ ａ ｅ ａ ｘ ｅ ｒ ｈ ｅ ｒ ｏ ａ ｆ　 ｏ ｃ ｍ ｃ ．　 ｏｎ ｅｐ ｓｏ ｖｃ ｒ　ｐ Ａ Ｉ １０－ａ Ｆ ｃｎ ｉｎ ｔ ＰＡ Ｐ　 Ｎ ｇｎ ｗ ｓ　 ｓ ｃ ｄ ｔ ｎ　 ｘｒ ｓ ｎ　 ｔ ｏ Ｃ ＭＢＡ ３０ Ａ Ｐ　 ｔｎ ｇ　 ａ Ｆ ｃ Ａ　 ｅ　 ｃｎｔ ｔ ，　 ｔ ｅ ｉ ｅ ｏ ｆ　 Ｐ ｏａｉ ｈ ｅ　 Ｄ ｅ ａ ｏ ｒ ｅ ｈ ｈ ｕ ｅ ｅｒ ｏ ｂ ａｔ　ｍｄ　 ｔｎ ｏ ｅ ｉｏ　ｉｍ ｔ ｅ ｂ ｏ　 ａｅ　 ｄ　 Ｑ３９　 ．　 ｆ ｉ ｓ ｅ ｍ ｉ ｎｐ ｓｉｗ ｓ　ｓ ｒ ｄ　 ｔ ｍ ａ ｒ　 ｒ ｏｍ ｉ ｉ ｒ ｌｅ　１ ｂＡ ｔ ｅ ｃｎ ｃ ｎ ｌ ａ ａ ｒ ｆｍ ｎ ｈ ａ ｔ ｅ　 ｕ ｍ ｙ ｆ　 ｎｅ ｉ ｉ ｙ ｕ ａ ｅ ｅ ｚ ｂ ｎ ｍ Ｌ Ａ ４４Ｔａ ｇｎ ｐ ｎ ｗ ｒｒ ｅｅ ｔ ｗｔｔｓ ｃｌｒｔｈｏ ｇ．　ｇｎｍ Ｄ Ａ　ｓ　ａ ｅ Ｂ ４０．　ｓ ｉ ｌ ｔ ｅ ｅ ｎｒｅ ｉ ｉｕ ｕｕ ｅ ｎｌ ｙ ｈ ｅ ｅ　 ｗ ｅ ｒ ｔ ｒ ｅ ｃ　 ｓ　ｅ　 ａ ｄ　 ｓ ｅ　 ｅ　 ｏ Ｔｅ　ｏ Ｎ ａ ｘ ｃｄ ｎ ａ ｇ ｈ　 ｔ ｃ ｔｒ ｌ ｅｏｔｎ ｏ ｄ　 ｔ Ｉ ｓ　 ｅ ｔ ＰＡ Ｐ　 Ａ　 ｅ　 ｂｅ ｉｅｒｅ ｎ ｔ ｅｏ ｅ ｆ ｍ　ｖｓ　 ａｓ ｒ ｅ ｐ ｎ ．　ａｐ ｖｄ　ｔ　 Ｆ ｃ Ｎ ｇｎ ｈｓ　ｎ　 ｇ ｔ ｉｏ　 ｇｎｍ ｏ ｅ ａ ｆ　 ｆ ｍ ｌ ｓ ｔ　 ｒ ｒ ａ ｗ ｏ ｈ ａ ａ Ｄ ｅ ａ ｅ ｎ ａ ｄ　 ｈ ｔ ｔ ｅ　 ｏｔｎｆ ｍ ｄ　 ｔｂ Ｐ Ｒ　 Ｐ Ｒ ｏｔ ｒｂ ｔ ｇ　ｌ ｉ Ｔ ｅ　 ｌ　 ｅｔｃ ｄ　 ｔ ｌ ｖｓ　 ｆ　ｓ ｒｅ ｐ ｎ ｙ　 ａｄ　 － ｕ ｅ 　 ｔ ａａ ｓ．　 ｔａＲ Ａ　ｒ ｔ ｆ ｍ　 ｅ ｅｏ ｒ ｏ ａ ｌ ｓ　 Ｃ ｎ Ｃ Ｓ ｈｎ ｌ ｉ ｎ ｙ ｓ ｈ ｏ Ｎ ｘａ ｅ ｒ ｈ ａ ｆ ａ ｏｎ ｔ ｏ ｅ　ｔｎ ｅｉｐ ｎ，　 ｔ Ｒ Ｐ Ｒ　ｕｓ　ｄ ｅ ｔ ｔ　 ＰＡ Ｐ　Ｎ ｇｎ ｈｄ　ｎ　 ｓｉｅ ｉｏ ｒ ｓ ｎ ｌ ｔ ａ ｈ Ｔ　 ｒ ｌ ｖｌａｄ　 ｔ ａＦ ｃ Ａ　 ｅ　 ｂｅ ｔｎ ｒｔ ｎ ａ ｇ ｃ　 ｓ ｎ ｅ　 Ｃ ｅ ｔ ａ ｔ ｈ ｈ ａ ｄ　 ｓ ｉ ａ ｅ　 Ｄ ｅ ａ ｅ ｒ ｃｐ ｄ　 ａ ｔｍ Ｎ ．　 ｂ ｐ ｔｎ ｗ ｒ ｉ ｌｅ ｆ ｍ　 ｌ ｖｓ　ｈ ｐ ｎ ．　 ｒ ｕｓ　 ｒ－ｒｉ － ＳＰ Ｇ Ｒ Ａ Ｓｌ ｌ ｒｅ ｓ　 ｅ　 ａ ｄ　 ｔ ｅ ｅ ｏ ｔ ｌ ｔ Ｔｅ　 ｌ ｏ ＴｉＴｉｎ Ｓ － Ｅ ｏ ｅ　 ｉ ｅ ｓ ｔ ｒ ｈ ａ ｆ　 ａ ｓ ｈ ｅ ｔ ｆ　 ｃ ｅ Ｄ Ａ ｕ ｏ ｏ ｏ ｅ　 ｅ　 ｓ ｓ ｓｏ ｅ ｔ ｓ ｅ　ｌ ｕ ｒ　ｇｔ　ｅ ａＰＡ Ｐ　ｈ ｔｎｇｎ ｐ ｎ ，　ｉｎｎ ａｓｅｉｍ ｉ ．　 ｈｗ ｄ　 ａ ｍ ｅ ｌ ｗ ｉ ｐ ｔｎ　 ａ Ｆ ｉｔ ｒ ｓ ｉ ｌ ｔ ｎｔ　ｏ－ ｎｇｎ ａ ｅＯ ｈ ｍ ｏ ｃ ａ ｅ ｈ ｒ ｉ ｓ　 ｅ　 ｏ ｎ　 ａ ｅ ｃ　 ｓ ｏ ｎ　 ｔ ｅ　 ａ ｒ ｃ　ｚ ｎｔ ｗ ｏ ，　ｖａｄ　ｔ　ＰＡ Ｐ　 Ａ　 ｅ　 ｔｎｌｅ ｉｏ　 ｐ ｔｎｂｔ　ａ ｎｔ　 　 ｔ　 ｈ ｈｌ ｉ ｅｅｅ ｔ ｔ ａＦ ｃＮ ｇｎ ｈ ｒ ｓｔ ｎ ｔ ｒｅ ，　ｗ ｒ ｏｓ ｉ ｉ ｅ　 ｅ ｔ　 ｌ ｈ ｈ ｒ ａ ｅ　 Ｄ ｅ ａ ａ ａ ｄ　 ｈ ｏ ｉ ｕ ｅ　 ｓ　 ｔ ｅ　 ｅ　 ｕ ｆ　 ｅ ｒ ｉｓＰａ Ｐ ＡＦＴ ｅ　ｃ ｒ ｕ ｎ Ａ ｔ ｆ ｉ ｓ　 ｓ ｒ ｎ ａ ｅｇｎ ｉｏ　 ｏ ｅ　 ａ ｅ　 ｉｐ ｖｄ　ｈ 　　　　 ｕ ｓ　 ｇ　ｕ ｅ ｃ ｎ ｔｎ ｏ ｉ ｔｇｔ　ｅ　 ｇｎｍ ｏｍ ｉ ｗ ｓ　 ｒ ｅ ｉｔ ｈ ｐ ｅ ｅ ｓ ．　 ａ ｅ ｒ ｆ ｍ ｇ　 ｒ ｄ ｏ ｉ ｍ ａ ｒ ｅ ｎ ｅ ｔ ｆ　ｚ ａ ｍ ｏ ｎ　 ｅ ｃｒｎｓ ｄ．　ｈ ｓ ｅ　ｅｔ ｆ ｓ ｉｙ　 ｓ ｇ　 ＰＡ Ｐ　 ｅｅ　 ｉ ｅｎ ｔ ｈｉ ｅ　 ｎａｃ ｕ ｅｔ　 ｙＡ ｔ ａ ｔ ，　 ｅ ｉｌ ｏ ｕｉ ｔ ａ Ｆ ｉｇｎ ｅｇ ｅ ｉ ｅ ｎ ｕ ｔｅｈｎｅ ｒ ｔ ｕ ｔ　 ｍ ｉ ｈ ａｂｉ ｆ　 ｈ ｅ　 ｍ ｅ　 ｔ ｎ ｅ　 ｎ　 ｎ ｎ ｒｇ　 ｑ ｏ　 ｃｒ ｉａｃ ｏ ｍ ｉ ｔ ｆｎａｄｓａｅ ｗ ｓ　 ｕｓｄ ｅ ｓ ｎｅ　 ａ ｅ　 ｕｇｌ　 ｓｓ　 ｄ ｃｓｅ． ｓｔ ｆ　 ｚ ｏ　 ｉ ｅ ａ ｉ ｓＫ ｙ　ｒ： ｅｗ ｄ ｏｍ ｉ，　ｏａｔ ｉ ｔ ｅｃｎ，　ｆｎａ Ｒ ｉ ｃ ｎ ｓｌ ｉ ａｅ ｇ ｂｃ ｒ ｍ　 ｆ ｉｓａｔｕｇｌ ｈ ｏｔ ｉ ｏ ｎ ｚ Ａ ｒ ｅ ｕ ｕ ａｅ ｎ ｍ ｉ ，　 ｏ ａ　ａ ｚ第一部分 绪论１ 文献综述 ．１ 玉米纹枯病研究进展 ． １玉米是我国主要的粮食作物和饲料作物以及重要的工业原料，在我国国民经济和农业 　　　　生产上发挥重要的作用。 然而，我国玉米生产每年因各种病害造成的减产和损失约占总产 量的 １％（ ０ 吴建宇，９９。玉米纹枯病就是其中一种严重病害。它也是一种分布范围很广 １９）的世界性病害。在许多国家和地区均有该病发生和危害的报道，特别是东南亚国家和地区尤为严重（ ｓ ａ ２０） Ｐ ｃ ｌ ００ ａ ｕ ，　玉米纹枯病始见于１６年的吉林省，到了７年代中后期逐渐成为我国玉米主要产区的 　　　　 ９６ ０一种严重病害。在四川、贵州、江苏、浙江、河南、河北、安徽、辽宁、黑龙江、吉林、山西、陕西、山东及两湖、两广地区的春、夏、秋玉米种植区均有纹枯病的发生。随着近 年来紧凑型玉米种植面积的扩大，密植、高水肥技术的应用以及玉米多年连作， 加快了纹 枯病的发展蔓延，一般年份发病率达４％，严重时发病率达７％ ０ ０ ，个别地块或品 种可达 １０ 且纹枯病病情加重， ０％； 直接影响玉米的产量和品 轻则植株下部叶鞘呈云纹状大斑 质。 坏死， 致使子粒不饱满， 减产１－５ ； ０３％ 重则菌系向中上部叶鞘蔓延， － 扩大侵染， 危害果穗形成“ 霉苞” ，减产高达５％，甚至绝收。 ０尤其近年来， 　　　　 随着我国 玉米种植面积的扩大， 各种高产栽培技术的 应用， 易感纹枯病的紧凑型玉米的推广， 水肥条件的改善， 特别是氮肥的增多，致使纹枯病蔓延加快，病情加重，已成为玉米生产的一个重要限制因素，引起了植保和育种工作者的高度重视。１． ．１玉米纹枯病的症状表现 １ 玉米纹枯病从苗期至抽穗期均可发生，危害高峰期在玉米子粒形成至灌浆期，生长后 　　　　期植株老健， 病菌不易侵入， 病情趋于稳定。该病主要危害叶鞘、叶片和穗部，也侵害茎秆。最初多由接近地面的叶鞘发病，由下而上逐步蔓延。主要症状为在叶片和叶鞘上形成典型的呈暗绿色水渍状同 心斑， 大面积覆盖被侵染叶片和苞叶， 形成不规则的云纹状病斑，中部呈灰褐色，边缘呈深揭色，随后病斑逐渐扩大，包围整个叶鞘，直至叶鞘叶片干枯；甚至病斑向 上扩展至果穗基部，果穗停止发育并迅速蔓延至全穗，导致死亡； 如果茎秆受害，病斑褐色，形状不规则，后期茎秆质地松软，组织解体，露出纤维束，使植株极易倒伏；如果果穗受害， 苞叶上产生云纹状病斑，常常致使果穗秃顶，子粒灌浆不足，批粒增多，粒重明显下降，严重时果穗干腐，穗轴霉变，影响玉米的产量和品质。随着病害级别的增加，植株绿叶数减少１８ 　　　　 －片，株高降低５ ４３． ｃ ． －５ ３ｍ，茎粗减少 ７ ２ ０ ３－８ｃ ． －． ｍ，须根粗减少０ １０ ５ｍ，子粒霉变率为０１． ％，植株提前枯死０１ｄ １ ０９ ． －． ｃ ０ －０ －９ ９ ６ －５ 。植株发病愈重， 对其茎粗、 须根粗和株高的影响愈大， 下降百分数愈大。 从下降百分数来看， 依次首先对茎粗的影响最大，其次为须根粗和株高。植株发病越重，枯死越早，子粒霉变率也越高。Ｌ Ｚ致病菌及致病因 Ｌ 子１ ．１致病菌 ．２ １．玉米纹 　　　　 菌的 枯病 无性阶段为半知 立枯丝核 （ ｉｃｎ ｓａｉ　 ） 菌的 菌（ ｚ ｔ ｉ ｏ ｎｋ ｎ 禾谷丝 Ｒ ｏｏ ａ　 ｉ 、 ｈ ｌ ｉ ｈ 核菌（ｃｅｉ、 玉 黍 核 （ｚ ｅ 个 颜 齐 １ ４ 高 东 １ ７ 赵 东 １ ６。 Ｒ ｅａ ）和 蜀 丝 菌Ｒｅ ） 种（ 思 ， ８； 卫 ， ８； 桂 ， ９ ｒｌ ｓ ａ三 ９ ９ ９）立枯丝 核菌的 性态是 有 瓜亡革 （ ａ ｔｈｒ ｃ ｕｅｓ 玉蜀黍丝核菌的 菌 Ｔ ｎ ｅ ｏ ｓ　 ｍｒ） ｈ ａｐ ｕ ｕ ｉ， ｃ 有性态是Ｗｉ ｃｃａ ， 谷 菌的 态是 谷 担 （ ｒｏ ｓｉ ｃｅｅ 其中 蜀 ａｅ ｉｉｔ 禾 丝核 有性 禾 角 菌Ｃ ａｂ ｉｕ ｅａ） ｔ ｒｎａ ａ　 ｅ ｔａｄｍ　 ｌ。 玉 黍 ｒ丝核菌主要危害果穗引起穗腐，禾谷丝核菌主要危害小麦。 综合前人对丝核菌的 研究结果发 玉米纹 病原菌主要 现， 枯病 是立枯丝核菌 ｓａｉＡ －琳 ， 俱 ｏｎ Ｇ１ ｌ ，　 － 它是引 起中国 玉米纹枯 病的 种。 枯丝核菌Ｐｉｃｎ ｓａｉ　 ） 优势 立 （ ｚ ｔ ｉ ｏ ｎＫｈ 属真菌半 ｈｏｏａ　 ａ ｌ ｎ 知菌亚门， 抱目 丝核菌属， 无 ，立枯丝核菌。病菌在马铃薯蔗糖培养基上生长时， 最初菌落呈淡色，后转为褐色；菌丝最 初无色，菌丝体由 絮状变为蛛丝状，宽６８ －微米，分枝与母枝成锐角，分枝处稍绕缩，离 － 分枝不远处有一隔膜，以 后菌丝变为淡褐色，分枝与隔膜增加，分枝与母枝成近直角。 菌 核呈不规则形，褐色， 质地松软，直径１３ －毫米，常常数个菌核互相合并；切面呈薄壁组 － 织状，无明显内、外层分化：菌核与菌核之间有少数菌丝相连。寄主范围广，除玉米、高粱、谷子外，尚可危害烟草等数百种植物。高 （８ 道， 华 玉 种植区 离 得了 ７ 株， 鉴定 属 ｈｏｏａ 　　　　 报 在 北 米 卫东１ 乃 ９ 分 获 ７ 个菌 经 分 Ｒｉｃｎ ｚ ｔｉｓｌ ｉ Ａ － Ｉ，　 － １ ，　 － Ａ － ｏ ｎ中的 Ｇ１Ａ Ａ １ Ｂ Ａ ３ Ｇ５ ａ － Ｇ－ Ｇ ，　 等多核菌丝融合群，和Ｒｃ ｅｌ中的Ｃ Ｇ３ ｅ ａｓ ｒ ｉ Ａ－ ， Ｃ Ｇ６ Ｃ Ｇ８ Ｃ Ｇ９ Ｃ Ｇ１等双核菌丝融合群。以 Ｇ１Ａ Ａ－ Ａ－ Ａ－ Ａ－ ，　 ，　 ，　 ０ Ａ － Ｉ群为优势菌群， Ａ － － Ｃ Ｇ１ ０对玉 米致病性 最强。 家凤（ ９） 道， 川 陶 １２ ９ 报 在四 从玉米上分离到 Ｇ１Ａ Ａ － 从水稻 Ａ －Ｉ和 Ｇ４ － ，上分离到Ａ － Ｉ， Ｇ１Ａ 分别接种在玉米的叶片和叶鞘引起发病． Ｇ１Ａ － Ａ － Ｉ菌群侵染玉米所致病 － 斑大， 扩展迅速， 为典型的纹枯病症状， Ｇ４ 而Ａ － 病斑小， 发展慢， 与典型纹枯病症状不同。 唐朝荣等报道， 从辽宁省５ 个县市收集到９个菌株均为立枯丝核菌中的Ａ －Ｉ融合群， ３ Ｇ１Ａ － 并且以 丹东菌株 丹东 Ｓ ５１ （ Ｒ－ ０） ９ 致病力 最强， 菌株 Ｒ－ ０ 次 秦芸对四 昌图 （Ｓ ５１ 之。 ９ ） 川雅安地区的纹枯病病菌进行了种类和融合群鉴定，表明招致玉米纹枯病的病原菌是丝核菌属中的立枯 丝核菌和玉蜀黍丝核菌，其中立枯丝核菌的Ａ － Ｉ菌丝融合群为引致玉米纹枯病的优势 Ｇ１Ａ －４ 　　　　　　　　　　 ７病原 菌 。肖 炎农 等研究发现， 湖北省的 纹枯病病菌为 Ｇ１Ａ　 Ｇ４ Ａ － Ａ Ａ 、 玉米 Ａ －Ｉ ，　 ，　 ５ Ｇ － Ａ － Ｇ ，　、Ｇ Ａ Ｅ和ＷＡ － ＧＺ等７ 个融合群， 其中Ａ － Ｉ 也是湖北省的主要病原。 Ｇ１Ａ － 李华荣等 对四川省玉米纹枯病菌系研究发现， 四川省玉米纹枯病的主要菌系为Ｒ ｏ ｎ的Ａ － Ｉ 和 ｓｌ ｉ Ｇ １Ａ ａ －Ｒｚａ菌株。 ｅｅ纹枯菌丝生长最低温度为７１０， 　　　　 －０ 最适温度２－０ ， －Ｃ ６３０ 最高温度３－９ ｏ菌丝形成的 －Ｃ ８３０ － Ｃ　温度，最低１－４ ，最适２ ０，最高３－７ ，属高温型菌； 在１０，菌核形成速度最 １１０ Ｃ ２ Ｃ ４３＇ Ｃ ４ Ｃ低需 ｌ， 在３℃ 要ｌ 而 ０ 情况下， ｄ 只需要 天 颜思 ２ （ 齐等， ９４ １ ２ 病菌生 Ｐ 范围 １ ，　 ） ８ ９ 。 ９ 长的 Ｈ 较宽，但仍属于喜微酸菌群。菌核在干燥的土壤中能存活６ 年，在流动的活水中能存活６ 个月左右 。１ ．２致病因子 ．２ １．纹枯病菌主 　　　　要产生 Ｇ Ｐ Ｇ ｘ ３ 细胞壁降 Ｐ ，　 和Ｃ共 种 Ｍ 解酶和毒素 陈 １９ 。 （ 捷， ６ 细胞壁降 ９） 解酶和毒素对叶片和叶鞘有明显的酶解作用， 其中降解酶比毒素作用明显。但用单一酶或毒 素代替病菌接种不同抗性品种，尚不能反映品 种间抗性差异。病菌产生的细胞壁降解酶活性受温度、 Ｈ 反应时间和底物浓度等因素影响。 Ｐ 值、 病菌活体外可产生Ｐ ，　Ｇ Ｐ Ｔ ， Ｇ Ｐ ，　 Ｅ Ｍ ＧＰ Ｔ ，　和Ｐ 等６ Ｍ Ｅ Ｃ Ｅ 种细胞壁降解酶，其中Ｐ ，　 ，　活性较高，是主要的细胞壁降解 Ｘ Ｇ Ｐ ＭＧ Ｃ ｘ酶。 病菌接种后活体内 产生的细胞壁降解酶活性除与菌株致病力相关外，还与所接种的寄主抗性强弱有关，寄主抗性越强，病菌产生酶活性越低，反之亦然。玉米纹枯病病菌毒素对不同 玉米品种叶片和叶鞘组织细胞膜都有不同程度的危害作用， 可导致细胞内电解质外 漏，而且毒素对叶片的伤害作用大于对叶鞘的作用。但毒素对叶片或叶鞘组织的伤害作用 与品种抗性并无明显相关。叶片和叶鞘是病菌致病因子的主要侵染部位。 研究发现，毒素 对玉米种子萌发没有明显的抑制作用，而对叶片、叶鞘危害较为明显。说明 病菌毒素的作用部位具有选择性，这同病菌苗期接种很难侵染幼苗根系相吻合，也恰好说明该病害属于成株期侵染叶鞘和叶片的病害。 由 　　　　 于毒素和酶对不同抗性品种作用不能反映品种间抗性的差异， 在某种程度上反映病 菌单一的毒素和酶在病菌侵染中不起决定作用， 所以， 这两种因子的复合作用或包括菌丝 机械压力在内的其它因子的共同作用才决定病害的发生。１． ．３侵染源及侵染途径 １初侵染 　　　　玉米田 源为 土表和浅 土层中 越冬菌 朱东安２０ 。 温度、 的 核（ ， ２ 在 ０） 湿度、 条 光照件适宜时，玉米田 土表和浅土层中的越冬菌核开始萌发菌丝，侵染玉米植株基部叶鞘，通 过病、 健叶片和叶鞘相互搭接等可造成再侵染， 使病害逐步向上蔓延扩展引发玉米纹枯病。４ ８多雨潮湿时发病部位长出稠密的白色菌丝体，之后菌丝密集成多个菌核，最初为白 色，后 变为褐色，最后呈暗褐色。成熟的菌核多为圆形或扁圆形，易脱离寄主，遗落田间成为再次侵染的菌源。玉米种子和病株残体可带菌， 但不能引起玉米植株发病。在人工接种玉米纹枯病的试验中，接种病菌后１－４ ，病菌可通过表皮、气孔和 自 　　　　 ２２ｈ － 然孔口 途径侵入寄 其中 表皮 三种 主， 以 直接侵入为主 陈 ２０） 病菌的 （ 捷， ０ ０ 。 侵入有两 种形式：一种是以菌丝端部侵入，另一种是先形成侵染垫，然后通过侵染钉侵入，侵染垫是病菌主要侵入结构。接种８１ｈ －２，可在叶鞘表面形成近圆形的侵染垫及附着胞，在这些结构上形 － 成侵入钉侵入。接种１ｈ ２后即在叶鞘组织细胞内 可见侵入的菌丝，菌丝细胞中富含液泡。侵入叶肉 细胞内的菌丝可以 穿透细胞壁，在细胞间 扩展。 接种后１ ， ６ 新生出的菌丝从气 ｈ孔成丛出现。接种病菌３ｈ ６后，叶鞘表面的表皮组织崩解，细胞离析。１． ． １ ４玉米纹枯病的发生、 危害及防治１ ．１田间消长规律 ．４ １．玉米纹 　　　　 枯病的田间 发展既 发生 受玉米生育期的 影响， 与气象因素 切相关 张 也 密 （培坤，０ 。 ， １ 一般苗期 ２ ） ０ 很少发 喇叭口 抽雄期开始发病， 病， 期至 抽雄期开 始扩展 蔓延， 丝 吐期发展 速度加快， 灌浆期至成熟期病情垂直发展最快， 是危害的关键时期， 生长后期植株老健， 病菌不易侵入， 病情趋于稳定． 具体表现为： 喇叭口 期在茎基部叶鞘有水溃状病斑， 拔节期病斑逐渐明显， 抽雄期发展速度加快，吐丝期危害加剧，灌浆期至蜡熟期病情发展速度骤增，是危害的关键时期。 发生危害期一般４ｄ ５左右，关键危害期２ｄ ０左右。 在温度较高、 湿度较大、雨量充足的 情况下，玉米纹枯病病情的发展没有明显的停滞期。 但在多晴少雨的 情况下， 病情发展相对减慢， 久晴无雨时病情发展近乎停滞。 生态地势、 栽培方式、种植密度、施肥水平、温度、湿度以及品种抗性等因素与病害发展关系密切。 在品种和施肥水平基本一致的条件下，注地发病最重，平地次之，岗、坡地最轻；清种田通风透光条 件差，相对湿度大，有利于病菌的滋生繁殖，比间作田发病重；连作田由于病菌的积累，发病比 轮作田 重；种植密度过高、氮肥施用过多、长势偏旺的田 块发病植密度过高、氮肥 施用过多、长势偏旺的田块发病重。雨水多的年份，日 照时数少，空气湿度和田间土壤湿度均较大，有利于病菌的繁殖与侵染危害，因而发病重。日 平均气温在２℃ ５ 左右最适于发 病，气温低于２℃ ０ 或高于３℃ ０ 均不利于纹枯病的发生发展。 １ ．２危害损失 ．４ １．玉米纹枯病在一些地区的危害日 　　　　 趋严重， 田间发病率偏高， 病株率常常达１０ 张春 ０％．山 １９） （ ２ ９ 报道， 在调查１１ 交系、 ３ ８份自 ５份杂交种及４ 份地方品 种的纹枯病发病情况时， 发４ 　　　　　　　　　　 ９现 自交系发病达１． ４ ％，病株率１０ ４ ０％，病指１． ６． ６ ％－６ ％，其中发病至穗部的达７ ％；杂 ７ ７ ． ７交种发病达８． ，病株率８ －０％ ６％ ７ ％ １０ ，病指３． －３ ％， ３ ％ ８． 其中发病至穗部及以 ３ ３ 上的品 种达 ９ ％ 吴大椿报道， ３． 。 ６ 玉米纹枯病带来的 平均 率２ ８ ， 重下降 ．ｇ 最高 一级 损失 ．％ 千粒 ５ ５５； ５ 级四级损失率达５． ％ 千粒重下降９． ％ 严重田 植株早期枯死， １３ ， ２ ３７ ； ９ 块， 子粒不能正常成熟，导致绝收。玉米纹枯病对产量损失的影响是通过危害叶鞘和茎秆，造成鞘腐和叶枯， 　　　　 从而降低光 合作用和同化产物的积累，或直接危害果穗影响子粒的灌浆，使千粒重下降或使果穗粒数减少。玉米纹枯病构成的产量损失主要由 粒重下降与粒数减少二者构成，且粒重下降在产量损失中的作用更大。玉米纹枯病产量损失与病情严重级别之间存在着显著正相关， 随着病级的 增高， 穗粒数和千粒重下降， 损失率 增大。 农 １ 刀 梁继 （ ９ 报道， ９ 玉米纹 枯病严重度每提高一级，产量损失增加约１％ ０ 左右。始病愈早，相应的产量损失也愈大。房德纯 １ 疮 　　　　７ 辽宁 丰县调查１１亩 （７ ９ 省西 ０６ 玉米平均发病率７． ， ７％ 病株损失 ５ ． ８ 率４％ 减产 ３％ 陈方（ ８） ５。 １６ ９ 报道， 浙江省松阳 县秋玉米纹 枯病发生 情况，１ ３年 ９ 平均发病率 ９４． ， 率９ ％ １ ５ １％ 损失 ． ；　 年发病率７． ， ２ ３ ９ ８ ０ ％ 损失率 ６ ％ 潭复顺等（ ８ 报道， ９７ ８ 达１． 。 ５ １５ ９） １ ８年湖北省鄂西山区纹枯病大发生， 据在株归县调查， 全县 １．万亩玉米发病 ８ ８ ５ 万亩， 成灾１ 万亩，平均发病率 ９． ． ５ ８ ％，高的达 １０ ５ ０％，平均病情指数达 ６． ４ ％，平均损失率 １． ８ ８ ％． ８王 （ ９ 等调 怀训 １ ８ 查的山 省， ９） 东 重病地块发病率高 ０ 以 一 达７％ 上， 般病田 ０ －０ ， 为１％ ５％ 可 －导 致减少 产量 ６ －０ 。 金渝（ ９） ％ １％ 张 （ １ １ 调查的四 省玉米 ９ 川 病害的 发病动态表明 玉米纹 ， 枯病已成为危害玉米最严重的病害，严重田地可引起 ２－０ 的减产损失。 ０３％１ ．３防治措施 ．４ １． １ 、农业防治 选用相对抗耐的品种，适时适量的播种；实行间作、轮作，尽量避免连作重茬，冬季 　　　　提早犁翻晒垫， 并清除杂草残茬，