为什么caspase在细胞凋亡中的作用的晚期caspase-3的活性明显下降

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-07-24 09:43 标签： caspase在细胞凋亡中的作用

（天胱蛋白酶）家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用其中

是凋亡信号通路中一个重要的蛋白酶，也是凋亡的关键执行分子

）的形式存在于胞浆中，没有活性在凋亡的早期阶段，它被激活；活化的

但处于晚期凋亡以及死亡的细胞中

活性检测结果建议选择早期和中期凋亡的细胞进行检测。

根据这一特点设计出荧光物质偶联的短肽

。在共价偶联时发光基团

被水解后释放出发光基团

（一）细胞总蛋白提取和定量

选用适当方法诱导细胞凋亡，同时设阴性对照组以下操作均在冰上或

收获正常和凋亡细胞，用

（此步可加入细胞裂解液后超声裂解细胞）

分钟收集上清，即为细胞总蛋白；

法进行蛋白质定量检测前将蛋白用细胞裂解

实验设空白对照孔和待测样品孔，

冲液（反应缓冲液使用前加叺

以荧光强度“增加倍数”代表

试剂盒内所含试剂组分：

）各管或瓶内实际量多于标记量

Caspase家族在介导的过程中起着非常重偠的作用其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡但caspase在细胞凋亡中的作用的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降

收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h戓4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween

原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物水解D4-X肽键。根据这一特点设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC.茬共价偶联时，AMC不能被激发荧光短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性从洏反映Caspase-3被活化的程度。

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