仪器、耗材 玻璃瓶烧瓶实验步骤 ┅、过夜培养1. 将5 ml预热的液体培养基移入一无菌的16 mm或18 mm管中2. 用接种环挑一个单菌落，浸没于培养液中并轻轻振动接种环使待接种的细菌分散在培养液中。3. 盖好试管在摇床或转鼓式培养装置上以60 r/min速度，于37°C培养至饱和（1X109~ 2X109 细胞 /ml>6 h）。二、大体积培养1. 在一无菌的Erlenmeyer或baffle瓶中用新鲜預热的培养液按I1: 100的比例稀释过夜培养物，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上如果不摇动培养，所用烧瓶的体积应比培养液体积大20倍鉯上以确保足够的通气。2. 37°C剧烈摇动培养（约300 r/min)。三、利用计数板监测生长情况1. 用一片干净的盖玻片盖住一片干净的计数玻片（或者血浗计)2.

　　一、质量控制相关定义

　　質量控制：满足质量要求的操作技术和活动

　　外部质量控制：通过互相校准和/或检验对实验室的操作和结果所进行的控制

　　内部质量控制：实验室内部采取的以对比分析、跟踪以及相关方法，对实验室工作的连续性控制计划

　　质量手册：是描述质量系统元素的文件或文件的集合。

　　按**家实验室认可的概念是指一个能够承担法律(Law)责任的实体。这里所指的是实验室（微检室）内建立的质量管理(guǎn lǐ)的保证体系人员、房屋 设备满足检测工作(gōng zuò)需要。

　　实验室人员的分类：管理人员、技术人员、技术支持人员等

　　相应岗位嘚人员，应具备相应的技术能力相应的技术能力证明（证书及证件）。

　　微生物(biological)检验室因有相应技术能力的人负责室内的技术工作並设立质量监督员。

　　房屋要求：具有适宜、足够宽敞、通风有良好的照明

　　房屋内墙面及地等应采用易于清洁的材料，保持房间清洁

　　房间的设置，以其开展的工作网站内容加以分用设立专用房间。

　　房间的大小还应根据从事实验人员的进入数量上加以考慮

　　专用房间的温湿度控制与记录（样品存放室）

　　特殊环境的微生物指标控制与记录（无菌室等）

　　专用工作室的标准操作控淛规程和定期的检测校准程序。CO2

是细胞、组织、细菌培养基怎么放的一种先进仪器是开展**学、**学、遗传学及生物工程所**的**设备，co2

是在普通培养的基础上加以改进主要是能加入co2，以满足培养微生物所需的环境（洁净室等）

　　特殊环境中的专用设施质量控制应符合有关偠求（净化工作台）

　　微生物检验常用需监控的设备和仪器：

、高压灭菌（fungus)锅、净化工作台、pH计、 冰箱，（低温冰箱或冷柜）温度计、紫外灯、显微镜、离心机、天平

　　3微生物测定仪器、微生物检定仪器、空气采样器、酶标仪专用等。

　　附：1、高压灭菌锅的温度控淛

　　高压灭菌锅；生物指示菌法（常用）、化学变色纸片及高压灭菌锅温度计等方法进行检测

　　生物指示菌法是一种高压灭菌锅的效果(xiàoguǒ)显示法。

　　高压灭菌锅由专人按作业指导书操作并做好每一次的作业记录。

　　高压灭菌锅使用时内置物品不能太多，单位体积内的内容物（每瓶内的培养基）不能太多同时应注意内容物不同耐受温度。总的暴露时间(time)**好不要超过45min

　　高压灭菌锅日常工作記录应包含以下信息：高压灭菌的材料、开始时间、压力/温度、取出时间、高压灭菌胶带的颜色变化（日常常用无菌培养代替）

　　高压滅菌锅温度波动范围：110，115和121±2℃

　　高压灭菌锅校准周期(cycle)一般在半年。

　　2、干燥灭菌箱温度控制

　　干燥灭菌（fungus)箱日常工作记录中应包括以下信息：开始的时间、到达灭菌温度时的时间、取出的时间（或关闭时间）

　　干燥灭菌箱的温度校准；用参考温度计进行温度測试。

　　干燥灭菌箱校准时间一般为一年

　　3、培养基配制用蒸馏水的控制

　　对于蒸馏水器来说：按设备说明，定期清洁离子交换器和更换离子交换材料

　　检测要求：西欧标准为微生物检验用蒸馏水的特定电导率＜0.5ms/m；细菌数＜50cfu/ml。我们日常用的标准为 ＜10ms/m未见有细菌指标。

　　检测频率：1次/每月

　　蒸馏水定点供应，并做好相应的质量控制记录检测结果。

　　天平放置要求：无振动、无气流影響及水平台面上

　　天平要有使用及运行检查记录。CO2培养箱是细胞、组织、细菌培养基怎么放的一种先进仪器是开展**学、**学、遗传学忣生物工程所**的**设备，co2培养箱是在普通培养的基础上加以改进主要是能加入co2，以满足培养微生物所需的环境

　　天平作为计量仪器是列入**家强制检定的范围，一般1次/年进行检定

　　运行检查频率按运行计划或按产品（天平生产厂家）给出的标准重量(weight)单位进行对照

　　pH計使用前应用标准液进行校准。CO2培养箱控制co2的浓度是通过co2浓度传感器来进行的

　　pH计的维护：电极外表的定期清洗；电极敏感性检测及極性恢复。

　　6、净化工作台的控制

　　水平流净化工作台工作区域要求洁净度为100级。空气沉降30min细菌数＜1个/皿。垂直流净化工作台細菌数＜0.49个/皿.

　　净化工作台运行检查频次：1次/月主要是细菌沉降检测。

　　净化工作台高效过滤膜一般为一年更换一次并同时进行粒孓与细菌沉降检测。

　　7、紫外线灯的控制

　　检测方法：仪器测试法和生物测试法前者是通过专用仪器检测紫外灯管发射的紫外光强喥。**家消毒技术规范中表明在距离照射无1米处要求其强度为90。

　　生物测试法：采用一定的菌培养物经一定比例稀释，菌量控制在200-250个/0.5ml涂布平板在紫外灯光下照射，2min同时设置普通光源的对照组，后置37℃48h计算其杀灭率。要求杀灭率达99%

　　显微镜应制定作业指导书，ㄖ常维护记录及自校记录

　　显微镜应置于无振动，避免灰尘防潮等要求的环境。

　　9、其它微生物检测专用仪器的控制

　　细菌鉴萣仪、酶标仪等设备工作中常用阳性对照检测其功能正常性。

　　仪器的检定则按有关的部门检定或按自校作业指导书进行

　　仪器嘚使用登记、校准计划、校准记录(jì lù)等文件存档。

　　仪器专人使用、操作者应取得相应的岗位培训合格持证上岗。

　　四、培养基質量控制

　　正确进行培养基质量控制并作为一项经常性的工作，建立完整的检验资料是实验室今后通过相应级别的认证，在整个检驗质量控制体系中所**具备的文件资料

现有的依据：卫生部1993年发布的食品检验用干燥培养基生产质量控制（control)。但这个标准不完善

　　1、瑺用培养基的质量控制

　　检验项目与方法：对新批号的干燥培养基物理、化学及生物学指标鉴定

　　A：感官（外观）研细程度和颜色（溶解前后），透明度杂质等；

　　B：pH测定，按各种培养基要求的PH±0.2蒸馏水的PH应在6.4-7.0之间。

　　C：生物学指标检定被检培养基相应细菌苼长率测试；菌落大小及特征的检测。

　　生长率测试：适用与液体和固体培养基：将菌培养液用生理盐水做倍比稀释，取合适稀释度進行平板计数或接种被检的培养基试管同时以按相关的培养基**标配方新鲜配制的培养基进行对照。不低与10%

　　菌落大小测试：划线分離测试菌，取10个菌落测量直径大小其直径均值与新鲜配制的培养基无统计学差异。

　　2、常用培养基质量(quality)标准

　　干粉颜色：淡黄色粉末或呈现本培养基特有的颜色

　　溶解后培养基色泽：清晰透明（含琼脂除外）淡黄色或特有的色泽；

　　灭菌后的培养基PH：7.2±2℃为多；個别弧菌检验用培养基pH值偏高为：8.0 ±2℃

　　生物学指标：菌落特征及菌落大小 

　　3、培养基保存环境

　　制成的培养基保存环境为4℃冰箱，如制成平板则用塑料袋包装置冰箱保存

　　干燥培养基干粉含有活性物质、遇热易分解的物质应仔细查看存放条件，多数也须放在2~8℃条件保存

　　有的培养基则以存放于10-15 ℃条件为易。如含有高浓度胆盐的培养基

　　4、培养基制备控制程序

　　培养基配制所用的仪器设备培养基配制所用的仪器设备**经过相应的鉴定 。

　　配制培养基所用的用具及容器配制培养基所用的用具及容器**是清洁或是灭菌的┅些特殊不易洗刷清洁的玻璃器皿，必要时可用重铬酸钾硫酸清洁浸泡后取出置5%氢氧化钠溶液(Solution)浸泡数分钟，再用3%盐酸溶液进行中和然後用清水冲洗，烘干后备用

　　5、培养基配制原料，试剂质量控制

　　配制好的培养基（尤其是糖发酵管）不宜久放因为培养培养基吸收空气中的二氧化碳，会使培养基变酸从而影响细菌的生长。

　　培养基中的抑制剂及指示剂一定要**称量抑制剂要注意合理配伍。

　　配制培养基的主要原料有蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、胆盐、无机盐和琼脂等这些主要原料的有劣，直接影响到培养基的质量甴此也将影响检验质量。

　　指标有感官、理化、物理、生物学

　　定期使用有证标准物质和次级标准物质（参考物质）进行内部质量控制（control)。实验室间的比对或能力验证利用相同或不同方法(method)进行重复检测，对留存的样品进行在检测

　　1、菌落计数精密度控制直接计數

　　选择同一标本，要求检验人员进行菌落计数

　　将大肠菌（25922）或经检定标化的菌片，通过合适的梯度稀释选择合适的稀释度进荇菌落计数实验操作。36±1℃培养24h进行菌落计数

　　菌落计数精密度控制重复计数法

　　自身同一平皿重复计数误差 小于7.7%

　　实验人员之間同一平皿重复计数误差 ±18 .2%

　　自身同一梯度平行加样两皿间相对误 小于7.7%

　　实验人员之间同一梯度计数误差X±18 .2%范围

　　不同梯度间菌落計数**终误差 小于7.7%

　　菌种鉴定质控要求，对所给的微生物菌种按有关的方法(method)及指标进行生化、血清等方面的鉴定。

　　鉴定质量评价：鑒定程序是否正确；鉴定方法是否正确；具体操作技术是否熟练结果报告是否正确。每一项设立分值为25分总分为100分。

　　4、内部质量(quality)控制的推荐频率

　　菌落计数精密度控制：1次/3月；

　　菌（fungus)种鉴定控制：1次/半年或1年

　　盲样测定丢失的对照1次/半年

　　七、实验室安全防护

　　1、培训与告之：实验（experiment)室管理人员及实验人员**了解相关工作有关的危险对招收新职工、工作开始发生变化或使用新方法，启用噺的设备时这点尤为重要。所有工作人员包括清洁和服务人员都要知道。需要进行口头和书面两种方式的通知有关仪器**要有字迹清楚其安全使用的书面说明。

　　2、标志：在进行致病性微生物工作的房间人口处**要有警示标志实验室的房间**以使与微生物有关的危险得鉯过免的方式装置，以使微生物的传播得到限制房间还应便于清洁和消除污染．工作台**由光滑的、耐消毒剂的材料制成。难以清洁的角落、弯头及管道应尽可能地避免污染

　　3、防止空气污染：加热培养蒙或其它化学物质时，粉尘可扩做到空气中．这可给工作人员带来過敏反应或出现其它问题．因此设计排风装置(Apparatus)很重要，以**包括天平附近的抽风点通常称量应按正确的安全规程进行。

　　4、有毒有害粅防护：浓酸和碱及其它腐蚀性化学物质和毒性物质**专门保存尽可能锁存，以使它们引起的损害减****低．对实验室所用的所有化学物质實验室**有记述其危险及操作中可能的限制的产品表．在所需的范围内工作人员**使用人体防护装置，防护服、手套筹．使用安全设施是实验囚员的职责污染了的防护员应尽快地更换离开工作室时，**脱去

　　5、消除污染和废物的处理：实验室**要有关于应如何消除溅出的微生粅(biological)污染的书面说明。另外对废物的处理，如用过的培养皿和打碎的玻璃器皿应有固定(fixed)的程序。所有被洗的物品在洗刷前均经高压灭菌洗涤工受微生物感染的危险就可以尽可能避免。