又称。或中的粒子或在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的（在干凝胶中也可以是），这样一种特殊的称作凝胶。没有。内部常含有大量液体。例如血凝胶、的含水量都可达99%以上。可分为和脆性凝胶。弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新，例如等。脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时，形状和体积都不改变，例如等。由溶液或溶胶形成凝胶的过程称为（gelation）。生物学和凝胶　　生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。
　　1.测定――分子量、PI
　　当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH.
　　2.选择――层析方法
　　若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
　　一] 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。
　　二] 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。
　　三] 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。
　　3.纯化――大量粗品
　　处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。
　　4.纯化――硫酸氨样品 硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。
　　5.纯水――糖类分子
　　固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。
　　6.纯化――膜蛋白
　　膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。
　　7.纯化――单抗、抗原 *单抗多为IgG.来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG.血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG.重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。
　　*疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG.宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
　　*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。
　　*HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM.HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY.
　　8.纯化――重组蛋白 重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
　　一] GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
　　2. 蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF纯化。
　　二] 含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。
　　9.纯化――包涵体蛋白
　　包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。
　　10.包涵体蛋白固相复性 *近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。
　　*固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。
　　11.纯化――中草药有效成分
　　中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成份多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
　　*生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
　　*一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。
　　12.纯化――肽类
　　肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。医学都市多功能
　　13.纯化――核酸、病毒
　　核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、 SOURCE Q分离核酸。
　　14.纯化――寡核苷酸寡酸苷酸多应用在反义（anti-sense）DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。
　　15.脱盐、小分子去除
　　使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%.只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting（5ml）可用针筒操作。HiPrep Desalting（26ml）可在数分钟为多至10ml样品脱盐。
　　16.疫苗纯化 使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗，去除培养基中的杂蛋白，处理量可大于床体积10%.柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
　　17.抗生素聚合物分析
　　中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。
　　18.纯化-基因治疗用病毒载体
　　SORRCE 15Q
　　19.纯化-基因治疗用质粒
　　Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游纯化中，可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时，去除各种污染物。
　　1.去除――内毒素
　　内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。
　　内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒（17-1349-01）可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。
　　内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。
　　利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL，PMB，自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。
　　2.去除――蛋白中的核酸
　　大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。
　　胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL结合目标蛋白，可除去大量核酸。
　　核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的同时去除核酸。
　　利用核酸酶将核酸切成小片断，用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。
　　3.去除――病毒和微生物
　　病毒和微生物可成为病原，应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
　　病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D（solvent/detergent）处理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋白，去除S/D.
　　其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活，凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质，SOURCE都是很好的精细纯化介质，可去除多种微量污染物。
　　凝胶是指大小在1埃到10埃之间的。高分子溶液和某些溶胶，在适当的条件下，整个体系会转变成一种弹性的半固体状态的稠厚物质，失去流动性。这种现象称为胶凝作用,所形成的产物叫做凝胶或冻胶.
　　“”是指为的，如：，等，“固凝胶”有等，“液凝胶”就是呈的胶体，如胶体 。
　　食品级（Gum Konjac-GM）
　　葡甘露胶（又称：）系一种新型多用途微粒状可。这里推出之葡甘露胶是以优质中提取的葡萄甘露聚糖为原料，经脱杂处理后采用先进技术加工而成，其中添加成分不含任何非食用化学配料或色素。与传统的琼脂、、等相比，葡甘露胶在膨胀率、粘度、增稠、稳定性及使用方便程度上皆显著优于上述胶类，此外尚具有特殊的优点：无需添加任何，在无糖、低糖或高糖条件下，在酸性、中性或碱性条件下，常温即可凝冻，凝胶性能理想；保持或强化了葡萄甘露聚糖所具有的降糖、降脂、减肥等保健功能，大大拓宽了魔芋应用的范围；价格低廉、使用方便。
　　葡甘露胶能广泛用于、、、日用化工、科研等领域，作为琼脂、果胶、海藻胶等的替代产品，价格低廉，且使用时无需改变原有的设备及，能大幅度降低添加剂的使用成本，是一种理想的新型凝胶添加剂。为满足不同产品开发的需要， 一、凝胶（果冻）型：能与各种天然果汁、及良好混合，作为广谱凝胶赋型剂，是制作、水晶软糖等的极佳原料，也可作为培养基支持体，且不需再添加其它任何胶类或成份；凝胶条件随意、脱杯完整，凝胶高、韧性大。 用量：0.7～0.9%。用法：在适量温水中溶胀3～5分钟，煮沸冷至70度左右时加入及各种，冷却至室温即成。
　　二、培养基型：用作替代琼脂作为及其它进行组织培养的。组培苗根粗、苗壮，使用效果理想，成本大幅降低。用量：0.5～0.6％。用法：在温水中溶胀3～5分钟，煮沸后冷却即可。 三、果肉（茶）饮料型：作为与悬浮剂，替代琼脂和等，广泛用于粒粒橙、、、、、等异相等（或混合）饮料中，防止沉淀或分层。 用量：0.15～0.25％左右。用法：在适量温水中充分后加入物料中。 四、冷冻制品型：用于、等各种冷冻制品，可增大膨胀，减少，提高抗热融性，使产品更加爽口。 用量：0.15～0.25％左右。用法：在适量温水中充分溶胀后加入物料中。 五、增稠型：用于、、制品中，可增大，提高，改善赋型和口感。是进口洋槐豆胶的理想替代物。 用量：0.2～0.3％左右。用法：在适量温水中充分溶胀后加入物料中。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
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蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析　　阅读(244)
蛋白纯化试剂盒主要是利用蛋白与亲和介质的亲和能力不同达到蛋白分离纯化的目的。蛋白纯化试剂常见的蛋白标签有GST标签、HIS 标签等，本文主要介绍了蛋白纯化试剂盒的原理、His Tag 蛋白纯化方法试剂选择的方法、GST 标签融合蛋白纯化问题分析等。蛋白抽提试剂盒和蛋白纯化试剂盒用途有什么不同?蛋白抽提试剂盒是从细菌 、真菌、新鲜动植物组织或细胞蛋白、培养动植物组织将全细胞蛋白、核蛋白、胞浆蛋白、化学修饰基团的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一种或两种以上作为目标从样品中分离收集的一套试剂。用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等目的。蛋白纯化试剂盒用于将连接有Flag标签 GST HIS 标签的重组蛋白、包涵体蛋白、抗体从重组蛋白表达系统中高效浓缩分离出来。主要原理是利用蛋白A或蛋白G与抗体的不变区有多个结合位点或Ni-Sepharose与HIS标签蛋白在不同缓冲液条件下亲和能力多得多差异分离目标蛋白。将蛋白A与Sepharose共价交联制备的层析介质，可以用于纯化抗体。抗体与蛋白A或蛋白G在高盐高pH值条件下结合，在低盐低pH值条件下解离。蛋白纯化试剂盒广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。GST常见问题解答集锦纯化方法的问题解决以下解决问题的指南指出了对于大多数纯化方法的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有 提及,这种情况下会指出相应的纯化方法.GST标签蛋白被机械裂解的方法 & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件. & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 裂解的条件 不结合柱子或 变性(比如超声).过分的裂解必须依照经验来决定. 结合非常弱会使标签蛋白变性,阻止其结合. GST标签蛋白在样品中有聚集,在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT.1-20mM 导致沉淀 标签蛋白的浓度过低的DTT会显著增加某些GST蛋白的结合. 浓缩样品.结合能力是浓度依赖的.低表达量的蛋白可能 不会像高表达量蛋白那样有效地结合柱子.因此,浓缩样 品会提高结合. 标 签 蛋 白 可 能 改 变 了 G S T 的 构 检测所使用的pGEX载体中GST的结合.准备带有所使用的 象,因此降低了GST标签蛋白的 pGEX的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合.如果结合 结合能力. 的很好,则可能是标签蛋白改变了GST的构象,因此降低了 GST标签蛋白的亲和力.可以通过降低结合的温度到4&C限 制洗涤来改善结果. 平衡时间太短 确认柱材至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过 (比如PBS). GST标签蛋白在pH值低于6.5和高 在净化好的样品上样前用pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如 于8时结合效率低 GSTrap柱:柱子需要清洗 PBS). 根据标准的清洗步骤清洗柱子(见附录2).如果GSTrap柱 已经用过几次了,可能需要换用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用 使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗过程请见附录 次数过多 样品上样过程中的流速过高 2) 降低在上样时的流速.影响GST标签蛋白结合的一个重要参 数就是流速.由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上 样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根据说明书清洁柱子,确认样品已经离心或 柱:柱子或系统被堵住了,导致 用0.45m的滤膜过滤过了. 高压力和无结合. 系统堵住了:将柱子换成一段管子.如果压力高于 0.3MPa,根据手册清洗系统 在KTAprime plus上的GSTrap 检测是否使用了正确的柱子. 柱:样品不结合 检测流入管是否接入了正确的流入端口. 检测缓冲液的组成和pH值是否正确.检测样品是否已经被 调节到适合结合缓冲液的条件.1G S T 标 签 蛋 白 洗脱缓冲液的体积不够 不能被高效的 洗脱 洗脱的时间不够增加洗脱缓冲液的体积.有些情况下,尤其是柱上酶切有 标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白. 通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间. 对于gstrap柱,为了获得最好的结果,在样品上样时,用 0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流 速(5ml HiTrap柱).对于离心方法,降低洗脱过程中的离 心速度.谷胱甘肽的浓度不够增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外.尝试 使用50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0作 为洗脱缓冲液.洗脱缓冲液的pH过低增加洗脱缓冲液的pH值:将pH增加到8-9会增强洗脱而不 用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度.洗脱缓冲液的离子强度过低.增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.10.2M的氯化钠也会使结果变好.洗脱缓冲也中的谷胱甘肽被氧化 使用新鲜的洗脱缓冲液. 了 加入DTT.非特异的疏水相互作用导致蛋白 向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂.加入1%的TritonX-100 和柱材非特异的结合或聚集,从 或2%的n-octylglucoside可以显著提高某些GST标签蛋白的 而 阻 止 了 标 签 蛋 白 的 溶 解 和 洗 洗脱. 脱. 电泳或蛋白质 分子量为70 000 的蛋白与GST标 分子量为70 000 的蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的产物. 免疫印迹检测 签蛋白共纯化 发现多条条带 该蛋白参与大肠杆菌中蛋白质折叠.有报道这种相互作 用可以通过上样前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37&C温浴10分钟而破坏.或者把有标签 蛋白通过ATP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层 析来除去. 标签蛋白被蛋白酶部分降解 加入蛋白酶抑制剂.多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白 酶部分降解的结果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能会 使结果变好.一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC.注:丝氨酸 蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一种经典的丝氨酸蛋白酶.经GE Healthcare检测,它对很多蛋白酶抑制剂不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的话使用Pefabloc SC.2在宿主细菌中的蛋白降解用一种蛋白酶缺失型宿主:多条带可能是在宿主细菌中蛋 白酶切造成的.如果是这种情况,或许需要蛋白酶缺陷型 菌株(比如lon-或ompT).大肠杆菌BL21随pGEX载体提供. 这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株.在机械裂解过程中细胞破碎降低裂解时间:细胞裂解表面上是使悬浊液部分澄清,可 以通过镜检检测.机械裂解前加入溶菌酶(0.1倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好.避免发泡,因为这可能使标签蛋白 变性.过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯 化.分子伴侣可能被共纯化了包括额外的纯化步骤:多余的条带可能由于共纯化一些分 子伴侣所造成.这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋 白的正确折叠.这些包括,但不仅仅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些从这些共 纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表.抗体和很多种大肠杆菌中的蛋白 抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应:取决于抗GST抗体的来源. 反应 它可能包含一些抗体,这些抗体与标签蛋白样品中的大肠 杆菌蛋白能够反应.通过和大肠杆菌的超声裂解物反应来 除掉那些能够交叉反应的抗体.GE Healthcare的GST抗体已 经和大肠杆菌蛋白进行过交叉吸附,并检测证明其在蛋白 质免疫印迹中没有非特异条带. 目的蛋白酶切 蛋白酶切发生在宿主细菌内 后电泳检测发 现多条条带 检测条带何时出现:确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.这些条带可 能是在宿主细菌中降解的结果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子 Xa的切割位点,检查序列.细节请参见《GST基因融合系统 手册》.His Tag 蛋白纯化方法之选择全攻略HisTag 蛋白纯化篇：用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才 能实现最终目的。相比核酸纯化来说，不同的蛋白质特性千差万别，纯化条件很难摸索，想 找一种通用的纯化方法一直是个难题。 将目的蛋白和一个亲和纯化短标签进行融合表达， 通 过亲和纯化 Tag 蛋白来纯化目的蛋白，是我们常用的间接手段。 用于融合表达的亲和纯化蛋白标签，首先个子越小越好，这样不会对目标蛋白的构象、大小 和特性产生显著影响，方便直接对融合蛋白进行下游操作;以前常用的融合表达亲和标签 GST(谷胱甘肽转移酶)个子就比较大，在纯化后需要先切除标签后才能进行下一步的检测分 析。其二生理条件下带电越少越好：需要借助融合表达纯化的许多蛋白通常在生理溶液 pH 下进行分析研究或者复性，融合标签带电少，对蛋白质的表达、分泌、折叠、构象形成等影 响小，比较容易得到和天然蛋白相似的产物。第三融合标签的免疫原性越少越好，融合产物 不必除去标签可直接作为抗原免疫 横看竖看，6xHis Tag 都是比较理想的，6 个组氨酸个子小，pH8 是不带电，免疫原性差， 利用优质的带镍离子的纯化填料进行亲和纯化，目标蛋白纯度高，方法简单方便，成本低， 已得到国内外研究人员的广泛应用。想当年刚进实验室时,表达 6xHis 的 HisTag 还算&前 卫&技术(表达纯化一个带有 HisTag 的&有重要意义和光辉前景的&蛋白就可以混个硕士 毕业)，如今早成主流了。 我们生物通技术专题早前的表达系统专题中已经介绍过多种带有 His-Tag 的表达载体， 表达 之后自然需要考虑如何纯化，市面上纯化 HisTag 的产品多种多样，应该如何选择呢?目前 市面上主产品都是利用 His.Tag 序列相邻组氨酸和固定化金属镍离子的亲和力来进行纯 化。 金属镍离子被螯合到固相支持物共价结合的反应性基团上， 当融合蛋白溶液流经亲和纯 化介质时，融合蛋白被特异亲和吸附，杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白。最常用的螯合物包括 氮川乙酸(NTA)和亚氨二乙酸(IDA)，它们分别具有四个和三个与金属离子相互作用的位 点。生物通在这里介绍几个市面口碑较好的产品和方法,包括常见的 HisTag 纯化高端品牌： Qiagen，GE，Novagen 等。 Qiagen 产品的 2 大特点是 4 价螯合的 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid);以及种 类齐全。Qiagen 专利的 4 价螯合的 Ni-NTA 纯化填料，由于镍离子通过 4 价键螯合在纯化树 脂(填料)上，比 3 价的 Ni-IDA 要稳固且不容易脱落，且 NTA 与还原二硫键的 beta- 巯基乙 醇相容;而存在其它螯合或还原成分时， IDA 树脂的金属镍离子容易脱落可导致纯化结果 不甚理想。因此 Ni-NTA 实际应用中的蛋白纯化效率和得率较高。因于这种稳固性，Qiagen 的 Ni-NTA 纯化介质不单可用于纯化带 HisTag 的表达产物， 还可以作为固定介质用于研究蛋 白质间的相互作用或者蛋白质和核酸间的相互作用、 研究蛋白质受体和配基的相互作用、 甚至用于纯化与融合蛋白相互作用的其他蛋白或者核酸。Qiagen 的 Ni-NTA 纯化介质产品种类最为齐全，设计非常细心体贴，不过花太多，就容易眼 花缭乱，我们说花多眼乱。Qiagen 的目录里是根据纯化实验的规模分为大、中、小规模， 具体又分为高通量和手工纯化等区别， 对于急着寻找自己需要产品的人来说自然便捷; 不过 作为生物通的技术专题文章， 我个人来说更愿意按照介质种类的不同来介绍， 因为理解了材 料的区别，一切都清晰明了，就能更深入了解不同品牌、不同类型、不同产品的特色。 Qiagen 的 Ni-NTA 系列产品可分为 4 类：Ni-NTA 琼脂糖、Ni-NTA Superflow、Ni-NTA 磁珠、 Ni-NTA 离心柱(Spin Column)。 昔年做销售时 Ni-NTA 琼脂糖是最多人买，因为价格相对便宜，质需要将澄清的裂解液(或 者离心或者过滤)直接上柱，洗脱，就可以一步纯化出带有 His Tag 的融合蛋白。这个目标 蛋白载量 10mg/ml 左右，介质是 Sepharose CL-6B，最大流速是每分钟 1 毫升，可耐受的最 大柱内压 2.8psi(0.2bar)，适合自己装重力流常压液相层析柱，可以根据每次实验目标蛋 白的含量来调整纯化填料的使用量和装柱的长度，比较灵活避免浪费。不过但凡客户问到， 我都愿意推荐 Ni-NTA Superflow。Ni-NTA Superflow 介质是高度交联的琼脂糖凝胶，同样 只需一步就从澄清的细菌裂解物中纯化得到带有 HisTag 的融合蛋白，可以耐受天然或者变 性条件，包括 8M 尿素，或者 6M 盐酸胍，还可以耐受 20mM 的巯基乙醇或者 10mM 的 DTT 等还 原剂。除此之外，Ni-NTA Superflow 可以耐受更高的压力(140psi,10bar),流速更快(最 大可达到 20ml/min)，可以上快速蛋白液相色谱(FPLC)，载量达到 20mg/ml。我们都知道 做蛋白纯化是非常考耐性的工作， 如果是自己装稍微长些的重力流柱， 整个纯化过程无比漫 长。流出的速度过快不单影响结果，还会损害纯化柱子。选择速度、耐性和强度都更加出色 的 Ni-NTA Superflow 自然更好些。两种填料都可以耐受很宽的 pH 范围(pH3-12)，如果处 理时间在 2 小时内，都可以耐受 pH2-14 而保持稳定。 纯化填料虽然在使用上比较灵活节约， 可以根据实验中目标蛋白的大概含量来调整装柱的填 料多少，不过装柱始终是个麻烦事，速度慢不说，有气泡、有裂缝、干柱等等意外就会前功 尽弃， 每次装柱的差异都有可能影响结果的重复性。 散装填料更适合那些专门做纯化或者蛋 白纯化经验非常丰富的高手。Qiagen 很快意识到，对于多数实验人员来说，更重要的是利 用先进的实验工具或者方法快速得到实验结果，而不是反复练习实验技能。于是，Ni-NTA Superflow 预装柱上市了。这种预装 1ml 或者 5ml 的柱子保留了填料的大部分优点，省掉了 自装柱子的麻烦， 最重要的是令实验能得到更好的重复性。 预装柱既可以适配于多种型号的 快速蛋白液相色谱仪或者蛋白纯化工作站， 也可以利用注射器进行手工操作。 优化的 Ni-NTA Superflow 预装柱的再生非常方便， 仅需要用 NaOH 流过处理 30 分钟即可再生使用。 离子 Ni 结合相当牢固，就算多次再生后，偶然发现纯化效果下降需要用镍离子重新螯合填料，其操 作也相当简便。 除了 Ni-NTA 琼脂糖、 Ni-NTA Superflow， 另外一个好用的是 Ni-NTA 离心柱 (Spin Column) 。 这个 Ni-NTA 离心柱(Spin Column)和核酸纯化的小离心柱很象，不用慢慢等它一滴一滴 流， 也不要特殊的豪华仪器， 只要离心机就够了， 真的非常方便。 每个柱子载量是 150 微克，特别适合研究的初期阶段时小量纯化做快速的检测分析。 毕竟， 要做到摸条件大规模纯化蛋 白的，还远着呢，花那工夫不如早点出结果哦。 至于 Ni-NTA 磁珠，那是为高通量快速纯化多个微量样品的机器而准备的，因为纯化过程中 需要吸附、洗涤、洗脱等多个步骤，利用磁珠在磁场中的悬浮就可以很方便的进行这些步骤 而避免抽滤，减少抽滤对蛋白产物的影响。Ni-NTA 磁珠最好配合 Qiagen 的纯化工作站，对 于是手工操作就没有多少意义。蛋白纯化试剂盒需要有目标蛋白有亲和纯化标签，例如：HIS（组氨酸标记）、GST(glutathione Stransferase )，利用亲和纯化介质与蛋白间的相互作用，达到了分离纯化蛋白的目的。生物帮蛋白纯化试剂盒产品推荐：GST标签纯化试剂盒（高通量）、组氨酸标记纯化试剂盒（高通量）、组氨酸标记纯化试剂盒、磷酸肽纯化试剂盒、链霉素标签亲和纯化试剂盒、T7 标签纯化试剂盒、自动蛋白质纯化试剂盒（磁珠）、免疫球蛋白G纯化试剂盒（蛋白A）、免疫球蛋白G纯化试剂盒（蛋白G）、其他抗体纯化试剂盒。
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