[发明专利]除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途有效
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按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31(Z31)的幼胚与本发明第九实施例中3所述的农杆菌共培养，以将本发明第九实施例中1和2构建的重组表达载体DBN-HT120066和DBN-HT120066N中的T-DNA(包括玉米Ubiquitin1基因的启动子序列、优化DMT66核苷酸序列、天然DMT66核苷酸序列、AtCTP2叶绿体转运肽序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了定位于叶绿体的转入优化DMT66核苷酸序列的玉米植株(Zm叶绿体mDMT66)和定位于叶绿体的转入天然DMT66核苷酸序列的玉米植株(Zm叶绿体DMT66)；同时以野生型玉米植株作为对照。对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将DMT66核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD660＝0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。2、用TaqMan验证转基因玉米植株分别取Zm叶绿体mDMT66和Zm叶绿体DMT66的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PMI基因的拷贝数来确定转基因玉米植株的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。检测PMI基因拷贝数的具体方法如下：步骤11、分别取Zm叶绿体mDMT66、Zm叶绿体DMT66和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μL；步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：以下引物和探针用来检测PMI基因：引物5：CCGGGTGAATCAGCGTTT如序列表中SEQ ID NO:23所示；引物6：GCCGTGGCCTTTGACAGT如序列表中SEQ ID NO:24所示；探针1：TGCCGCCAACGAATCACCGG如序列表中SEQ ID NO:24所示；PCR反应体系为： 所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μL，100μM浓度的探针50μL和860μL 1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。PCR反应条件为： 利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。实验结果表明，优化DMT66核苷酸序列和天然DMT66核苷酸序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且Zm叶绿体mDMT66和Zm叶绿体DMT66均获得了含有单拷贝DMT66基因的转基因玉米植株。第十一实施例、转基因玉米植株的除草剂抗性效果检测将Zm叶绿体mDMT66、Zm叶绿体DMT66和野生型玉米植株(V3-V4时期)分别对麦草畏进行除草剂抗性效果检测。分别取Zm叶绿体mDMT66、Zm叶绿体DMT66和野生型玉米植株的T1代杂合植株(v5-v6期)，并用麦草畏除草剂(4480g ae/ha，8倍大田浓度)和空白溶剂(水)喷洒。喷施21天后统计支撑根发育情况。Zm叶绿体mDMT66 共3个株系(S1、S2和S3)，Zm叶绿体DMT66共2个株系(S4和S5)，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选10-15株进行测试。结果如表2所示。表2、转基因玉米T1植株除草剂抗性实验结果表2的结果表明：优化DMT66基因赋予转基因玉米植物麦草畏除草剂的高水平耐受性(由于单子叶植物本身对麦草畏除草剂具有一定抗性，因而表现出高水平抗性)；相比于Zm叶绿体DMT66，Zm叶绿体mDMT66能够产生更高的麦草畏除草剂耐受性，表明所述DMT66基因经植物密码子优化可以增强玉米植物对麦草畏除草剂的耐受性；Zm叶绿体DMT66具有中等程度的麦草畏除草剂耐受性；而野生型玉米植株则不具有麦草畏除草剂耐受性。综上所述，本发明DMT66基因可以降解麦草畏除草剂，优化DMT66基因采用玉米和大豆的偏好密码子，使其特别适合在植物中表达；优化DMT66基因可以赋予转基因植物更好的麦草畏除草剂耐受性，且相比于在胞质中表达，所述优化DMT66基因定位于叶绿体中表达可以增强转基因植物对麦草畏除草剂的耐受性；同时本发明除草剂耐受性蛋白质DMT66为好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶，其不同于已知的麦草畏耐受型基因，因此可以扩大麦草畏耐受型在植物上应用范围。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
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题名: 耐旱苔藓植物DNA提取及优化RAPD、ISSR反应体系的建立
期号: 5关键词:
中文摘要: 耐旱苔藓植物常常单个个体矮小、生物量低,如何从细小的单个个体中有效提取总DNA是进一步开展居群遗传多样性研究的关键。本研究以古尔班通古特沙漠广泛分布的刺叶墙藓(Tortula desertorum)为对象,使用快速提取法、2×CTAB法及DNeasy plant mini kit试剂盒提取法等3种方法对刺叶墙藓单个个体的总DNA进行提取。结果表明,2×CTAB法提取的DNA纯度高,凝胶电泳显示无明显降解现象,适宜作为PCR扩增的模板。利用所提取的单个个体DNA为模板,建立了优化的RAPDI、SSR反应体系。
语种: 中文
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张道远;张元明;曹同;. 耐旱苔藓植物DNA提取及优化RAPD、ISSR反应体系的建立,中国沙漠,2006,(5):
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