人咸味觉受体和调节咸味感觉的方法
专利名称人咸味觉受体和调节咸味感觉的方法
交叉参考相关申请本申请要求对日提交的美国临时申请60/853,290(以其全文和为所有目的通过引用合并入本文)的利益。
本发明总体说来涉及细胞生物学领域。更具体地，本发明涉及钠离子通道和它们在人中识别咸味的作用。
在整个本说明书中引用于各种公开物，包括专利、公开的申请、技术论文和学术论文，这些引用的公开物中的每一个以其全文和为了所有目的通过引用合并入本文。
钠在身体的新陈代谢中起着非常重要的作用，除其他以外，包括电脉冲传递(electrical impulse transmission)和流体及电解质动态平衡(fluid and electrolyte homeostasis)。此外，钠促成动物特别是人摄入的各种食物的风味(flavor)的发生和稳定性。钠离子可抑制一些刺激物的苦味，从而改变食物的味道。钠对苦味的该抑制作用不依赖于含钠离子化合物的咸性(saltiness)，而是取决于钠离子的浓度。
然而，钠的过度摄入已牵涉多种疾病状态，包括胃癌和高血压。高血压是心脏病、卒中和肾病的主要风险因子。由于过度钠消耗的潜在负面健康影响，美国FDA推荐成年人将他们的摄入限制至少于每天2400毫克钠。然而，美国人通常远超过该推荐的容许量。由此，许多医学和科学研究小组已推荐强烈的钠摄入减少。
为了帮助实现减少钠摄入的目标，已开发了许多的咸味模拟物和咸味增强剂。通常，此类模拟物未证明具有商业存活能力，因为它们缺少氯化钠的纯净咸性，并且大多数不能象盐那样影响食物的风味。
咸味的模拟物(通常称为盐替代品)的不足反映了味觉受体的极端的结构特异性。就目前所知，只有氯化钠(NaCl)和氯化锂(LiCl)赋予真正的咸味。更重的阴离子与Na和Li配对和更重的阳离子与Cl配对都倾向于苦味。阳离子特异性暗示着离子通道，而氯离子效应暗示着细胞旁支路。此外，NaCl赋予咸味时的浓度高于50mM，其为受体过程的高端浓度。这两个观察-对于Na和Li的特异性和有效浓度范围-据认为是发现人中咸味觉的机制的关键因素。
在过去的二十年中，许多关于在特异性抑制剂和增强剂存在或不存的情况下盐诱导的神经活性的变化的定性和定量研究已导致这样的推测，即上皮钠通道(ENaC)用作咸性(saltiness，也有时称为“盐性”)的主要受体(Brand等人(1985)Brain Res.；Feigin等人(1994)Am.J.Physiol.266(Cell Physiol)C1165-72；和Brelin等人(2006)Adv.Otorhinolaryngol.63152-90)。虽然ENaC用作许多实验动物的盐感染器(Halpern、BP(1998)Neurosci.Biobehav.Rev.23(1)5-47)，但未出现这对于人类也是这样的明确证据。值得注意的是，阿米洛利不能在人中抑制盐诱导的咸味反应表明ENaC不参与人咸味识别，至少达不到在其他动物中观察到的程度。
因为人和动物模型之间的该差异，人中咸味感觉背后的转导机制仍在研究中。神经的充分激活最终激起在高级皮质区(highercortical area)的咸性感觉(Schoenfeld、MA等人(2004)Neuroscience.)。
由于许多啮齿类动物的味觉细胞显示的对阿米洛利的强烈反应，这些细胞中的ENaC被认为主要位于顶膜，高于紧密连接的水平。该定位使它们对药物例如阿米洛利的作用易感。有人认为阿米洛利不能通过紧密连接。在顶膜增加直接机制(direct mechanism)是进入低于紧密连接水平的味蕾的基底外侧区域的细胞旁支路(Mierson，S等人(1996)J.Neurophysiol.)。因为钠可通过紧密连接，因此细胞旁机制应当导致对阿米洛利不敏感的咸味反应。人咸味反应可以是阿米洛利-不敏感的，因为绝大多味觉细胞ENaC位于这些紧密连接的下面。可能存在咸味感觉的其他机制。这些机制可与ENaC完全不同，或由于钠装载(sodium load)或激素而引起的ENaC的备选表现影响ENaC的表达或组成。
ENaC包括在上皮中介导钠渗透的阳离子通道蛋白的家族(Mano，I等人(1999)Bioessays 21568-78)。表达克隆最初显示存在3个同源基因，各基因编码通道的3个亚基中的一个-即、alpha(α)、beta(β)和gamma(γ)(Canessa、CM等人(1994)Nature)。所有3个亚基的共表达对于最大Na+通道活性是必需的，虽然α亚基本身产生少量电流。第4亚基，delta(δ)稍后被克隆，并且显示结构和功能与α亚基相似，虽然具有低30倍的对阿米洛利的亲和力(Waldmann等人(1995)J.Biol.Chem.)。该更低的阿米洛利敏感性据认为反映在称为PreMR2序列的基序上。ENaC的跨膜拓扑学包括两个侧翼于长细胞外环的疏水跨膜结构域，和细胞内氨基端和羧基端。ENaC的亚基计量化学可以是种特异性的和组织特异性的，因为存在鼠中α2βγ配置(Firsov等人(1998)EMBO J.17344-52)和人中(α)1β(1)γ(1)排列(Staruschenko、A(2005)Biophys.J.)的证据。
为了提高的卫生和健康，需要减少盐的摄入。该需要必须与对钠的味道的渴望和和钠赋予食物中改进的风味的能力平衡。减少饮食钠而不牺牲钠的风味的一个吸引人的方法是使用咸味调节剂。因此，存在对建立咸味感觉的永久受体和鉴定咸味感觉的调节剂的手段的需要。
本发明提供了分离的人咸味觉受体，其包含至少一个β多肽亚基、至少一个γ多肽亚基和至少一个δ多肽亚基，其中所述δ多肽亚基包含SEQ ID NO12的氨基酸序列。在一些方面，δ多肽亚基具有SEQ ID NO9的氨基酸序列。还提供了分离的人咸味觉受体，其包含至少一个α多肽亚基、至少一个β多肽亚基、至少一个δ多肽亚基和至少一个γ多肽亚基。
本发明还提供了用于鉴定上皮钠离子通道的调节剂的方法。此类方法包括在脂膜中装配至少一种上皮钠离子通道(其中上皮钠离子通道包含至少3个类型的亚基，其独立地是α亚基、β亚基、γ亚基、δ亚基和ε亚基)；在钠离子或锂离子存在的情况下将离子通道与受试化合物接触；和测定与受试化合物不存在的情况下上皮钠离子通道的生物活性相比，上皮钠离子通道在受试化合物存在的情况下的生物活性的调节。脂膜优选是人工膜。
在一些方面，上皮离子通道包含一个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在其他方面，上皮离子通道包含一个α亚基、一个β亚基、一个γ亚基和一个ε亚基。在其他方面，上皮离子通道包含两个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，上皮离子通道包含三个α亚基、三个β亚基和三个γ亚基。另外的方面包括其中上皮离子通道包含一个δ亚、一个β亚基和一个γ亚基的上皮离子通道。在其他方面，上皮离子通道包含二个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，上皮离子通道包含两个δ亚基、两个β亚基和两个γ亚基。在另外的方面，上皮离子通道包含三个δ亚基、三个β亚基和三个γ亚基。
在用于鉴定上皮钠通道的调节剂的方法中，方法还可包括将上皮钠离子通道与上皮钠离子通道拮抗剂例如但不限于氯己定、阿米洛利、phenamil、benzamil或其同源物、类似物或衍生物接触。
在用于鉴定上皮钠通道的调节剂的方法中，用于膜的合适的脂质组分包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、phosphatidylglyine、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、胆固醇、心磷脂或其同源物、类似物或衍生物的至少一种。这样，脂质可被组织为微团、脂质体或脂双层。
在用于鉴定上皮钠通道的调节剂的方法的一些方面，上皮钠离子通道的至少两种亚基相互之间以不同的比例存在于脂膜中。
在用于测定上皮钠离子通道的生物活性的调节的步骤中，可使用本领域内已知的任何合适的手段，包括但不限于电压钳技术(voltage clamping)和/或指示剂染料的测量。方法可适用于高通量筛选。
用于鉴定上皮钠通道的调节剂的方法因而提供了通过方法鉴定的用作上皮钠通道的调节剂的化合物。这些化合物可可通过将所述化合物与药学上可接受的载体混合来配制成组合物。
在特定的方面，本发明提供了用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的方法，该方法包括在脂膜上装配至少一个咸味觉受体，其中所述咸味觉受体包含至少一个β亚基、至少一个γ亚基和至少一个δ亚基；在钠离子或锂离了存在的情况下将将离子通道与受试化合物接触；和测定与在受试化合物不存在的情况下咸味觉受体的生物活性相比，咸味觉受体在受试化合物存在的情况下的生物活性的调节。
在一些方面，人咸味觉受体包含一个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在其他方面，咸味觉受体包含一个α亚基、一个β亚基、一个γ亚基和一个ε亚基。在其他方面，咸味觉受体包含两个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，咸味觉受体包含三个α亚基、三个β亚基和三个γ亚基。另外的方面包括其中咸味觉受体包含一个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基的受体。在其他方面，咸味觉受体包含两个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，咸味觉受体包含两个δ亚基、两个β亚基和两个γ亚基。在另外的方面，咸味觉受体包含三个δ亚基、三个β亚基和三个γ亚基。
在用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的方法中，δ亚基优选包含SEQ ID NO12的氨基酸序列。在一些方面，δ受体包含SEQ IDNO9的氨基酸序列。在用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的方法中，方法还包括将上皮钠离子通道与上皮钠离子通道拮抗剂例如但不限于氯己定、阿米洛利、phenamil、benzamil或其同源物、类似物或衍生物接触。
在用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的方法中，脂膜可包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、phosphatidylglyine、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、胆固醇、心磷脂或其同源物、类似物或衍生物的至少一种。脂质可被组织为微团、脂质体或脂双层。
在用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的方法的一些方面，上皮钠离子通道的至少两种亚基以相互之间不同的比例存在于脂膜中。膜中的通道优选包含功能性人咸味觉受体的至少一种生物活性。
在用于测定咸味觉受体的生物活性的调节的步骤中，可使用本领域内已知的任何合适的方法，包括但不限于电压钳技术和/或指示剂染料的测量。方法可适用于高能量筛选。
调节人咸味感觉的化合物可通过本发明的方法来鉴定并且可包括例如咸味模拟物、增强剂、改性剂(modifier)和抑制剂。因此本发明提供了人咸味感觉的调节剂，所述调节剂可进一步通过将化合物与药学上可接受的载体或食物和饮料混合以调节食物或饮料的咸味感觉来用于组合物中。
本发明还提供了包含至少一种类型的磷脂和上皮钠离子通道或特定比例的上皮钠离子通道亚基的人工脂膜，其中所述亚基选自α亚基、β亚基、γ亚基、δ亚基和ε亚基。
人工脂膜可包含至少一种磷脂，所述磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、phosphatidylglyine、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、胆固醇、心磷脂或其同源物、类似物或衍生物。脂膜可被组织为例如脂质体或脂双层。
在一些方面，人工脂膜包含至少一种上皮离子通道，该上皮离子通道包含一个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在其他方面，上皮离子通道包含一个α亚基、一个β亚基、一个γ亚基和一个ε亚基。在其他方面，上皮离子通道包含两个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，上皮离子通道包含三个α亚基、三个β亚基和三个γ亚基。另外的方面包括其中上皮离子通道包含一个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基的上皮离子通道。在其他方面，上皮离子通道包含两个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，上皮离子通道包含两个δ亚基、两个β亚基和两个γ亚基。在另外的方面，上皮离子通道包含三个δ亚基、三个β亚基和三个γ亚基。
本发明的方法还提供了制备此类人工脂膜的方法，其包括将含有至少一种磷脂的脂质体与上皮钠离子通道或特定比例的上皮钠离子通道亚基混合，其中将上皮钠离子通道或上皮钠离子通道亚基溶解在包含至少一种去垢剂的合适的水性缓冲液中，将脂质体与上皮钠离子通道或上皮钠离子通道亚基温育足够长的时间，然后除去至少一种去垢剂。
制备人工脂膜的方法还可包括将蛋白-脂质体重建入平面脂双层。
本发明还提供了用于鉴定咸味感觉的调节剂的方法，该方法包括在脂膜中装配至少一种上皮钠离子通道，其中上皮钠离子通道包含α亚基、β亚基、γ亚基、δ亚基或ε亚基中的至少一种；在钠或锂存在的情况下，将离子通道与受试化合物接触；测定与在受试化合物不存在的情况下上皮钠离子通道的生物活性相比，上皮钠离子通道在受试化合物存在的情况下的生物活性的调节；和对受试者施用受试化合物，然后测定与在受试化合物不存在的情况下受试者中咸味感觉的水平相比，受试者中咸味感觉的调节。优选，上皮钠离子通道包含至少一个β亚基、至少一个γ亚基和至少一个δ亚基。
在一些方面，上皮离子通道包含一个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在其他方面，上皮离子通道包含一个α亚基、一个β亚基、一个γ亚基和一个ε亚基。在其他方面，上皮离子通道包含两个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，上皮离子通道包含三个α亚基、三个β亚基和三个γ亚基。另外的方面包括其中上皮离子通道包含一个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基的上皮离子通道。在其他方面，上皮离子通道包含两个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面中，上皮离子通道包含两个δ亚基、二个β亚基和两个γ亚基。在另外的方面中，上皮离子通道包含三个δ亚基、三个β亚基和三个γ亚基。
在一些方面，δ亚基包含SEQ ID NO12的氨基酸序列。在一些实施方案中，δ亚基包含SEQ ID NO9的氨基酸序列。
在一些方面中，受试者是人。
方法允许鉴定在体外与人咸味觉受体反应并且被受试者感觉为咸味的化合物。因此本发明提供了这样的化合物，所述化合物可通过将其与药学上可接受的载体或食物或饮料混合以调节食物或饮料的咸味感觉来用于组合物中。优选，所述化合物允许有咸味的感觉，但其具有与盐相比减少的对血压的影响并且对受试者不具有副作用。，
在一些方面，可就上皮钠通道活性通过基于细胞的测定法额外地筛选化合物。
本发明还提供了用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的试剂盒，该试剂盒包括至少一种形式的磷脂；基本上纯化的包含α亚基、δ亚基、β亚基、γ亚基或ε亚基的上皮钠离子通道亚基；和任选包括上皮钠离子通道调节剂、钠或锂，和在用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的方法中使用试剂盒的说明书。
本发明还提供了例如将亚基以特定的比例混合以获得不同形式的目的上皮钠离子通道的指导。在一些方面，加入至少两种亚基以使相互之间以不同的比例存在。
试剂盒可包含调节剂例如但不限于阿米洛利、phenamil、benzamil、氯己定或胍离子的来源。
本发明还提供了调节咸味感觉(通过刺激咸味感觉或抑制咸味感觉)的方法，该方法包括将人咸味觉受体与刺激咸味感觉的化合物接触，其中咸味觉受体包含至少一个β多肽亚基、至少一个γ多肽亚基和至少一个δ多肽亚基，其中所述δ多肽亚基包含SEQ ID NO12的氨基酸序列，和其中所述化合物与所述δ亚基特异性相互作用。
在一些方面，人咸味觉受体包含一个α亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在其他方面，咸味觉受体包含一个α亚基、一个β亚基、一个γ亚基和一个ε亚基。在其他方面，咸味觉受体包含两个α亚基、一个β亚和一个γ亚。在另外的方面，咸味觉受体包含三个α亚基、三个β亚基和三个γ亚基。另外的方面包括其中咸味觉受体包含一个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基的的咸味觉受体。在其他方面，咸味觉受体包含两个δ亚基、一个β亚基和一个γ亚基。在另外的方面，咸味觉受体包含两个δ亚基、两个β亚基和两个γ亚基。在另外的方面，咸味觉受体包含三个δ亚基、三个β亚基和三个γ亚基。
在一些方面，化合物与包含SEQ ID NO12的氨基酸序列的δ亚基的部分特异性相互作用。在一些方面，化合物结合包含SEQID NO12的氨基酸序列的δ亚基的部分。
图1显示用ATP酶组织化学方法染色的人味蕾。
图2显示使用免疫组织化学方法对人味觉细胞进行的第二信使酶磷脂酶Cβ2(PLCβ2)的抗体检测。图A显示用抗体标记的细胞的亚群。图B是味蕾和周围真菌状乳头(surrounding fungiformpapillae)的反差图象(contrast image)。
图3(a，b，c，d)显示从10个个体的cDNA测序的ENaCδ亚基(分别标记以DENACA、DENACD、DENACE、DENACG、DENACH、DENACI、DENACJ、DENACT、DENACTV和DENACW)与顶行的GeneBank序列(DENACGB)相比的比对。DENACA、DENACD、DENACE、DENACG、DENACH、DENACI、DENACJ、DENACT、DENACTV和DENACW分别相应于SEQ ID NO17、SEQID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ IDNO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25和SEQ ID NO26。
图4显示不同组成的ENaC的阿米洛利抑制。由人δ、β、γ组成的ENaC对阿米洛利不如由人α、β、γ组成的ENaC敏感。
图5显示人味蕾中细胞的亚群的免疫标记。
图6显示通过微量移液器从水性悬浮液中捕获分离的人味蕾细胞。将所捕获的细胞置于RNA-保存介质中以待进一步研究。
图7显示追踪ENaC亚基α、β、γ、δ的部分转录物的扩增的单细胞的早期定量RT-PCR。结果显示细胞包含等拷贝的δ、β和γ，α转录物显示为基因组对照。
图8(a、b、c、d)显示从10个个体的cDNA测序的ENaCγ亚基(标记的GENACA、GENACB、GENACD、GENACE、GENACG、GENACH、GENACJ、GENACT、GENACV和GENACW)与顶行的GeneBank序列(GENACGB)相比的比对。GENACA、GENACB、GENACD、GENACE、GENACG、GENACH、GENACJ、GENACT、GENACV和GENACW分别相应于SEQ ID NO27、SEQ IDNO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35和SEQ ID NO36。
图9显示平面脂双层中的鲶鱼假定的味觉受体对于L精氨酸的活性的单通道记录。将包含纯化的来自鲶鱼味觉上皮的受体蛋白的蛋白-脂质体融合至平面脂双层。在向膜浴溶液中加入蛋白-脂质体之后且加入L-Arg之前，获得对照记录(部分A中显示的描记线(trace))。10μM L-Arg至脂双层的顺面(cis-side)的加入诱发有规律的周期性通道活性(部分B中显示的描记线，包括在扩展刻度上显示电流记录的嵌入物(inset))。在数分钟的单通道记录后，向顺面(图C中显示的描记线)加入100μM D-Arg，活性终止。跨膜电位为-100mV。所有图中显示的描记线是该特定情形的连续记录。
要理解，本发明不限定于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然，其可发生变化。也要理解，本文中使用的科学术语只是为了描述特定的方面而不意欲进行限定。
与本发明的方法和其他方面相关的各种术语用于整个说明书和权利要求。除非另外指出，否则此类术语以它们在本领域中的普通意义给出。其他特殊定义的术语以与本文提供的定义一致的方式进行解释。
如本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容明确另外指出，单数形式“一个”、“一种”、“所述”、“该”和没有上述描述的形式包括复数指示物。因此，例如，提及“细胞”、“一个细胞”和“一种细胞”时，其包括两个或更多个细胞的组合等。
如本文中所使用的，术语“大约”当提及可测量的值例如量、时间延续(temporal duration)等，是指包括与特定值±20％或±10％，更优选±5％，更优选±1％和更优选±0.1％的变化，这样的变化对所述公开的方法而言是合适的。
如本文中所使用的，“上皮钠通道”或，当缩写为“ENaC”时，其是指负责钠离子流过或转运通过特定的上皮或细胞膜的多亚基蛋白质。ENaC通常由多个亚基通常α、β、γ亚基组成。还存在可存在于特殊组织中的一些ENaC中的δ和ε亚基。本文中发现的“咸味觉受体”是位于味觉细胞中的ENaC的种类并且在一个方面由β、γ和δ亚基组成。
如本文中所使用的，“受试化合物”是指任何纯化的分子、基本上纯化的分子、作为化合物的混合物的一个或多个组分的分子或化合物与可使用本发明的方法进行分析的任何其他材料的混合物。受试化合物可以是有机或无机化学物质或生物分子和其所有片段、类似物、同源物、缀合物和衍生物。生物分子包括蛋白质、多肽、核酸、核酸、脂质、单糖、多糖和其所有片段、类似物、同源物、缀合物和衍生物。受试化合物可以是天然或合成来源的化合物，其可从它们的天然发生来源分离或纯化，或可从头合成。受试化合物可根据结构或组成来定义，或可以是未定义的。化合物可以是未知结构的分离产物、几种已知的产物的混合物或包含一种或多种化合物的未定义的组合物。未定义的组合物的实例包括细胞和组织提取物、已在其中培养原核、真核和古细菌(archaebacterial)细胞的生长培养基、发酵液(fermentation broth)、蛋白质表达文库等。
如本文中所使用的，术语“调节”是指特定活性或蛋白质的量、性质或作用的任何变化、增加或减少。“调节剂”是指使用体外和体内测定法鉴定的任何抑制或激活分子例如激活剂、拮抗剂和它们的展示与分子基本上相同的生物活性的同源物，包括本文中定义的片段、变体和模拟物。“抑制剂”或“拮抗剂”是减小、减少、阻断、阻止、延迟激活、灭活、脱敏或下调目的分子或途径的生物活性的调节化合物。“诱导剂”、“激活剂”或“激动剂”是增加、诱导、刺激、开放、激活、促进、增强激活、致敏或上调目的分子或途径的调节化合物。在本发明的一些优选方面，目的分子或途径的表达或生物活性的抑制或上调的水平是指大于大约50％至大约99％，更特别地，大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的减少(抑制或下调)或增加(上调)。抑制或上调可以是直接的，即对目的分子或途径本身起作用，或可以是间接，即对影响目的分子或途径的分子或途径的分子或途径起作用。
“药学上可接受的载体”是指不干扰组合物的活性组分的生物活性的功效的介质，其对于对其所施用的试用者是无毒的。
“Ct”或“阈值循环(threshold cycle)”是指其中开始检测到高于基线信号的报告荧光的显著增加的PCR循环。
“ΔCt”是指样品测定的Ct和对照样品的Ct之间的差异。因此，ΔCt＝Ct(靶)-Ct(对照)。
“ΔΔCt”是指靶样品的平均ΔCt值和相应的校准样品的平均ΔCt之间的差异。因此ΔΔCt(受试样品)＝平均ΔCt(受试样)平均ΔCt(校准样品)。
本文中所使用的“生物活性”是指ENaC的可测量的功能，包括但不限于穿膜的钠梯度的维持、离子流的变化、膜电位的变化、电流幅值(current amplitude)、电压门控(voltage gating)、对氯己定、阿米洛利或其类似物的敏感性、溴苄胺、新生霉素或胍离子引起的刺激、与亚基特异性单克隆抗体的结合等。
本发明基于人咸味觉受体是上皮钠离子通道的发现。因此本发明的目的是使用精确摩尔比的ENaC亚基并且在脂双层中重建ENaC以鉴定调节ENaC的生物活性的化合物。特别地，本发明的目的是使用精确摩尔比的咸味觉受体亚基来在脂双层中重建咸味觉受体以鉴定调节咸味觉受体的生物活性的化合物和鉴定调节人类的咸味感觉的化合物。不希望受限于任何特定理论或作用机制，据认为在某些味觉受体细胞中钠离子通过上皮钠通道的被动流入引起细胞内离子平衡的改变，从而导致去极化，最终导致神经递质释放，这由此产生了咸味的感觉。
在一个方面，本发明提供了鉴定结合和/或调节人咸味觉受体的化合物的测定法。方法包括在脂膜中装配至少一种上皮钠离子通道，其中所述上皮钠离子通道包含α、β、γ或δ亚基，将至少一种离子通道在钠或锂存在的情况下与受试化合物接触，然后测定与在受试化合物不存在的情况下的至少一种亚基的生物活性相比，至少一种上皮钠离子通道在受试化合物存在的情况下的生物活性的调节。
当包含受试化合物的样品的生物活性比不含有受试化合物的样品中的活性更高时，化合物是激动剂。如果包含受试化合物的样品的活性比不含有受试化合物的样品中的活性低，那么化合物是拮抗剂。
上皮钠离子通道是由不同亚基组成异多聚体复合物(heteromultimeric complexe)。ENaC的各种亚基已被鉴定，包括但不限于α亚基、β亚基、γ亚基、δ亚基和ε亚基。ENaC可来源于任何物种，然而，哺乳动物的ENaC亚基是优选的，最优选的物种是人。本文提供了编码人ENaC亚基的核酸序列和推导的氨基酸序列的实例。具有基本上同源的氨基酸序列的或代表亚基蛋白质的同种型的其他亚基可用于实施本发明。为“基本上同源的”的氨基酸序列是与本文中提供的亚基序列的序列至少大约80％至大约100％同一的蛋白质序列。更优选，序列为大约85％至大约100％的同一。最优选，序列与本文中提供的亚基的参照序列大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一。
分别以SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQID NO7的形式提供编码人α亚基、人β亚基、人γ亚基和人δ亚基的代表性核苷酸序列。人α亚基、人β亚基、人γ亚基和人δ亚基的推导的氨基酸序列分别以SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的形式提供。在咸味觉受体的优选方面，对于SEQ IDNO8，δ亚基在位点532上包含半胱氨酸。具有Cys532的δ受体示于SEQ ID NO9。此类置换可因三联体密码子从tac至tgc的改变而产生(对于SEQ ID NO7中显示的序列)，从而导致从酪氨酸(Tyr)至半胱氨酸(Cys)的变化。
在一些实施方案中，ENaC由至少一个α亚基、至少一个β亚基和至少一个γ亚基(例如，(α)1(β)1(γ)1)构成。在其他方面，ENaC由至少一个α亚基、至少一个β亚基、至少一个γ亚基和至少一个δ亚基组成。在其他实施方案中，ENaC由两个α亚基、一个β亚基、一个γ亚基(α2βγ)构成。在其他方面，ENaC由三个α亚基、三个β亚基和三个γ亚基((α)3(β)3(γ)3)构成。在另一个方面，ENaC包含ε亚基和至少一个其他亚基例如α亚基、β亚基、δ亚基、γ亚基或其组合组成。在其他方面，ENaC包含多个β亚基。在优选方面，ENaC由至少一个β亚基、至少一个γ亚基和至少一个δ亚基(咸味觉受体)组成。最优选方面是包含至少一个β、至少一个γ和至少δ亚基(例如，(β)1(γ)1)(δ)1的ENaC，其中δ亚基包含Cys532。
各种亚基可以以与其他亚基相互不同的比例存在于ENaC中。观察到的变化可与特定目的ENaC在其中表达的组织有关。例如，但非限定性的，ENaC可由两个α、一个β和一个γ亚基组成。因此，在本发明的某些方面，装配入脂膜的ENaC由至少两个相互之间以不同比例存在的亚基组成。在另一个方面，ENaC由至少两个相互之间以相同比例存在的亚基组成。取决于目的ENaC在其中表达的组织，ENaC亚基的比例也可发生变化。此外，在不同组织中表达的各亚基的形式中可以存在重要的序列变异性。例如，但不限于，在咸味觉受体中表达的ENaC的δ亚基优选在δ的假定的阿米洛利结合位点中在SEQ IDNO8(其编码来自肾的人δ)的位点532上具有半胱氨酸。人肾δ在该位点具有酪氨酸。因此，当表达人咸味觉受体时，优选使用具有包含CYS532的MGSLCSLWFGA(SEQ ID NO12)的假定的阿米洛利结合位点的δ。由于该基序至少是假定的阿米洛利结合的位点，因此调节人的咸味觉受体的其他化合物也可结合该位点。
在本发明的某些方面，使用ENaC亚基产生的脂膜在它们中包含形成咸味觉受体ENaC亚基。此类咸味觉受体包含至少一个β、至少一个γ和至少一个δ亚基。在优选方面，δ亚基包含Cys532。在其他方面，ENaC包含选自α、β、γ、δ和ε的亚基。在一些方面，ENaC由至少一个α、至少一个β和至少一个γ亚基组成。在其他方面，ENaC包含至少一个ε亚基。
装配入脂膜的ENaC或各种亚基可从本领域内任何适合的来源获得。例如，可从表达ENaC的任何细胞(包括细胞系和稳定的细胞系)新分离ENaC或其任何亚基。例如，但不限于，ENaC在神经组织、胰腺、睾丸、卵巢、舌、结肠、肾、肺、汗腺等中表达。在一些方面，从舌的乳头分离用于咸味感觉的ENaC。在其他方面，ENaC或其任何亚基可通过重组表达、纯化和用于重建脂膜以形成功能性ENaC。
在某些实施方案中，将ENaC的各亚基在重组表达系统例如但不限于细菌细胞、Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)细胞、哺乳动物细胞和蛙卵母细胞中分开表达。使用本领域内熟知的标准生物化学方法纯化表达的蛋白质。备选地，可使用特异性结合ENaC亚基的被固定的抗体免疫纯化表达的蛋白质。用于通过免疫亲和性(使用特异性结合目的亚基或ENaC的抗体)纯化蛋白质的方法。在其他方面，ENaC亚基表达为与允许快速纯化和随后从表达的蛋白质切割的多肽的融合蛋白。此类纯化系统包括但不限于pGEX系统(谷光甘肽S-转移酶融合蛋白)和多组氨酸融合蛋白(用于镍结合亲和纯化)。此类和其他类型的纯化描述于许多参考文献中并且对于本领域技术人员来说法是熟知的。在某些优选方面，使用杆状病毒系统和草地夜蛾细胞同时表达ENaC亚基，以及如Rao，U.S.等人(2002)″Activation of LargeConductance Sodium Channels Upon Expression ofAmiloride-Sensitive Sodium Channel in SF9 Insect Cells″J.Biol.Chem.277(7)中所述制备膜级分。
在某些方面，在整合入膜之前基本纯化ENaC的亚基。如本文中所使用的，“基本纯化”是指为亚基，所述亚基至少80％不含来源于从其获得它们的细胞的污染物质(例如，蛋白质、多糖和脂质)。优选，亚基至少大约85％不含污染物质。更优选，亚基为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地不含污染物质。
为了重建可存在于本发明的人工膜中的组织中的特定ENaC，存在于ENaC中的亚基的比例可通过定量PCR来测定。由于多聚体受体的蛋白质亚基的比例通常与细胞中产生关于对于给定的受体的mRNA的量相关，因此定量PCR可提供测定存在的mRNA的比例的有效方法。用于进行定量PCR的方案在本领域内是熟知的。此外，基于本文中提供的ENaC的序列和本领域内的知识以及可获得的用于筛选可特异性和容易地扩增特定基因的信使的PCR寡核苷酸引物的软件，本领域技术人员可容易和常规地对组织样品进行定量PCR并且测定形成特定ENaC的亚基的同一性和比例。用于测定mRNA的相对量的测定法在本领域内是熟知的。一旦确定mRNA的比例，就可推断出必须向膜中加入以提供适当的化学量的蛋白质来形成生物活性ENaC的各亚基的蛋白质量。
亲和纯化的蛋白质的浓度可通过测量蛋白质洗脱物的总氮含量并且将氮含量与洗脱物的总蛋白质含量比较与来测定。氮含量要通过本领域内任何适合的方法例如熟知的凯氏定氮法来测定。可以例如通过分光光度法测定蛋白质浓度，其中就其在280nm的光的吸收推算出吸光系数来分析蛋白质样品。可使用本领域内已知的用于估量蛋白质的浓度和/或纯度的任何方法。
因此本发明提供了包含基本上纯化的ENaC蛋白亚基的人工膜系统，所述亚基装配成功能性ENaC。特别地，本发明提供了包含基本上纯化的人咸味觉受体的人工膜系统。这些膜系统允许ENaC(包括但不限于除去污染性蛋白例如内源ENaC外的咸味觉受体)的分析。本发明允许ENaC的装配，在所述装配中，以已知的比例加入亚基以允许精确比例的选择的亚基的装配。脂膜可包含任何组合的脂质。合适的脂质的非限定性实例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、phosphatidylglyine、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、胆固醇、心磷脂或其同源物、类似物或衍生物。磷脂是优选的，其可从本领域内任何合适的来源获得。例如，磷脂可从细胞提取，或可以是合成的磷脂，其是可商购获得的。
脂膜可以以任何构造或相包括但不限于脂质体，脂双层或六角相的形式存在。脂质体和脂双层是特别优选的。
受试化合物对ENaC的生物活性的影响可通过本领域中适合的任何方法来测定。可在多个浓度上估量受试化合物。在一些方面，就其调节ENaC的至少一种生物活性的能力估量受试化合物。在优选方面，ENaC是咸味觉受体。
可通过测量脂膜中装配的ENaC的电流来测定ENaC的生物活性。电压钳技术是测量ENaC电流的较适宜的技术。电压钳技术在本领域内是熟知的。(Nagel，G等人(2005)J.Physiol.564(Pt3)671-82；Staruschenko，A等人(2004)J.Biol.Chem.；Tong，Q等人(2004)J.Biol.Chem.；Sheng，S等人(2000)J.Biol.Chem.)。可使用电压钳技术测量下列参数单通道导率(single channel conductance)、通道开放时间(channel open time)、电压依赖性(voltagedependence)、由特定化合物的应用诱导的阻断和由特定化合物的应用诱导的激活。用于测量ENaC的生物活性的其他合适的技术包括流量测定法、膜片钳技术、电压敏感染料和离子敏感染料。优选，ENaC的活性通过膜电生理学或通过估量膜电位染料响应钠或锂或其类似物(例如，同位素)的荧光的变化来测量。所有此类测定法在本领域内是熟知的。(Gill，S等人(2003)Assay Drug Dev.Technol.1709-17，fluxassay；Caldwell，RA等人(2005)Am.J.Physiol.LungCell Mol.Physiol.288L813-9，patch clamp)。许多种电压敏感染料是可商购获得的，包括但不限于苯乙烯基染料、oxonol染料和部花青-罗丹宁染料。适当的电压敏感染料的选择在本领域技术人员的能力范围之内。类似地，许多种离子敏感染料可商购获得，包括单激发染料(single excitation dye)、双激发比率法测定染料(dualexcitation ratiometric dye)和双发射比率法测定染料(dualemission ratiometric dye)。
咸味觉受体对钠和锂离子是反应性的。然而，与其他ENaC不同，人咸味觉受体对阿米洛利不敏感。因此，阿米洛利不应当抑制或刺激咸味觉受体ENaC。相反地，氯己定用作人中的咸味反应的抑制剂，并且可在测定中用于鉴定咸味调节剂。可通过显示作用被氯己定抑制来使用受试化合物估量咸味觉受体的刺激的特异性。此外，可去除氯己定的作用(和刺激本发明的膜系统中的咸味觉受体)的受试化合物是强咸味增强剂。包含胍离子的碱性化合物以及某些胺用作咸味增强剂。此类化合物包括胍、精氨酸和高精氨酸。L和D精氨酸效果相同。虽然不希望受任何特定作用理论束缚，但但该对应体特异性的缺乏暗示着主要的增强作用来源于致密的碱性部分，在该情况下是胍离子。因此，本发明的膜系统中的咸味觉受体可通过将它们与胍离子的来源接触来进行刺激。可能假定此类增强化合物直接与人咸味离子通道相互作用，因为大多数钠通道阻断剂和增强剂包含与通道孔腔(channel pore lumen)内的酸性部分相互作用的胍基。因此，人咸味的分子机制与已知的钠通道共有共同的选择的功能特征，但也具有独特的药理学特质。
阿米洛利和阿米洛利衍生物(例如，phenamil、benzamil等)可用于估量其他ENaC，例如包含α亚基的ENaC。阿米洛利和衍生物还可在测定中用于抑制背景(内源ENaC)，如果亚基制剂的纯度较低以至于宿主细胞ENaC污染制剂。因此，在本发明的一些方面，方法还包括将ENaC与钠离子通道拮抗剂接触。此类拮抗剂对于本领域技术人员来说是熟知的。优选，拮抗剂是阿米洛利、氯己定或其同源物、类似物或衍生物。
本发明还在其范围内包括鉴定调节咸味觉受体的生物活性的化合物的高通量筛选测定法。高通量筛选测定法允许以有效的方式筛选大量的受试化合物。例如，但不限于，可将包含装配的ENaC的脂膜分散在整个多孔板例如96孔微量滴定板中。微量滴定板各孔可用于对候选调节剂进行分开的测定法。微量滴定板允许在相同的测定条件下筛选多个浓度的受试化合物、多种受试化合物(单独的或与其他受试化合物混合)和多个ENaC(包括具有不同比例的本文中所述和例举的亚结构域的ENaC)。在本发明的其他方面，将包含目的ENaC的平面脂双层与受试化合物接触，然后进行测量。在平面脂双层的一侧或两侧的溶液被改变，并且将脂双层与第二受试化合物接触。这可连续用作高能量测定法。测定可在另外的激动剂或拮抗剂存在的情况下发生。将对于受试化合物获得的数据与在已知的激动剂或拮抗剂存在的情况下进行的测量比较和/或与对照样品(例如非刺激性/非抑制性介质)进行比较。
可进行系列测定以缩窄用作咸味改性剂的受试化合物的库集。例如，可将本发明的体外测定法与基于细胞的测定法如第二或确认筛选步骤结合。已在例如属于Servant等人的公开的美国专利申请中描述了此类测定法。
本发明的另外的方面表征了通过结合体外和体内筛选测定法来鉴定调节受试者的咸味感觉的化合物的方法。在一个方面，首先在体外筛选受试化合物以测定其对上皮钠离子通道的调节效应，然后进一步进行体内筛选以确定所述化合物是否可调节优选增强受试者的咸味感觉。
在一个方面，体外筛选测定法包括鉴定人咸味觉受体的调节剂，包括将受试化合物与至少一种ENaC接触并且测定与在受试化合物不存在的情况下ENaC的生物活性相比，ENaC在受试化合物存在的情况下的生物活性的减少。可按照本文中描述的详细内容实施该方面。在一个方面，体内筛选测定法包括鉴定增强受试者的咸味感觉的化合物，其包括对受试者施用受试化合物，然后确定与在受试化合物不存在的情况下受试者的咸味感觉水平相比，受试者中咸味感觉是否增强。
对于体内筛选，可通过伦理委员会(InstitutionalReview Board)批准的方法例如印刷媒介中的一般广告来招募受试者。在进入研究之前，各受试者提供书面同意书(informed consent)。可要求参与者在试验之前至少1小时克制不要饮食、饮水或咀嚼口香糖。受试者可因参与研究而付给报酬。
含有将给研究受试者施用的候选受试化合物的实验溶液可以以二元混合物例如化合物和无机盐(例如NaCl)的形式存在。可进行预实验以建立受试化合物和无机盐的适当浓度范围。例如，将四种浓度的受试化合物与4种浓度的无机盐一起使用。可制备包括受试化合物与无机盐的浓度的所有可能的组合的水性溶液。
为了估量给定的刺激物的咸味增强性质，可使用本领域内的任何合适的方法。此类方法的一个非限定性实例是数量级估算(magnitude estimation)的方法。数量级估算测量从样品感觉到的咸性的强度的等级。可教导参与咸性估量的受试者估计溶液的咸性或相对咸性。各溶液可由受试者采样1次、2次、3次或更多次。
在对受试溶液采样之前，可教导受试者洗潄它们的口。例如，可教导受试者，优选在很短的持续时间例如大约2分钟内内，用水洗漱，然后吐出水，进行4次。然后可对受试者，优选以随机的顺序施用受试样品和无机盐并且无替代。例如，可在聚苯乙烯药杯(Dynarex，NY)中以10ml的等分制备溶液，然后给受试者施用。可教导受试者评定溶液的相对咸性，并且可对各溶液的相对咸性评级进行算术平均以产生单个咸性评级。
数量级估算可能由于使用的受试者数目的变化的原因而不显示差异。为了消除由数量级估算工作中独特的数目用法产生的差异，可将咸性评级标准化为只有NaCl的水溶液的咸性评级的总算术平均值(grand arithmetic mean)(在所有NaCl浓度间进行平均)。每一个受试者的平均咸性评级平均成总的咸性平均值，商可用作该个体的咸性评级的倍增标准化因子。该方法使NaCl水溶液的平均咸性评级在所有受试者相等。
可对来自数量级估算的标准化的重复测量数据进行方差分析(ANOVA)，和可用Tukey公正显著差异(Tukey’s honestsignificant difference)(HSD)分析进行事后成对比较(post-hocpairwise comparison)。
数量级估算的另一选择是强迫评比法(forced-rankingprocedure)，其中使用系列两者选一迫使选择配对(two-alternativeforced-choice pairing)评定在受试化合物假定的增强剂存在或不存在的情况下NaCl水溶液中的咸性的等级。在该方法中，可教导受试者品尝第一对样品的第一溶液的一半(例如，5ml或10ml溶液)进行3秒，然后吐出。然后洗漱两次，使用相同的方法品尝两种溶液中剩下的溶液。在品尝两种溶液两次后，可要求受试者指出他们认为更咸的溶液。如果他们报告没有溶液似乎更咸，那么要求受试者猜测(迫使选择)。可对所有样品重复该方法。
使用配对评级的Friedman分析基于特定溶液选择作为比所有其他溶液更咸的倍数来计算咸性评级。可计算Tukey HSD以确定个体评级之间的差异是否显著。
通过任何上述发明的方法鉴定的化合物包括在本发明的范围内。此类化合物优选为ENaC的激动剂，更优选人咸味觉受体的激动子，更优选人咸味觉受体的增强剂。此类化合物可通过将该化合物以有效地增强其所施用的受试者的咸味感觉的量和药学上或营养上可接受的载体混合来配制为营养或药物组合物，如本文中所描述的。
本发明的目的是使用测定法鉴定感觉为咸味的的化合物以及以鉴定增强咸味(以使减少的量的钠或锂被感觉为更高浓度的钠或锂)的化合物。本发明使得能够就它们用作盐替代品、咸味增强剂或咸味抑制剂的能力筛选化合物(包括天然的或合成的分子，包括但不限于蛋白质、肽、寡核苷酸、多核苷酸、多糖、脂质、小有机分子等)的文库。本发明包括通过本发明的方法鉴定的盐替代品、咸味增强剂和咸味抑制剂。
也按照本发明表征的是人工脂膜和用于制备其的方法。人工脂膜包含至少一种脂质和装配的ENaC或至少一种ENaC的亚基。在优选方面，ENaC是咸味觉受体。脂膜可由任何合适的脂质组成，优选由磷脂组成。合适的脂质包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、phosphatidylglyine、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、胆固醇、心磷脂或其同源物、类似物或衍生物，这些脂质可从本领域内的任何合适的来源获得。脂膜可以任何构造存在，优选为脂质体或脂双层。
在一个方面，人工脂膜可通过将包含至少一种磷脂的脂质体与已溶解在合适的水性缓冲液中的ENaC或ENaC的特定亚基混合来制备。水性缓冲液包含至少一种去垢剂。合适的去垢剂在本领域内是熟知的，包括但不限于Tween、Triton、CHAPS、胆酸钠和辛基葡糖苷。在混合磷脂和ENaC或其亚基后，让混合物温育数分钟，优选至少大约20分钟，以允许ENaC装配入脂膜。在温育后，按照本领域内任何适合的方法例如本文中所描述和例举的方法除去去垢剂。本领域内已知的制备脂质和包含蛋白质的脂质体的其他方法可用于产生包含ENaC亚基的脂质和脂质体。
在一些方面，将ENaC装配入脂质体。可通过使用本领域内熟知的和常规的技术(包括本文中描述和例举的技术)将脂质体转变成平面脂双层。在一些方面，脂质体包含除了见于周围环境的以外的物质。例如，但不限于，脂质可包含荧光电压敏感性或膜电位染料，所述染料对钠或锂是反应性的，从而指示作为用受试化合物刺激时产生的钠流的标记的钠含量的变化。
本发明还表征了用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的试剂盒。所述试剂盒包括至少一种磷脂、分离的上皮钠离子通道亚基和任选地钠和/或锂离子的来源以及在用于鉴定人咸味觉受体的调节剂的方法中使用试剂盒的说明书。在一些方面，试剂盒任选包括上皮钠离子通道拮抗剂和/或激动剂。
本发明提供了用于通过将咸味觉受体与化合物接触来调节受试者的咸味感觉的方法，所述化合物特异性与包含Cys532的δ亚基的假定的阿米洛利-敏感区域相互作用。在人受试者中，该δ亚基包含SEQ ID NO12的氨基酸序列。调节剂可通过刺激受体或阻断受体来增强或抑制咸味感觉。化合物可通过优选在具有SEQ ID NO12的氨基酸序列的假定的阿米洛利敏感区域中结合受体来与δ受体相互作用。
通过使用可在本领域内获得的用于基于推理的药物设计的计算机程序，可基于可在本文中获得的一级氨基酸序列数据和本领域内关于离子通道的三级结构的知识进行分子建模，以提供人咸味觉受体的三维模型。此类建模允许将与特异性调节位点(包括例如，δ亚基的假定的阿米洛利结合位点，基序SEQ ID NO12)相互作用的候选化合物的推理选择。此类化合物或化合物种类将用作咸味改性剂。与这些区域(例如，δ亚基的SEQ ID NO12)相互作用的化合物用作咸味感觉的改性剂。因此，本文中所示的数据提供了包含咸味觉受体的亚基和亚基的可能参与咸味感觉的区域之间的结构-功能关系。
下列实际和预测的实施例提供用于更详细地描述本发明。它们意在举例说明而非限定本发明。
获得人真菌状乳头和味觉细胞的方法。通过在局部麻醉下进行微创手术活组织检查法从志愿者的舌的前背侧表面常规地获得包含味蕾的人真菌状乳头。在Spielman，AI等人Collection of tastetissue from mammals.Experimental Cell Biology of Taste andOlfaction.Spielman AI and Brand JG eds.CRC Press，Boca Raton，FL，pp 25-32中描述了一般方法。志愿都提供了书面同意书。该方法已经伦理委员会考察和批准。然后可将切断的乳头(papillae)用于RNA提取、免疫组织化学和原位杂交，或用于产生分离的味觉细胞的悬浮液的方法。
RNA提取、组织化学和原位分析。当用于总RNA提取时，立即将乳头经历使用TRIzolTM试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)的标准提取方法。用DNA酶处理RNA提取物以除去大多数基因组DNA。否则任何剩余的DNA在随后其中不可能使用跨越内含子(intron-spanning)的引物的步骤中产生假阳性结果。然而基因组材料用于定量逆转录酶聚合酶链式反应(QRT-PCR)，因为单拷贝的基因组DNA显示PCR的最高灵敏性的点的信号，从而提供了方法的合宜的终点。然后对RNA进行反转录来产生RNA的DNA拷贝，称为互补DNA或cDNA。该cDNA将用作聚合酶链式反应的底物。
因为真菌状乳头RNA和随后的cDNA通常是高质量的，所以研究中的蛋白质的完整编码序列或开放阅读框架(ORF)可立即被扩增。用于进行该扩增的寡核苷酸引物基于GenBank中注释的相同的或相似的蛋白质的公开序列来设计。PCR反应产物可通过琼脂糖凝胶电泳来分析。该方法通常用于获得已知在味蕾细胞中表达的基因的完整编码序列，所述基因的全长序列不能从单个细胞分析中容易地获得。
切断的乳头还可用于普通组织化学或免疫组织化学或原位杂交分析。各种技术和方法是可获得的并且可用于固定和保护组织。例如，图1显示过ATP酶组织化学法染色的人味蕾。图2显示使用免疫组织化学方法对人味觉细胞进行的第二信使酶磷脂酶Cβ2(PLCβ2)的抗体检测。方法如下在1X PBS中清洗真菌状乳头的组织学切片(8至10微米)3次，10分钟，将切片在室温下置于封闭缓冲液中进行4至18小时。除去封闭缓冲液，以3种浓度(1∶50，1∶100和1∶200于缓冲液中)加入一抗(兔抗PLCβ2)。除去一抗溶液，将载玻片在PBS中清洗3次。第一次清洗立即排水，然后随后的清洗每次温育10至20分钟。除去过量的液体，将二抗溶液(CY3标记的山羊抗兔，1∶1000)加至切片上，将载玻片于室温下温育45至120分钟。将载玻片在PBS中清洗3次。第一次清洗快速排水，然后随后的清洗每一次温育10至20分钟。排出过量的液体，但使载玻片保持湿润。将盖玻片置于载玻片上，将载玻片于荧光显微镜下观察。
用于鉴定ENaC亚基的RT-PCR和测定其序列。如上所述从活组织检查取样的真菌状乳头提取总RNA，不进行DNA酶处理，然后合成第一链cDNA。可用PCR Core System I reagent试剂盒(Promega Corp.，Madison WI)，使用上述引物进行ENaC亚基(大小不超过500bp)的扩增。
如果获得表面上正确大小的产物，从凝胶上切取该产物并且进行纯化。然后将产物连接入质粒载体以产生重组质粒，该重组质粒具有插入其中的蛋白质(例如，ENaCδ)的编码序列的基因。将重组质粒用于转化细菌细胞，当提供合适的生长培养基时，所述细菌细胞产生大量质粒。细菌培养物的纯化产生以纯的形式存在的重组质粒，这使得人们能够获得来自人真菌状乳头的蛋白质基因的序列。最后，使用BLAST程序对序列进行的生物信息分析确认了确实已获得正确的序列。
通过使用该方法，发现了4种ENaC亚基类型的转录物存在于人真菌状乳头中的证据。这些亚基是α、β、γ和δENaC亚基。极少观察到α亚基的完整ORF，但几乎总是观察到其他亚基的完整ORF。令人惊讶的是，发现ENaC的δ亚基存在于人真菌状乳头中。
人咸味觉受体的鉴定和δ亚基的重要性。
根据本发明，ENaC的δ亚基存在于人的真菌状(味觉)乳头中。其中检测到亚基的克隆来自3个个体的汇集的cDNA，所述个体同意进行活组织检查法以从舌的前背侧表面取出数个真菌状乳头。
δ亚基的特征。通过RT-PCR在来自13个个体的真菌状乳头中检测到上皮钠通道的δ亚基。通过PCR和亚克隆扩增检测到的片段。然后对来自这13个个体的编码δ亚基的多核苷酸进行全长测序。确定了来自真菌状乳头的人δ亚基在假定的阿米洛利结合位点中与从肾克隆的人δ亚基不同。假定的阿米洛利结合位点在来自肾的δ亚基(SEQ ID NO8)中的氨基酸532上包含酪氨酸，但来自真菌状乳头的δ亚基(SEQ ID NO9)中的氨基酸532在13个测序列的样品的每一个中是半胱氨酸
假定的阿米洛利结合位点的序列
肾δMGSLYSLWFGA(SEQ ID NO11)
味觉δ#1MGSLCSLWFGA(SEQ ID NO12)
味觉δ#2MGSLCSLWFGA(SEQ ID NO12)
味觉δ#3MGSLCSLWFGA(SEQ ID NO12)
图3显示11个δ亚基的氨基酸序列的比对，其中第一序列是GenBank序列，其他10个序列来自10个不同的个体。在位点180上，标示了可能的多态性(R至P)。标示可能的多态性的其他位点是位点278(F至I)、355(S至R)、389(E至Q)和566(R至H)。位点566也牵涉到阿米洛利结合。不期望受限于任何特定理论或作用机制，多态性可在对咸味刺激物的敏感性中起着重要作用或可在对味觉调节剂的敏感性中起着重要作用。
位点532上的Y至C的变化是很重要的，因为其可帮助解释大鼠咸味觉受体是明显的阿米洛利敏感型而人咸味觉受体不是的原因。由于大鼠的δENaC亚基是假基因，因此其不表达。据认为，阿米洛利-敏感-α-亚基充当大鼠中咸味感觉的一部分。虽然该置换不显著地改变受体的敏感性和特异性，但通道的药理学被改变。
虽然δ亚基是阿米洛利敏感的，但其程度比α低(图4)。因此，如果人咸味觉受体ENaC包含常见形式的δ，其也应当显示阿米洛利敏感性。然而，来自人味觉细胞的δ中的假定的阿米洛利结合位点包含非保守置换，从而可对阿米洛利具有与肾中的δ亚基不同的敏感性。不期望受限于任何特定理论或作用机制，其δ显示较少的敏感性，该观察可能可解释为表示δ存在于人咸味觉受体中，特别地因为阿米洛利不能穿过紧密连接。由于大鼠和人之间的差异，大鼠可能不是用于人中咸味感觉的良好模型。
人真菌状δENaC亚基的细胞特异性。人味蕾示于图1，其中用ATP酶组织化学方法对人真菌状乳头的8微米切片染色。现在的问题变成这些味觉细胞的一些、所有或无味觉细胞是否表达δENaC。为了只考察表达δ亚基的细胞，在大鼠中产生抗人ENaC的δ形式的抗体。代表性照片示于图5。载玻片显示人味蕾中的细胞的亚群上的组织特异性标记。暗示着人咸味觉受体是由δ、β和γ亚基的多聚体或亚基α、δ、β和γ的多聚体组成的ENaC。味觉细胞中δ的该特异性，伴随着这些相同的味蕾中全长α的显著缺乏，暗示着人咸味觉受体是包含δ的ENaC，而非仅仅是由其他人提出的α、β、γENaC。
人味蕾细胞的分离。通过在基于胶原酶的酶促方法中温育活组织检查的乳头，然后清洗乳头以有效地除去酶，然后通过玻璃吸量管捣碎乳头来制备单个分离的味蕾细胞的悬浮液。富集所得的悬浮液以获得味蕾的细胞。使用玻璃微量移液器捕获单个细胞(参见图6)，之后将细胞单个地置入含有2至10μl RNA的管中。
δ亚基位于味蕾细胞中。cDNA来源于7个人的如上所述单个地分离和捕获，然后汇集的真菌状味觉细胞。发现正确大小(大约500bp)的产物，通过测序验证其身份为人ENaCδ亚基。通过使用鉴定δENaC的ORF的重叠片段的该PCR方法，获得味觉细胞δENaC的完整ORF。
也进行使用嵌套引物的单细胞RT-PCR，单细胞RT-PCR显示12个受试人味蕾细胞中有2个提供了δ、β和γ亚基表达但全长α不表达(数据未显示)的强有力证据。一个早期单细胞Q-RT-PCR显示没有α亚基的信使，但显示δ、γ和β的信使拷贝数目大致相等(图7)。
通过对分离的味觉细胞的制剂使用钙成像，可能鉴定被氯化钠激活的单个细胞。捕获这些细胞并且通过Q-SC-RT-PCR分析它们的内含物。在30个盐敏感性细胞的细胞群中，主要表达的亚基确定为δ。8个表达δ、β和γ，而7个表达δ、α、β和γ。
与γ的GenBank序列相比较的10个从味觉细胞测序得到的γ亚基的氨基酸序列的比对示于图8。
由于已鉴定咸味觉受体为δ、β、γ或δ、α、β、γ，因此将表达各亚基并且将其重建入脂双层以进行分析，如由下面的实施例所提供的。
脂质体和人工脂双层的制备
本实施例演示了易于实施来从其膜环境溶解丰富的受体，纯化所述受体和在人工脂膜例如脂双层中重建感受体的技术。此类膜用作其中受体恢复其天然构象的人工生物膜并且可进行更详细研究和在分离状态下进行研究，例如，而无来自活细胞的其他蛋白或代谢的无常变化的干扰。
本实施例部分地描述了来自鲶鱼的L-精氨酸(L-arg)的味觉受体的提取、纯化和膜重建。可容易地使Grosvenor，W等人(2004)BMC Neuroscience 5∶25中公开和描述的方法适合用于ENaC、ENaC亚基和咸味觉受体在下面描述的脂膜中的重建。鲶鱼已用作味觉受体研究的模型，因为受体对某些氨基酸非常敏感。一个这样的氨基酸是L-arg。和ENaC一样，鲶鱼中L-arg的味觉受体也是离子通道。并行方法(Parallel approach)用于溶解L-arg和ENaC-型受体。受体的差异主要在于来源的不同-L-arg受体从鲶鱼味觉组织纯化，ENaC亚基由异源细胞培养表达系统合成。
脂质体的产生。脂质体用于将溶解的受体携带至脂双层构建体。研究膜-可溶性蛋白质的主要挑战是发展将蛋白质从其天然膜或合成终点转移至人工脂双层的方法。溶解通常使用去垢剂，并且必须除去该去垢剂以避免对脂双层的破坏。脂质体通过从去垢剂系统吸收蛋白质并且将其释放至脂双层来进行该转移。
通过向圆底烧瓶中加入5mg于0.5ml的氯仿中以2∶1混合的1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙二胺1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPE∶DOPC)的混合物来制备脂质体。将烧瓶在4℃下旋转30至40分钟。在氯仿蒸发后，脂质的薄层形成，向其加入2ml缓冲液(300mM NaCl、50mM Tris，pH＝7)。在加入缓冲液后，使用3至5分钟的脉冲对烧瓶进行浴槽式超声处理(bath-sonicate)3次以诱导脂质体形成。备选地，探头超声波破碎仪(probe sonicator)只需被脉冲30至40秒。
L-ArgR至脂质体的溶解和脂膜中L-ArgR的药理学。向脂质体中加入一定量(0.01至0.5μg)的L-ArgR(所述L-ArgR溶解在含有几种去垢剂例如Tween、CHAPS、Triton、胆酸钠或/和辛基葡糖苷的一种的100mM NaCl/50mM Tris，pH＝7.1中)。用于测量通道活性(单通道事件的情况下)的蛋白质对脂质的(质量∶质量)的比例是1∶。用于测量宏观特性的比例在1∶50-100的范围内。将蛋白质-脂质混合物温育20至30分钟。
脂双层中测量的L-ArgR的特性与通过味觉神经记录(此时L-ArgR以其天然状态存在)从动物中观察到的L-ArgR的特性非常相似。例如，味觉神经记录显示天然受体的敏感性是L-arg的uM的十分之几，而D-arg抑制受体。图9显示，当L-ArgR被重建入脂双层中时，看到相同的性质。这显示受体如L-ArgR，当在脂双层中时，比当在天然状态(其中其活性必须从二次神经记录(secondary neuralrecordings)推断)中时得到更直接和更容易地研究。
ENaC蛋白至脂质体的重建。向脂质体中加入一定量(0.01至0.5μg)的溶解在100mM NaCl/50mM Tris，pH＝7.1(该溶液含有几种去垢剂例如Tween、CHAPS、Triton、胆酸钠或/和辛基葡糖苷中的一种)中的目的钠通道(包括ENaCα、ENaCδ和ENaC亚基α、β、γ、δ的特定比例的混合物)。用于测量通道活性(在单通道事件的情况下)的蛋白质对脂质(质量∶质量)的比例是1∶。用于测量宏观特性的比例在1∶50-100的范围之内。将蛋白质-脂质混合物温育20至30分钟。实施该方法，因为作为膜通道，当ENaC蛋白重建入脂质体时，其需要保持在溶液中。
可通过至少两种方法制备含有一种或多种ENaC的重建的不含去垢剂的蛋白-脂质体。在一个方法中，它们可通过将蛋白质脂质混合物离心通过凝胶过滤柱来形成。可从Sephadex G-50(精制的)(溶胀过夜，然后倾倒入5-ml的一次性柱子(1.5-ml床体积))制备此类凝胶柱。在离心机中以大约1,000xg预离心柱子。将蛋白质脂质混合物装载在柱子顶部，然后可通过在700g下离心柱子1分钟来回收不含去垢剂的蛋白-脂质体。备选地，可通过透析除去去垢剂。关于透析，将蛋白质脂质混合物装载入盒式透析单元(cassettedialysis unit)，然后将所述混合物在4℃下对2000ml Tris/NaCl/蔗糖(无去垢剂)透析过夜。随着透析过程中去垢剂的浓度降低，预期含有蛋白质的磷脂囊泡自发形成。
来自蛋白-脂质体的通道蛋白至平面脂双层的重建。在两个水性室之间的孔(aperture)上形成平面脂双层，所述水性室就其操作目的称为顺室(cis compartment)和反室(transcompartment)。将电压发生器与顺室连接，使用Ag/AgCl电极，以控制膜电位。通过第二Ag/AgCl电极将反室(virtual ground(接地))与电流测量放大器的输入连接。
形成脂双层。将4∶1的DOPE∶DOPC的混合物溶解在25μl正癸烷(浓度范围在15至25mg/ml之间)中。将该混合物在室温下保持并且在进行实验的每一天制备该混合物。极室(Electrodecompartment)充满3M KCl，将Ag/AgCl电极置于室中。顺室和反室充满记录记录电解液(recording bath solution)(100mM NaCl、10Tris，pH 7)，将琼脂桥(agar bridge)置于它们和极室之间。为形成脂双层，将脂质混合物的小滴扩散至来自顺面的洞。
当电阻增加并且信号不饱和时，可确定脂质围绕洞完全形成。为了验证组织的脂双层已形成，可使用穿过脂双层的电压脉冲，和可测量“电容电流”。对于100μm的洞，电容预期为50-100pF的数量级。脂双层的电阻预期高于109欧姆。
重建。在形成脂双层后，在恒定的搅拌条件下向脂双层的顺面加入10-15μl蛋白-脂质体。当通道亚基整合入脂双层时，电流预期在步骤中发生变化。当许多通道被整合时，将测量宏观电流(macroscopic current)。
脂质体与脂双层的融合自发发生，电流将能够在大约5至30分钟内被记录。在一些情况下，可能必需通过向含有100mM NaCl的脂双层水浴液(bilayer bathing solution)中加入前在300mM NaCl中形成的脂质体产生跨脂质体浓度梯度，或通过向顺面加入100mMNaCl和向反面加入10mM NaCl来产生跨脂双层的浓度梯度，或通过向脂双层加入带负电荷的脂质例如DOPS改变脂双层和/或脂质体组成来促进脂质体融合。
脂双层中不同比例的ENaC受体亚结构域(subdomain)的表达
这是预测式的实施例。ENaC是通常由3个亚基亚基α、β和γ(在大多数组织中作为α2βγ复合物)或亚基δ、β和γ组成的异多聚体复合物。这些亚基可以以不同的比例装配，通常受组织来源控制。改变亚基的相对比例为这些通道赋予独特的动力学和药理学。不期望受限于任何特定的理论或作用机制，据认为δ亚基在许多组织中替代α亚基，并且这样的替代可特别地改变通道的药理学。
特别用于估计ENaC亚基的比例的单细胞定量PCR。虽然信使的量和蛋白质的量之间不存在一对一的相应的保证，但Q-PCR仍然是可获得用于估计ENaC比例的一个工具。假定咸味觉细胞是有活性的，其可能具有许多拷贝的特定亚基。信使拷贝的比例将可能至少大约为蛋白质产物的拷贝的比例。定量单细胞PCR可用于获得任何目的蛋白质的信使的相对丰度的半定量描述。该方法，尽管理论上很直接，提出了许多挑战性障碍。例如，对于味觉细胞，RNA质量可能是有问题的，因为目前用于获得分离细胞的耗时方法(参见上面)促进了RNA的破坏。为了使实验技术可靠，可进行下列方法(1)设计几对各目的基因的独特引对物，只使用在相同PCR条件下对每一个目的基因具有几乎完全相同的功效的引物对。(2)从上述适当的引物对构建引物组(引物对的混合物)，所述引物对，当用于水对照PCR反应时登记为空白。(3)使用可商购获得的试剂盒将单个细胞收集(如上)入不含RNA酶的环境，裂解细胞和反转录单细胞mRNA内容物。(4)使用上述引物组和条件进行有限(10-25)次数的第一阶段PCR的循环，以使所有反应处于线性放大相。(5)稀释上述反应(100x-1000x)，使用等分(作为模板)和来自上述组的单对引物，和使用Q-PCR仪进行第二阶段的PCR(以一式两份/一式三份)。(6)相对定量法用于数据分析。标准化基于未被翻译/转录的基因组DNA(基因组DNA中经确定为一个拷贝的所述基因)的扩增。基因表达的差异可通过比较比例(样品中靶基因和基因组参照序列之间的ΔCt)差异(ΔΔCt，两个样品之间的ΔCt的差异)来测定。
包含人ENaC亚基δ、β和γ的信使但无α的信使的味蕾细胞是很明显的。该分析的Q-PCR描记线示于图7。根据该单个细胞，可得出该细胞的ENAC是多聚体结构δ1β1γ1。然而，由于这些描记线未进行标准化，最终的结构可具有不同的化学计量比例。然而，最好的证据显示人咸味觉受体由δ1β1γ1组成。
一旦获得序列确认，重组质粒可在称为体外蛋白质表达(IVPE)的方法中用作底物。该方法，无论是细胞驱动的或无细胞系统，都允许产生大量(mM)的期望的蛋白质，在该情况下是ENaC亚基δ、α、β和γ。Western印迹法可用于确认制备的蛋白质的身份。使用抗该蛋白质的抗体进行的反应混合物的分析(Western印迹法)用于确认期望的蛋白质确实已获得。
可分离和纯化期望的蛋白质。通过亲和层析进行的蛋白质的纯化包括将抗该蛋白质的抗体与柱基质例如葡聚糖凝胶(Sephadex)化学连接。将IVPE反应混合物通过柱子导致蛋白质与其在柱子上的抗体结合。使用适当的试剂洗脱柱子产生了富集的蛋白质。蛋白质洗脱物可通过测量总氮(如在凯氏法中)来进行定量。然后将总氮含量的该测量与280nm处蛋白质的吸收要比较来计算吸光系数。从这一点来讲，280nm处的吸收成为蛋白质浓度的方便和精确的测量。
已知ENaC的各亚基的实际浓度允许这些亚基以特定的比例组合，这已通过单细胞的Q-PCR来估量。由于这些蛋白质是膜结合的，它们将需要一定量的去垢剂来保持可溶性。虽然它们保持可溶性是以特定比例组合它们组所需要的，但去垢剂会破坏需要将它们重建入其中以测量活性的脂双层。因此，使用分离的蛋白质重建脂双层要求除去任何去垢剂。去垢剂可通过本领域内任何合适的方法例如本文中描述的透析除去。分离的蛋白质至脂膜中的重建已进行了描述(Grosvenor，W等人(2004)BMC Neurosci.52202-5)，概述于上述实施例中。因为人ENaC的亚基是合成的，因而通过细心的控制，可获得任何假定的咸味觉受体亚基的比例可产生的优于组合物的有利方面。
本发明不限定于上面所描述和例举的实施方案，但能够在所附权利要求的范围内进行变化和改变。
SEQ ID NO1人α的核苷酸序列
atggagggga acaagctgga ggagcaggac tctagccctc cacagtccac tccagggctc atgaagggga
acaagcgtga ggagcagggg ctgggccccg aacctgcggc gccccagcag cccacggcgg aggaggaggc
cctgatcgag ttccaccgct cctaccgaga gctcttcgag ttcttctgca acaacaccac catccacggc
gccatccgcc tggtgtgctc ccagcacaac cgcatgaaga cggccttctg ggcagtgctg tggctctgca
cctttggcat gatgtactgg caattcggcc tgcttttcgg agagtacttc agctaccccg tcagcctcaa
catcaacctc aactcggaca agctcgtctt ccccgcagtg accatctgca ccctcaatcc ctacaggtac
ccggaaatta aagaggagct ggaggagctg gaccgcatca cagagcagac gctctttgac ctgtacaaat
acagctcctt caccactctc gtggccggct cccgcagccg tcgcgacctg cgggggactc tgccgcaccc
cttgcagcgc ctgagggtcc cgcccccgcc tcacggggcc cgtcgagccc gtagcgtggc ctccagcttg
cgggacaaca acccccaggt ggactggaag gactggaaga tcggcttcca gctgtgcaac cagaacaaat
cggactgctt ctaccagaca tactcatcag gggtggatgc ggtgagggag tggtaccgct tccactacat
caacatcctg tcgaggctgc cagagactct gccatccctg gaggaggaca cgctgggcaa cttcatcttc
gcctgccgct tcaaccaggt ctcctgcaac caggcgaatt actctcactt ccaccacccg atgtatggaa
actgctatac tttcaatgac aagaacaact ccaacctctg gatgtcttcc atgcctggaa tcaacaacgg
tctgtccctg atgctgcgcg cagagcagaa tgacttcatt cccctgctgt ccacagtgac tggggcccgg
gtaatggtgc acgggcagga tgaacctgcc tttatggatg atggtggctt taacttgcgg cctggcgtgg
agacctccat cagcatgagg aaggaaaccc tggacagact tgggggcgat tatggcgact gcaccaagaa
tggcagtgat gttcctgttg agaaccttta cccttcaaag tacacacagc aggtgtgtat tcactcctgc
ttccaggaga gcatgatcaa ggagtgtggc tgtgcctaca tcttctatcc gcggccccag aacgtggagt
actgtgacta cagaaagcac agttcctggg ggtactgcta ctataagctc caggttgact tctcctcaga
ccacctgggc tgtttcacca agtgccggaa gccatgcagc gtgaccagct accagctctc tgctggttac
tcacgatggc cctcggtgac atcccaggaa tgggtcttcc agatgctatc gcgacagaac aattacaccg
tcaacaacaa gagaaatgga gtggccaaag tcaacatctt cttcaaggag ctgaactaca aaaccaattc
tgagtctccc tctgtcacga tggtcaccct cctgtccaac ctgggcagcc agtggagcct gtggttcggc
tcctcggtgt tgtctgtggt ggagatggct gagctcgtct ttgacctgct ggtcatcatg ttcctcatgc
tgctccgaag gttccgaagc cgatactggt ctccaggccg agggggcagg ggtgctcagg aggtagcctc
caccctggca tcctcccctc cttcccactt ctgcccccac cccatgtctc tgtccttgtc ccagccaggc
cctgctccct ctccagcctt gacagcccct ccccctgcct atgccaccct gggcccccgc ccatctccag
ggggctctgc aggggccagt tcctccacct gtcctctggg ggggccctga
SEQ ID NO2人α的蛋白质序列
MEGNKLEEQD SSPPQSTPGL MKGNKREEQG LGPEPAAPQQ PTAEEEALIE FHRSYRELFE FFCNNTTIHG
AIRLVCSQHN RMKTAFWAVL WLCTFGMMYW QFGLLFGEYF SYPVSLNINL NSDKLVFPAV TICTLNPYRY
PEIKEELEEL DRITEQTLFD LYKYSSFTTL VAGSRSRRDL RGTLPHPLQR LRVPPPPHGA RRARSVASSL
RDNNPQVDWK DWKIGFQLCN QNKSDCFYQT YSSGVDAVRE WYRFHYINIL SRLPETLPSL EEDTLGNFIF
ACRFNQVSCN QANYSHFHHP MYGNCYTFND KNNSNLWMSS MPGINNGLSL MLRAEQNDFI PLLSTVTGAR
VMVHGQDEPA FMDDGGFNLR PGVETSISMR KETLDRLGGD YGDCTKNGSD VPVENLYPSK YTQQVCIHSC
FQESMIKECG CAYIFYPRPQ NVEYCDYRKH SSWGYCYYKL QVDFSSDHLG CFTKCRKPCS VTSYQLSAGY
SRWPSVTSQE WVFQMLSRQN NYTVNNKRNG VAKVNIFFKE LNYKTNSESP SVTMVTLLSN LGSQWSLWFG
SSVLSVVEMA ELVFDLLVIM FLMLLRRFRS RWPSPGRGGR GAQEVASTLA SSPPSHFCPH PMSLSLSQPG
PAPSPALTAP PPAYATLGPR PSPGGSAGAS SSTCPLGGP
SEQ ID NO3人β的核苷酸序列
atgcacgtga agaagtacct gctgaagggc ctgcatcggc tgcagaaggg ccccggctac acgtacaagg
agctgctggt gtggtactgc gacaacacca acacccacgg ccccaagcgc atcatctgtg aggggcccaa
gaagaaagcc atgtggttcc tgctcaccct gctcttcgcc gccctcgtct gctggcagtg gggcatcttc
atcaggacct acttgagctg ggaggtcagc gtctccctct ccgtaggctt caagaccatg gacttccccg
ccgtcaccat ctgcaatgct agccccttca agtattccaa aatcaagcat ttgctgaagg acctggatga
gctgatggaa gctgtcctgg agagaatcct ggctcctgag ctaagccatg ccaatgccac caggaacctg
aacttctcca tctggaacca cacacccctg gtccttattg atgaacggaa cccccaccac cccatggtcc
ttgatctctt tggagacaac cacaatggct taacaagcag ctcagcatca gaaaagatct gtaatgccca
cgggtgcaaa atggccatga gactatgtag cctcaacagg acccagtgta ccttccggaa cttcaccagt
gctacccagg cattgacaga gtggtacatc ctgcaggcca ccaacatctt tgcacaggtg ccacagcagg
agctagtaga gatgagctac cccggcgagc agatgatcct ggcctgccta ttcggagctg agccctgcaa
ctaccggaac ttcacgtcca tcttctaccc tcactatggc aactgttaca tcttcaactg gggcatgaca
gagaaggcac ttccttcggc caaccctgga actgaattcg gcctgaagtt gatcctggac ataggccagg
aagactacgt ccccttcctt gcgtccacgg ccggggtcag gctgatgctt cacgagcaga ggtcataccc
cttcatcaga gatgagggca tctacGccat gtcggggaca gagacgtcca tcggggtact cgtggacaag
cttcagcgca tgggggagcc ctacagcccg tgcaccgtga atggttctga ggtccccgtc caaaacttct
acagtgacta caacacgacc tactccatcc aggcctgtct tcgctcctgc ttccaagacc acatgatccg
taactgcaac tgtggccact acctgtaccc actGccccgt ggggagaaat actgcaacaa ccgggacttc
ccagactggg cccattgcta ctcagatcta cagatgagcg tggcgcagag agagacctgc attggcatgt
gcaaggagtc ctgcaatgac acccagtaca agatgaccat ctccatggct gactggcctt ctgaggcctc
cgaggactgg attttccacg tcttgtctca ggagcgggac caaagcacca atatcaccct gagcaggaag
ggaattgtca agctcaacat ctacttccaa gaatttaact atcgcaccat tgaagaatca gcagccaata
acatcgtctg gctgctctcg aatctgggtg gccagtttgg cttctggatg gggggctctg tgctgtgcct
catcgagttt ggggagatca tcatcgactt tgtgtggatc accatcatca agctggtggc cttggccaag
agcctacggc agcggcgagc ccaagccagc tacgctggcc caccgcccac cgtggccgag ctggtggagg
cccacaccaa ctttggcttc cagcctgaca cggccccccg cagccccaac actgggccct accccagtga
gcaggccctg cccatcccag gcaccccgcc ccccaactat gactccctgc gtctgcagcc gctggacgtc
atcgagtctg acagtgaggg tgatgccatc taa
SEQ ID NO4人β的蛋白质序列
MHVKKYLLKG LHRLQKGPGY TYKELLVWYC DNTNTHGPKR IICEGPKKKA MWFLLTLLFA ALVCWQWGIF
IRTYLSWEVS VSLSVGFKTM DFPAVTICNA SPFKYSKIKH LLKDLDELME AVLERILAPE LSHANATRNL
NFSIWNHTPL VLIDERNPHH PMVLDLFGDN HNGLTSSSAS EKICNAHGCK MAMRLCSLNR TQCTFRNFTS
ATQALTEWYI LQATNIFAQV PQQELVEMSY PGEQMILACL FGAEPCNYRN FTSIFYPHYG NCYIFNWGMT
EKALPSANPG TEFGLKLILD IGQEDYVPFL ASTAGVRLML HEQRSYPFIR DEGIYAMSGT ETSIGVLVDK
LQRMGEPYSP CTVNGSEVPV QNFYSDYNTT YSIQACLRSC FQDHMIRNCN CGHYLYPLPR GEKYCNNRDF
PDWAHCYSDL QMSVAQRETC IGMCKESCND TQYKMTISMA DWPSEASEDW IFHVLSQERD QSTNITLSRK
GIVKLNIYFQ EFNYRTIEES AANNIVWLLS NLGGQFGFWM GGSVLCLIEF GEIIIDFVWI TIIKLVALAK
SLRQRRAQAS YAGPPPTVAE LVEAHTNFGF QPDTAPRSPN TGPYPSEQAL PIPGTPPPNY DSLRLQPLDV
IESDSEGDAI
SEQ ID NO5人味觉γ的核苷酸序列
atggcacccg gagagaagat caaagccaaa atcaagaaga atctgcccgt gacgggccct caggcgccga
ccattaaaga gctgatgcgg tggtactgcc tcaacaccaa cacccatggc tgtcgccgca tcgtggtgtc
ccgcggccgt ctgcgccgcc tcctctggat cgggttcaca ctgactgccg tggccctcat cctctggcag
tgcgccctcc tcgtcttctc cttctatact gtctcagttt ccatcaaagt ccacttccgg aagctggatt
ttcctgcagt caccatctgc aacatcaacc cctacaagta cagcaccgtt cgccaccttc tagctgactt
ggaacaggag accagagagg ccctgaagtc cctgtatggc tttccagagt cccggaagcg ccgagaggcg
gagtcctgga actccgtctc agagggaaag cagcctagat tctcccaccg gattccgctg ctgatctttg
atcaggatga gaagggcaag gccagggact tcttcacagg gaggaagcgg aaagtcggcg gtagcatcat
tcacaaggct tcaaatgtca tgcacatcga gtccaagcaa gtggtgggat tccaactgtg ctcaaatgac
acctccgact gtgccaccta caccttcagc tcgggaatca atgccattca ggagtggtat aagctacact
acatgaacat catggcacag gtgcctctgg agaagaaaat caacatgagc tattctgctg aggagctgct
ggtgacctgc ttctttgatg gagtgtcctg tgatgccagg aatttcacgc ttttccacca cccgatgcat
gggaattgct atactttcaa caacagagaa aatgagacca ttctcagcac ctccatgggg ggcagcgaat
atgggctgca agtcattttg tacataaacg aagaggaata caacccattc ctcgtgtcct ccactggagc
taaggtgatc atccatcggc aggatgagta tcccttcgtc gaagatgtgg gaacagagat tgagacagca
atggtcacct ctataggaat gcacctgaca gagtccttca agctgagtga gccctacagt cagtgcacgg
aggacgggag tgacgtgcca atcaggaaca tctacaacgc tgcctactcg ctccagatct gccttcattc
atgcttccag acaaagatgg tggagaaatg tgggtgtgcc cagtacagcc agcctctacc tcctgcagcc
aactactgca actaccagca gcaccccaac tggatgtatt gttactacca actgcatcga gcctttgtcc
aggaagagct gggctgccag tctgtgtgca aggaagcctg cagctttaaa gagtggacac taaccacaag
cctggcacaa tggccatctg tggtttcgga gaagtggttg ctgcctgttc tcacttggga ccaaggccgg
caagtaaaca aaaagctcaa caagacagac ttggccaaac tcttgatatt ctacaaagac ctgaaccaga
gatccatcat ggagagccca gccaacagta ttgagatgct tctgtccaac ttcggtggcc agctgggcct
gtggatgagc tgctctgttg tctgcgtcat cgagatcatc gaggtcttct tcattgactt cttctctatc
attgcccgcc gccagtggca gaaagccaag gagtggtggg cctggaaaca ggctccccca tgtccagaag
ctccccgtag cccacagggc caggacaatc cagccctgga tatagacgat gacctaccca ctttcaactc
tgctttgcac ctgcctccag ccctaggaac ccaagtgccc ggcacaccgc cccccaaata caataccttg
cgcttggaga gggccttttc caaccagctc acagataccc agatgctaga tgagctctga
SEQ ID NO6人味觉γ的蛋白质序列
MAPGEKIKAK IKKNLPVTGP QAPTIKELMR WYCLNTNTHG CRRIVVSRGR LRRLLWIGFT LTAVALILWQ
CALLVFSFYT VSVSIKVHFR KLDFPAVTIC NINPYKYSTV RHLLADLEQE TREALKSLYG FPESRKRREA
ESWNSVSEGK QPRFSHRIPL LIFDQDEKGK ARDFFTGRKR KVGGSIIHKA SNVMHIESKQ VVGFQLCSND
TSDCATYTFS SGINAIQEWY KLHYMNIMAQ VPLEKKINMS YSAEELLVTC FFDGVSCDAR NFTLFHHPMH
GNCYTFNNRE NETILSTSMG GSEYGLQVIL YINEEEYNPF LVSSTGAKVI IHRQDEYPFV EDVGTEIETA
MVTSIGMHLT ESFKLSEPYS QCTEDGSDVP IRNIYNAAYS LQICLHSCFQ TKMVEKCGCA QYSQPLPPAA
NYCNYQQHPN WMYCYYQLHR AFVQEELGCQ SVCKEACSFK EWTLTTSLAQ WPSVVSEKWL LPVLTWDQGR
QVNKKLNKTD LAKLLIFYKD LNQRSIMESP ANSIEMLLSN FGGQLGLWMS CSVVCVIEII EVFFIDFFSI
IARRQWQKAK EWWAWKQAPP CPEAPRSPQG QDNPALDIDD DLPTFNSALH LPPALGTQVP GTPPPKYNTL
RLERAFSNQL TDTQMLDEL
SEQ ID NO7人肾δ的核苷酸序列
atggctgagc accgaagcat ggacgggaga atggaagcag ccacacgggg gggctctcac ctccaggctg
cagcccagac gccccccagg ccggggccac catcagcacc accaccacca cccaaggagg ggcaccagga
ggggctggtg gagctgcccg cctcgttccg ggagctgctc accttcttct gcaccaatgc caccatccac
ggcgccatcc gcctggtctg ctcccgcggg aaccgcctca agacgacgtc ctgggggctg ctgtccctgg
gagccctggt cgcgctctgc tggcagctgg ggctcctctt tgagcgtcac tggcaccgcc cggtcctcat
ggccgtctct gtgcactcgg agcgcaagct gctcccgctg gtcaccctgt gtgacgggaa cccacgtcgg
ccgagtccgg tcctccgcca tctggagctg ctggacgagt ttgccaggga gaacattgac tccctgtaca
acgtcaacct cagcaaaggc agagccgccc tctccgccac tgtcccccgc cacgagcccc ccttccacct
ggaccgggag atccgtctgc agaggctgag ccactcgggc agccgggtca gagtggggtt cagactgtgc
aacagcacgg gcggcgactg cttttaccga ggctacacgt caggcgtggc ggctgtccag gactggtacc
acttccacta tgtggatatc ctggccctgc tgcccgcggc atgggaggac agccacggga gccaggacgg
ccacttcgtc ctctcctgca gttacgatgg cctggactgc caggcccgac agttccggac cttccaccac
cccacctacg gcagctgcta cacggtcgat ggcgtctgga cagctcagcg ccccggcatc acccacggag
tcggcctggt cctcagggtt gagcagcagc ctcacctccc tctgctgtcc acgctggccg gcatcagggt
catggttcac ggccgtaacc acacgccctt cctggggcac cacagcttca gcgtccggcc agggacggag
gccaccatca gcatccgaga ggacgaggtg caccggctcg ggagccccta cggccactgc accgccggcg
gggaaggcgt ggaggtggag ctgctacaca acacctccta caccaggcag gcctgcctgg tgtcctgctt
ccagcagctg atggtggaga cctgctcctg tggctactac ctccaccctc tgccggcggg ggctgagtac
tgcagctctg cccggcaccc tgcctgggga cactgcttct accgcctcta ccaggacctg gagacccacc
ggctcccctg tacctcccgc tgccccaggc cctgcaggga gtctgcattc aagctctcca ctgggacctc
caggtggcct tccgccaagt cagctggatg gactctggcc acgctaggtg aacaggggct gccgcatcag
agccacagac agaggagcag cctggccaaa atcaacatcg tctaccagga gctcaactac cgctcagtgg
aggaggcgcc cgtgtactcg gtgccgcagc tgctctccgc catgggcagc ctctacagcc tgtggtttgg
ggcctccgtc ctctccctcc tggagctcct ggagctgctg ctcgatgctt ctgccctcac cctggtgcta
ggcggccgcc ggctccgcag ggcgtggttc tcctggccca gagccagccc tgcctcaggg gcgtccagca
tcaagccaga ggccagtcag atgcccccgc ctgcaggcgg cacgtcagat gacccggagc ccagcgggcc
tcatctccca cgggtgatgc ttccaggggt tctggcggga gtctcagccg aagagagctg ggctgggccc
cagccccttg agactctgga cacctga
备注在位点532处，tac-＞tgc提供了Tyr-＞Cys
SEQ ID NO8人肾δ(具有Y532)的蛋白质序列
MAEHRSMDGR MEAATRGGSH LQAAAQTPPR PGPPSAPPPP PKEGHQEGLV ELPASFRELL TFFCTNATIH
GAIRLVCSRG NRLKTTSWGL LSLGALVALC WQLGLLFERH WHRPVLMAVS VHSERKLLPL VTLCDGNPRR
PSPVLRHLEL LDEFARENID SLYNVNLSKG RAALSATVPR HEPPFHLDRE IRLQRLSHSG SRVRVGFRLC
NSTGGDCFYR GYTSGVAAVQ DWYHFHYVDI LALLPAAWED SHGSQDGHFV LSCSYDGLDC QARQFRTFHH
PTYGSCYTVD GVWTAQRPGI THGVGLVLRV EQQPHLPLLS TLAGIRVMVH GRNHTPFLGH HSFSVRPGTE
ATISIREDEV HRLGSPYGHC TAGGEGVEVE LLHNTSYTRQ ACLVSCFQQL MVETCSCGYY LHPLPAGAEY
CSSARHPAWG HCFYRLYQDL ETHRLPCTSR CPRPCRESAF KLSTGTSRWP SAKSAGWTLA TLGEQGLPHQ
SHRQRSSLAK INIVYQELNY RSVEEAPVYS VPQLLSAMGS LYSLWFGASV LSLLELLELL LDASALTLVL
GGRRLRRAWF SWPRASPASG ASSIKPEASQ MPPPAGGTSD DPEPSGPHLP RVMLPGVLAG VSAEESWAGP
SEQ ID NO9人脑δ(具有C532)的蛋白质序列
MAEHRSMDGR MEAATRGGSH LQAAAQTPPR PGPPSAPPPP PKEGHQEGLV ELPASFRELL TFFCTNATIH
GAIRLVCSRG NRLKTTSWGL LSLGALVALC WQLGLLFERH WHRPVLMAVS VHSERKLLPL VTLCDGNPRR
PSPVLRHLEL LDEFARENID SLYNVNLSKG RAALSATVPR HEPPFHLDRE IRLQRLSHSG SRVRVGFRLC
NSTGGDCFYR GYTSGVAAVQ DWYHFHYVDI LALLPAAWED SHGSQDGHFV LSCSYDGLDC QARQFRTFHH
PTYGSCYTVD GVWTAQRPGI THGVGLVLRV EQQPHLPLLS TLAGIRVMVH GRNHTPFLGH HSFSVRPGTE
ATISIREDEV HRLGSPYGHC TAGGEGVEVE LLHNTSYTRQ ACLVSCFQQL MVETCSCGYY LHPLPAGAEY
CSSARHPAWG HCFYRLYQDL ETHRLPCTSR CPRPCRESAF KLSTGTSRWP SAKSAGWTLA TLGEQGLPHQ
SHRQRSSLAK INIVYQELNY RSVEEAPVYS VPQLLSAMGS LCSLWFGASV LSLLELLELL LDASALTLVL
GGRRLRRAWF SWPRASPASG ASSIKPEASQ MPPPAGGTS DDPEPSGPHLP RVMLPGVLAG VSAEESWAGP
SEQ ID NO10人肾α的基序
MGSQWSLWFGA
SEQ ID NO11人肾δ的基序
MGSLYSLWFGA
SEQ ID NO12，人味蕾δ的基序
MGSLCSLWFGA
SEQ ID NO13人味觉γ(γA)的蛋白质序列
MAPGEKIKAK IKKNLPVTGP QAPTIKELMR WYCLNTNTHG CRRIVVSRGR LRRLLWIGFT LTAVALILWQ
CALLVFSFYT VSVSIKVHFR KLDFPAVTIC NINPYKYSTV RHLLADLEQE TREALKSLYG FPESRKRREA
ESWNSVSEGK QPRFSHRIPP LIFDQDEKGK ARDFFTGRKR KVGGSIIHKA SNVMHIESKQ VVGFQLCSND
TSDCATYTFS LGINAIQEWY KLHYMNIMAQ VPLEKKINMS YSAEELLVTC FFDGVSCDAR NFTLFHHPMH
GNCYTFNNRE NETILSTSMG GSEYGLQVIL YINEEEYNPF LVSSTGAKVI IHRQDEYPFV EDVGTEIETA
MVTSIGMHLT ESFKLSEPYS QCTEDGSDVP IRNIYNAAYS LQICLHSCFQ TKMVEKCGCA QYSQPLPPAA
NYCNYQQHPN WMYCYYQLHR AFVQEELGCQ SVCKEACSLK EWTLTTSLAQ WPSVVSEKWL LPVLTWDQGR
QVNKKLNKTD LAKLLIFYKD LNQRSIMESP ANSIEMLLSN FGGQLGLWMS CSVVCVVEII EVFFIDFFSI
IARRQWQKAK EWWAWKQAPP CPEAPRSPQG QDNPALDIDD DLPTFNSALH LPPALGTQVP GTPPPKYNTL
RLERAFSNQL TDTQMLDEL
SEQ ID NO14人味觉γ(γB)的蛋白质序列
MAPGEKIKAK IKKNLPVTGP QAPTIKELMR WYCLNTNTHG CRRIVVSRGR LRRLLWIGFT LTAVALILWQ
CALLVFSFYA VSVSIKVHFR KLDFPAVTIC NINPYKYSTV RHLLADLEQE TREALKSLYG FPESRKRREA
ESWNSVSEGK QPRFSHRIPL LIFDQDEKGK ARDFFTGRKR KVGGSIIHKA SNVMHIESKQ VVGFQLCSND
TSDCATYTFS SGINAIQEWY KLHYMNIMAQ VPLEKKINMS YSAEELLVTC FFDGVSCDAR NFTLFHHPMH
GNCYTFNNRE NETILSTSMG GSEYGLQVIL YINEEEYNPF LVSSTGAKVI IHRQDEYPFV EDVGTEIETA
MVTSIGMHLT ESFKLSEPYS QCTEDGSDVP IRNIYNAAYS LQICLHSCFQ TKMVEKCGCA QYSQPLPPAA
NYCNYQQHPN WMYCYYQLHR AFVQEELGCQ SVCKEACSFK EWTLTTSLAQ WPSVVSEKWL LPVLTWDQGR
QVNKKLNKTD LAKLLIFYKD LNQRSIMESP ANSIEMLLSN FGGQLGLWMS CSVVCVIEII EVFFIDFFSI
IARRQWQKAK EWWAWKQAPP CPEAPRSPQG QDNPALDIDD DLPTFNSALH LPPALGTQVP GTPPPKYNTL
RLERAFSNSL TDTQMLDEL
SEQ ID NO15人味觉γ(γC)的蛋白质序列
MAPGEKIKAK IKKNLPVTGP QAPTIKELMR WYCLNTNTHG CRRIVVSRGR LRRLLWIGFT LTAVALILWQ
CALLVFSFYT VSVSIKVHFR KLDFPAVTIC NINPYKYSTV RHLLADLEQE TREALKSLYG FPESRKRREA
ESWNSVSEGK QPRFSHRIPL LIFDQDEKGK ARDFFTGRKR KVGGSIIHKA SNVMHIESKQ VVGFQLCSND
TSDCATYTFS SGINAIQEWY KLHYMNIMAQ VPLEKKINMS YSAEELLVTC FFDGVSCDAR NFTLFHHPMH
GNCYTFNNRE NETILSTSMG GSEYGLQVIL YINEEEYNPF LVSSTGAKVI IHRQDEYPFV EDVGTEIETA
MVTSIGMHLT ESFKLSEPYS QCTEDGSDVP IRNIYNAAYS LQICLHSCFQ TKMVEKCGCA QYSQPLPPAA
NYCNYQQHPN WMYCYYQLHR AFVQEELGCQ SVCKEACSFK EWTLTTSLAQ WPSVVSEKWL LPVLTWDQGR
QVNKKLNKTD LAKLLIFYKD LNQRSIMESP ANSIEMLLSN FGGQLGLWMS CSVVCVIEII EVFFIDFFSI
IARRQWQKAK EWWAWKQAPP CPEAPRSPQG QDNPALDIDD GLPTFNSALH LPPALGTQVP GTPPPKYNTL
RLERAFSNQL TDTQMLDEL
SEQ ID NO16人肺γ(X87160)的蛋白质序列
MAPGEKIKAK IKKNLPVTGP QAPTIKELMR WYCLNTNTHG CRRIVVSRGR LRRLLWIGFT LTAVALILWQ
CALLVFSFYT VSVSIKVHFR KLDFPAVTIC NINPYKYSTV RHLLADLEQE TREALKSLYG FPESRKRREA
ESWNSVSEGK QPRFSHRIPL LIFDQDEKGK ARDFFTGRKR KVGGSIIHKA SNVMHIESKQ VVGFQLCSND
TSDCATYTFS SGINAIQEWY KLHYMNIMAQ VPLEKKINMS YSAEELLVTC FFDGVSCDAR NFTLFHHPMH
GNCYTFNNRE NETILSTSMG GSEYGLQVIL YINEEEYNPF LVSSTGAKVI IHRQDEYPSV EDVGTEIETT
MVTSIGMHLT ESFKLSEPSS QCTEGGSDVP IRNIYNAAYS LQICLHSCFQ TKMVEKCGCA QYSQPLPPAA
NYCNYQQHPN WMYCYYQLHR AFVQEELGCQ SVCKEACRFK EWTLTTSLAQ WPSVVSEKWL LPVLTWDQGR
QVNKKLNKTD LAKLLIFYKD LNQRSIMESP ANSIEMLLSN FGGQLGLWMS CSVVCVIEII EVFFIDFFSI
IARRQWQKAK EWWAWKQAPP CPEAPRSPQG QDNPALDIDD DLPTFNSALH LPPALGTQVP GTPPPKYNTL
RLERAFSNQL TDTQMLDEL
SEQ ID NO17人δ受试者DENACA的蛋白质序列
MAEHRSMDGR MEAATRGGSH LQAAAQTPPR PGPPSAPPPP PKEGHQEGLV ELPASFRELL TFFCTNATIH
GAIRLVCSRG NRLKTTSWGL LSLGALVALC WQLGLLFERH WHRPVLMAVS VHSERKLLPL VTLCDGNPRR
PSPVLRHLEL LDEFARENID SLYNVNLSKG RAALSATVPR HEPPFHLDRE IRLQRLSHSG SRVRVGFRLC
NSTGGDCFYR GYTSGVAAVQ DWYHFHYVDI LALLPAAWED SHGSQDGHFV LSCSYDGLDC QARQFRTIHH
PTYGSCYTVD GVWTAQRPGI THGVGLVLRV EQQPHLPLLS TLAGIRVMVH GRNHTPFLGH HSFSVRPGTE
ATIRIREDEV HRLGSPYGHC TAGGEGVEVE LLHNTSYTRQ ACLVSCFQQL MVETCSCGYY LHPLPAGAEY
CSSARHPAWG HCFYRLYQDL ETHRLPCTSR CPRPCRESAF KLSTGTSRWP SAKSAGWTLA TLGEQGLPHQ
SHRQRSSLAK INIVYQELNY RSVEEAPVYS VPQLLSAMGS LCSLWFGASV LSLLELLELL LDASALTLVL
GGRRLHRAWF SWPRASPASG ASSIKPEASQ MPPPAGGTSD DPEPSGPHLP RVMLPGVLAG VSAEESWAGP
SEQ ID NO18人δ受试者DENACD的蛋白质序列
MAEHRSMDGR MEAATRGGSH LQAAAQTPPR PGPPSAPPPP PKEGHQEGLV ELPASFRELL TFFCTNATIH
GAIRLVCSRG NRLKTTSWGL LSLGALVALC WQLGLLFERH WHRPVLMAVS VHSERKLLPL VTLCDGNPRR
PSPVLRHLEL LDEFARENID SLYNVNLSKG RAALSATVPR HEPPFHLDRE IRLQRLSHSG SRVRVGFR