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1。我做了好几次周期分析了，总是死细胞很多，有的结果干脆就不能用。我分析了一下，原因有2：我培养的细胞不好消化，所以我消化时间比较长，并且吹打次数比较多，这样细胞受损比较大；另外我用含1%TRITON的染色液边通透边染色，作用30分钟，鉴于TRITON的作用强烈，对于我已经受损的细胞，30分是不是太长了？或者1%太大？2。我还做膜表面黏附分子（CAM）检测。如果当天不能上机，有什么办法可以保存样品呢？？？请主任赐教！！！多谢！！！
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sumhao 多少毫升的1%的多聚甲醛，加入多少微升的细胞悬液中呢？？？我想知道一个详细的步骤！1%~4%的多聚甲醛都有人用，但因为多聚甲醛有挥发性，我们实验室常常配成4%的。最后一次洗细胞，离心弃上清时一般管里还会残留一点液体，有30微升左右，先用vortex振荡混匀，使细胞重悬。然后边振荡边加入多聚甲醛，以防止细胞成团。至于多聚甲醛的用量是根据样品中的细胞数确定的，也就是最后上机检测时使细胞达到合适的浓度。因为细胞过浓，激光打在液柱上时，细胞间有可能互相阻挡，导致检测不准确；细胞过稀，每个样品检测时间太长，耽误时间，也损耗激光，浪费鞘液。个人认为表型检测时，检测速度在200~400细胞/秒比较合适。一般10 6细胞加400微升多聚甲醛比较合适，上下波动可以根据自己的经验。
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TCR 1%~4%的多聚甲醛都有人用，但因为多聚甲醛有挥发性，我们实验室常常配成4%的。最后一次洗细胞，离心弃上清时一般管里还会残留一点液体，有30微升左右，先用vortex振荡混匀，使细胞重悬。然后边振荡边加入多聚甲醛，以防止细胞成团。至于多聚甲醛的用量是根据样品中的细胞数确定的，也就是最后上机检测时使细胞达到合适的浓度。因为细胞过浓，激光打在液柱上时，细胞间有可能互相阻挡，导致检测不准确；细胞过稀，每个样品检测时间太长，耽误时间，也损耗激光，浪费鞘液。个人认为表型检测时，检测速度在200~400细胞/秒比较合适。一般10 6细胞加400微升多聚甲醛比较合适，上下波动可以根据自己的经验。【这一点很重要】：最后一次洗细胞，离心弃上清时一般管里还会残留一点液体，有30微升左右，先用vortex振荡混匀，使细胞重悬。然后边振荡边加入多聚甲醛，以防止细胞成团。【我们这里有一位研究生，因为没有vertex就加入固定剂PFA, 后来测定是细胞形态在FSC/SSC图中简直没法看，第二次注意了，出来的细胞形态就漂亮了】
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bengbu_bli 编辑于
补充一点：检测CAM的抗体是直标的，一个PE标记，一个FITC标记。
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有关流式细胞术的几个问题
各位前辈，小妹最近做实验需要用到流式细胞仪进行绝对计数，在这里有几个问题想请教大家
1、绝对计数的方法是什么，是否一定要用到计数珠，计数珠选择的时候有什么要求
2、用于仪器校准与设门的标准微球和计数珠有什么区别，如果只买标准微球，是否可以当成计数珠使用？
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【求助】请教关于流式细胞检测胞内蛋白的问题
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这个帖子发布于7年零99天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近做流式，因为染胞内蛋白，但是每次固定，穿孔之后，感觉细胞就变的黏黏的，而且离心洗涤了几次之后，感觉细胞都快没有了，检测的时候觉得细胞液特别少，而且碎片比较多，怎么回事啊？我的步骤是这样的：首先胰酶消化细胞之后，终止消化，离心，PBS洗涤，离心收集细胞，这都没问题，然后加百分之3的多聚甲醛固定细胞室温30分钟之后，离心，去上清，加Triton-100穿透5分钟（这个时间是我们做免疫荧光的时候老师告诉我们的2-5minutes no more than 5 minutes）.接下来离心，染一抗，二抗，就觉得细胞好少啊，而且都好像跟刚开始消化下来离心的细胞不一样。黏黏的，特别少，怎么回事呢？请求高手指点万分感激！！
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细胞固定打孔后细胞碎片变多怎么会正常呢！细胞固定后其物理性质会发生变化，在FSC-SSC中的位置的确会发生改变，但是也只是细胞的物理性质发生变化，并不会导致细胞碎片增多，细胞碎片增多，只能说明你固定打孔不当。
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应该是你固定穿孔方法不合适造成的。固定用4%的多聚甲醛。穿孔不要用Triton-100，用皂苷或者其他流式细胞术适合的打孔剂。
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ebioscience 上有一个介绍int让cellular stainging 的protocol，我们实验室就是严格按照这个做的，效果很好。当然也可以买它的fixation和permeablization 的试剂盒，效果更佳。固定之后觉得细胞好像变少，离心后看不见pellet是很正常的（我2*10^6个细胞固定破膜厚后都看不见pellet的）还有碎片比较多都是很正常的，细胞的FSC SSC都会改变，需要重新做调整。
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【求助】关于流式检测细胞增殖分化与凋亡的问题
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这个帖子发布于9年零334天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
有三个问题1：用流式检测细胞的增殖分化是不是就是平常所说的检测细胞周期？2：有人说，检测周期的细胞可以保存一段时间再做也行，但检测凋亡的话必须是新鲜细胞要马上做？是不是这样？3：检测增殖分化跟检测凋亡能不能同时做，比如现在我有一管细胞，能不能上机后即做增殖分化又做凋亡？是不是老师把这几个参数都设定就可以一起做？望高手指教，谢谢啦！
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1:流式检测细胞增殖分化是说的细胞周期2:细胞周期的细胞尽量不要保存.我曾经做过一个试验,把细胞周期固定不同时间上机检测,发现时间越长越不理想,CV值就会增大.凋亡如果是Annexin v和PI双染,标记完必须马上检测3:细胞周期其实就是用PI染色,PI也是检测凋亡的一个指标,检测周期时,如果在G1期前面有一个峰通常就是我们说的凋亡峰.通常不建议这么做凋亡,现在一般都是Annexin v和PI双染,这样即可以看到死亡细胞,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞哦.
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谢谢drzhaopeng！！
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如果只是筛选实验，可以通过细胞周期中亚二倍体峰来判断是否有凋亡。但结果不可靠，需要通过Annexin v和PI双染来检验。
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