生物通编者按：尽管第一个microRNA是在1993年发现的，但直到最近几年，人们才开始了解这种小RNA分子的大作用。miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。
然而，miRNA很小，这就增添了研究的难度。如何从细胞中提取和纯化miRNA？如何上调或下调特定的miRNA？如何验证结果？全靠自己摸索，体会是很深，但时间也花不少。生物通收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验，这将让你少走弯路。
Q1：您使用什么方法来上调或下调特定的miRNA？为什么？
Galina Gabriely（哈佛大学）
对于miRNA的下调，我们使用修饰的反义寡核苷酸，因为它们能产生最特异的抑制。此外，我们也使用LNA修饰的oligo。这些oligo与miRNA的高亲和力结合，提供了强的抑制，不过它们偶尔会有脱靶效应。对于上调，我们使用Ambion的合成miRNA模拟物。
Peng Jin（埃默里大学）
我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA，及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。
载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA。对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA，它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA，要么使用miRNA海绵（miRNA sponge），它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。
Winston Kuo（哈佛大学）
目前有两种通用策略：1) 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达；2) 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。方法的选择取决于实验的设计。
一般说来，我们倾向于外源试剂的转染。载体/病毒的策略还依赖Drosha/Dicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。在人类癌细胞系中曾报道过Drosha和Dicer水平的miRNA加工缺陷。此外，Exportin 5也被认为是细胞和小鼠模型中miRNA生物发生途径的瓶颈。外源过表达可饱和Exportin 5，从而胜过内源小RNA序列。极端的情况下会引起细胞或动物死亡。外源双链转染后，直接进入RISC复合物中，因而绕过了这些陷阱。
当然，在需要持久的功能获得或功能丧失时，还需要载体或病毒的稳定表达。稳定的细胞系必须小心地建立，采用病毒滴度测定来避免上述问题。
Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）
对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。有时候，我们也用合成的miRNA模拟物来瞬时转染细胞，以过表达miRNA。
为了抑制miRNA，我们一般使用市场上的反义寡核苷酸。我们使用Dharmacon和Exiqon的抑制剂都获得了成功。这些试剂的局限在于它们只能瞬时作用。为了实现稳定抑制，我们开始用所谓的miRNA海绵。它们实际上是有着多个miRNA结合位点的捕获转录本，能隔离细胞中有活性的miRNA。
Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）
我们主要使用慢病毒或反转录病毒系统，因为我们主要研究原代细胞，而且需要长时间的持续表达。取决于细胞类型，我们也使用lipofectamine或Amaxa来瞬时转染。对于下调，我们正使用miRNA海绵。对于短期研究，miRNA抑制剂的瞬时转染效果也很好。
Q2：如何验证miRNA上调或下调的结果？
Galina Gabriely（哈佛大学）
为了评估处理后miRNA的活性，我们测定了与miRNA结合位点融合的萤光素酶的表达。不过，评估miRNA活性的最佳方法是评估它的天然靶点的表达（如果miRNA靶点已知）。这可以通过western blot分析来进行。miRNA表达的调节可用northern blot分析来评估miRNA的表达水平。在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。
Winston Kuo（哈佛大学）
我们使用几种策略，包括miRNA qPCR，miRNA northern blot，萤光素酶报告分析，mRNA靶点的qPCR，以及蛋白靶点的western blot。在上面我已经讨论了miRNA qPCR和northern blotting。这些能够直接检测miRNA过表达或下调。萤光素酶报告分析包括3’-UTR序列克隆在萤光素酶编码序列的下游。这些3’-UTR包含了人工的miRNA同源位点或已验证mRNA靶点的内源序列。后一个策略中的关键对照是生成假定同源位点上种子序列的点突变。这些点突变将使miRNA不能调节萤光素酶的表达。
Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）
为了验证miRNA上调，我们还是使用northern blotting或实时定量PCR来测定miRNA的丰度。测定miRNA的抑制就没那么简单。反义oligo确实降低了miRNA的丰度。因此，你也可以用同样的方法来监控miRNA抑制。不过，体内miRNA的隔离不会总是让miRNA丰度下降。另一个方法是用报告基因重组子来监控miRNA的抑制。miRNA会抑制报告基因的表达，除非它的活性受阻。当然，这种报告基因的使用一般受限于细胞培养环境。
Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）
这些实验中的关键一步是：通过转染或转导细胞，你有效地改变了它们，因此你的确需要很多对照，来确认你所看到的结果是来自miRNA的表达或下调。这对miRNA尤其重要，因为在很多情况下，你并不期待一个强的表型，但是你在寻找微调基因表达的温和效果。我想你至少需要目的miRNA之外的miRNA和种子区域的突变体。我还推荐使用不同方法来设法获得相同的结果。
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进行GO和KEGG富集分析时，为什么上调和下调基因分开？
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这几天看了几篇基因芯片数据分析的文章，文中进行GO和KEGG富集分析时，上调和下调基因分开分析的。1、不知为什么要分开？
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产生不同的生物学效应，当然要分别分析咯
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bioinfomania 产生不同的生物学效应，当然要分别分析咯上调或下调基因产生不同生物学效应。那反过来，不同的生物学效应的产生难道全是基因上调或下调？某个生物学效应的产生应该多个基因共同表达的结果，不论是上调还是下调，一起参与进来的啊？
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丁香园准中级站友
楼主问的这个问题很复杂1 为什么要分开讨论？因为我们希望通过看显著上调或下调的基因中通过GO和KEGG注释，归类之后有没有你所关注的科学问题2 基因不是单独作用的，所以你可能会发现希望上调的结果下调了，希望下调的结果上调了，这个就需要你做PPI的相互作用网络分析了3 以上是基本层次的，目前比较好的是做到IPA（ingenuity pathway analysis）主要对医学和动物模型（大小鼠）相关研究有用，对上下调的基因数据做一个完整的整合分析4 结合你感兴趣的点做qRT验证和WB说明你的上下调和你的预测是正确的
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关于丁香园404 - 找不到文件或目录。
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您要查找的资源可能已被删除，已更改名称或者暂时不可用。KRAS突变的结肠癌细胞中环状RNA下调并分泌至外泌体中
&&11月28日，美国范德堡大学Zhang Bing团队在Nature子刊 Scientific Reports杂志在线发表了一项环状RNA的研究成果，报道在KRAS突变的结肠癌中环状RNA下调，并且发现这些环状RNA可进入外泌体（Dou et al., 2016）。& & &文中作者用到了三种结肠癌的细胞株：DLD-1，DKO-1和DKs-8。其中DLD-1同时携带了野生型和G13D突变的KRAS，DKO-1只有突变型的KRAS而DKs-8只有野生型。通过RNA-Seq，作者分析了这三种细胞中环状RNA的总体情况，发现相对于DKs-8，另两种细胞中的环状RNA的表达量总体呈现下降状态。作者进一步在另外两种结肠癌细胞系中验证了该结论，HCT116 为KRAS突变的细胞株而HKe3为KRAS不突变的细胞，测序结果表明HCT116的环状RNA表达总体低于HKe3。作者还发现结肠癌相关的环状RNA存在于外泌体中。文中环状RNA如何分析的？&&&&&&&&作者在本文中选择了不同KRAS突变状态的细胞株为研究对象，通过RNA-Seq实验分析他们环状RNA的差别。文中采用的分析策略基本参考了目前主流的RNA-seq分析环状RNA的流程，数据mapping的时候采用了多位点比对校准，有效降低了假阳性和假阴性。概括而言，首先将每个双端测序Read的两端分别进行基因组mapping，能够正确mapping的reads去除（属于正常剪切的产物），剩余的reads两端分别进行允许多位点mapping到基因组（multiple mapping），以确定它们的位置，再将其中正向跳跃式拼接的产物去除，得到反向拼接的Reads信息。最终再通过分析拼接位点是否符合GU/AG规则确定最终的环状RNA候选Reads。文中测序用的三个细胞株均作了两次的生物学重复。本文测序建库过程并未用RNase R消化处理。每个测序样本的测序通量大于100M数目的有效Reads。最终获得了1620种高可信度的环状RNA信息，其中1395种收录在CircBAse数据库中。作者也进行了RNase R消化后验证，在DKO-1 和 DKs-8细胞中RNA经过RNase R消化后验证了风度最高的前四种环状RNA，结果证明符合预期。图1 环状RNA分析流程与主要结果 （来自(Dou et al., 2016)）作者如何发现环状RNA表达量与KRAS突变的关系的？作者选择了这三种细胞株很有代表性，分别代表了杂合和纯合型KRAS突变以及纯合野生型，这项研究中作者一开始的目的便是试图找出与KRAS突变状态对应的环状RNA表达特征。于是作者就分析了三种细胞株中环状RNA表达的总体差异状况，分析过程中发现了患者环状RNA表达量与KRAS突变有明显的对应关系：携带突变的KRAS的细胞环状RNA表达量明显低于野生型！于是作者就针对这一发现设计了后续的验证实验，形成了本文的故事。至于KRAS突变是否会影响个别环状RNA的表达状态，文中没有相关的描述。一个非常重要的问题是，作者是以什么作为参照分析出了KRAS突变的细胞中环状RNA表达下降的？高通量测序数据的分析中用到了同一种circRNA在不同细胞株中Reads数目进行比较分析，从总体的数据来看，KRAS突变的细胞中呈现明显的下调趋势。数据进行归一化处理采用的是EdgeR R package (version 3.6.8)，里面采用的normalization方法是Trimmed Mean of M-values，能很好的避免系统化的偏差。因此深度测序中分析到的circRNA表达整体下调是较严谨的结论。作者还进行了QPCR验证，挑选了几个有代表性的circRNA以GAPDH为内参，分析了三种细胞中表达情况，结果符合预期。为进一步验证，作者又针对另一种KRAS突变细胞HCT116 及KRAS不突变的细胞株HKe3进行了验证实验，结果符合预期。表明KRAS突变后环状RNA表达下调是普遍现象。图2 不同KRAS突变状态细胞中环状RNA表达比较 （来自(Dou et al., 2016)）外泌体中存在环状RNA& & &之前已有报道表明外泌体中携带环状RNA，于是作者也分析了三种细胞培养基中外泌体环状RNA 的情况，分别进行了三次生物学重复。由于DKs-8细胞在三次重复实验中的变异最小，于是作者挑选这个细胞的数据进行分析。作者也挑选了有代表性的环状RNA在三种细胞株中进行验证，发现相对于DKs-8，在DLD-1的外泌体中circFAT1明显下调而circRTN4上调最明显，这些基因所对应的线性mRNA变化不明显。图3&外泌体中存在环状RNA （来自(Dou et al., 2016)）环状RNA与线性RNA比例分析& & &由于建库的过程没有用RNase R消化，因此可以直接在测序结果中分析环状RNA与对应的线性RNA的比例。作者选择外显子所对应的环状RNA和线性RNA的Reads进行比较。外泌体的测序结果也进行了类似的分析。图4&环状RNA与线性RNA表达比较（来自(Dou et al., 2016)）&&&&&本文的研究为结肠癌环状RNA研究提供了新的数据和思路。尤其是本文所发现的KRAS突变导致环状RNA总体表达下调的现象以及在外泌体中发现的环状RNA都为环状RNA研究提供了有价值的参考。参考文献：Dou, Y., Cha, D.J., Franklin, J.L., Higginbotham, J.N., Jeppesen, D.K., Weaver, A.M., Prasad, N., Levy, S., Coffey, R.J., Patton, J.G., et al. (2016). Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes. Sci Rep 6, 37982.文 | circRNA&本文为作者授权发布仅为作者观点，不代表肽度时界立场，转载请联系医学科研干货免费下载，请关注“肽度时界”公众号，关注后回复“指定数字”获取：&1.医学科研实验常用protocol--回复“001”领取2.质粒图谱大全--回复“002”领取3. 医生晋升方法/执业医生题库/晋升程序与制度/考试口诀等--回复“003”领取4.中国互联网预约挂号服务市场专题研究报告2016--回复“004”领取5.&科研必备软件（12大分类50款）免费下载&--回复“005”领取&6. 2016年全球二代基因测序行业投研报告 --回复“006”领取&7. lncRNA超级干货（68篇文献免费阅读） --回复“007“领取&8. SCI论文超级干货合集（SCI论文写作技巧+配图软件+施一公大咖经验+文献检索+SCI经验书籍） --回复“008” 领取&9. 中国移动医疗市场年度研究报告2016 --回复“009”领取&10.信号通路与信号转导系列文件+Cell网站细胞信号通路图（超多干货）--回复“010”领取
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一个家族的基因们在一个生物体中可以分别上调和下调吗？
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这个帖子发布于11年零358天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我作了两个个体的cDNA基因芯片，结果发现同一个基因家族的不同成员有分别上调和下调的。分析了SAGE资料，结论还是这样。按理说相同基因家族的表达模式应该是相似的。请问这种现象在生物学上真有什么说头；还是实验误差所致？谢谢。
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daweiwei 编辑于
不是太清楚。是哪一个基因家族呢？两个个体的遗传背景有关联吗？是什么样的个体呢，是细胞、组织？两个个体是否处于相同的状态吗？
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关系到3个基因家族。两个个体的遗传背景无关联。是组织。是相同状态。更详细信息在今天晚些时候会继续提交出来。
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接上面的回答：是一种腺癌组织和其周围的正常对照组织。下调的有：ANXA1、2；KRT 5；S110A2上调的有：ANXA10；KRT 8、20；S110A16、S110P不过老实说现在我觉得这个问题太大了，很难深究的了.....
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