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实 验 须 知1．学生应本着认真、积极的态度，在教师的指导下，完成每次实验。不仅要明白实 验的原理、步骤和关键，还要能发现问题，积累经验，并对实验结果进行分析讨 论。 2．实验课前应当认真预习，并书写简单的预习报告。实验过程中，严格遵守操作规 范，实验结果和数据应如实记录，并当堂写出原始实验结果记录，经教师检查同 意并签字后，方可离开。实验报告应在实验后一天内完成并交到指定地点。 3．遵守课堂纪律，不得迟到早退，实验室内不得吸烟、饮食、大声喧哗，学生之间 应互助友爱。 4．爱护实验器材。在了解仪器性能和操作规程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆 卸或将其带出室外。实验过程中，如发现仪器损坏或运转异常，应立即告知指导 教师。公用试剂用毕应立即盖好，放回原处，实验中应注意节约。 5．注意安全。对腐蚀性试剂或易燃有机溶剂的操作应格外小心；水电煤气在停用时 应及时关闭。 6．学生应分组轮流值日，负责实验室的卫生和安全。1安 全 措 施1．进入实验室必须穿实验工作服。 2．实验室内严禁吸烟，易燃易爆物品应远离火源。低沸点的有机溶剂，不得在火焰 上直接加热；必须加热时，可在水浴进行。 3．使用电器设备要严防触电。切忌用湿手触摸电器。发现仪器漏电时，立即报告并 停止使用。万一发生触电事故，应立即关闭电源，并用干木棍将导线挑离被电者 身体；对呼吸停止者， 应立即进行人工呼吸，并及时送医院抢救。 4．强酸、强碱液体或剧毒液体，不得用口经吸量管吸取，必须使用橡皮球，万一不 慎吸入口内或沾及皮肤，应立即用清水多次漱口或局部冲洗。若为强碱灼伤，清 洗后可用 5％硼酸溶液清洗；若为强酸灼伤，水洗后可用 5％碳酸氢钠溶液清洗。 严重灼伤者，应立即将残留在身体上的液体轻轻冲洗后，送医务部门处理。 5．用后的浓酸、浓碱残液，应倒入指定的容器。不要直接倒入水池内，以免蚀损水 管；若少量残液已倒入池内，应立即放水冲稀流走。 6．万一着火，不要惊惶失措，要立即切断火源和电源，搬走易燃物品，同时立即报 告指导老师进行紧急处理，严防火势蔓延；若火势蔓延，应立即报警。 7．分子生物学实验废弃物的处理 溴化乙锭 （EB） ：溴化乙锭是强诱变物，并有中度毒性。使用时应戴一次 性手套，实验操作宜固定在一定的区间、使用相对固定的容器。实验结束后，在 教师的指导下统一进行回收处理。 细菌培养物：细菌培养物及所接触的平皿应在 121℃、30 min 消毒后方可丢 弃。2实验一质粒 DNA 的提取纯化、限制性酶切及电泳检测内 容 提 要本实验采用碱裂解法提取细菌细胞中的质粒DNA， 经酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇 沉淀等步骤，从而得到适用于基因操作的质粒DNA。 采用分子生物学软件查找质粒DNA的酶切位点，然后利用限制性内切酶对质粒 DNA进行酶切反应， 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶成像系统进行分析鉴定。 本实验要求： 1．通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。 2．掌握质粒DNA的限制性内切酶酶切分析，了解内切酶的性质。 3．学习DNA的电泳检测。 原 1．质粒DNA的提取 把一个目的DNA片段通过重组DNA技术，进入受体细胞中去进行繁殖和表达的 工具叫载体(Vector)。质粒(Plasmid)作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要 载体，广泛应用于基因操作的各个方面。因此，质粒的分离与提取是分子生物学中 最常用、最基本的实验技术。 质粒是一种染色体外的DNA分子，其大小范围从1-200kb不等。大多数来自细菌 细胞的质粒为双链、共价闭合环状的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子 代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在细胞内的复制一般 有两种类型：紧密控制型和松驰控制型。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然 质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基 因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉 了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。通常所用的质 粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，本实验提取pUC19质粒。 理3从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收 集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过 程。碱裂解法的原理是：碱性条件下，用十二烷基磺酸钠(SDS) 破坏菌体细胞壁， 并使菌体蛋白质和染色体DNA变性，双链解开。质粒DNA具超螺旋闭合环状结构， 虽变性但两条互补链不会完全分离。当pH被调至中性后，质粒DNA可以恢复构型， 并以溶解状态存在于液相。而细菌染色体DNA比质粒大得多，难以复性，与变性的 蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，可以离心除去。 2．质粒DNA的限制性酶切及电泳检测 限制性内切酶（restriction enzyme）存在于细菌细胞中，起防御噬菌体感染的作 用。由于它们对 DNA 的剪切作用，因此内切酶可作为分子生物学研究者的“剪刀”广 泛应用于基因操作中。 限制性核酸内切酶可分为三类， 重组 DNA 技术中常用的限制性核酸内切酶为Ⅱ 类酶。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列 (如 EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序 列。 内切酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA 片段(如 SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')； 有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 本实验是对提取的质粒 pUC19 进行酶切分析。首先需要应用分子生物学软件分 析质粒的酶切位点，推荐使用的软件有：Primer Premier 5.0、Vector NTI、DNAMAN 和 NEB-cutter 等。DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列 位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在 DNA 序 列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建 立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长 度多态性)技术更是建立在它的基础上。 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。在电 场中， 在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移， 其迁移速率由 DNA 的分子大 小、构象等因素决定。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离 心法）所无法分离的 DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) 染色，在紫外光下至少可以检出 1-10ng 的 DNA 条带，从而可以确定 DNA 片段在凝胶中的位置。 此外， 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA 条带， 用于以后的克隆操作。4一、主要仪器、 材料和试剂 1．仪器 微量移液器(20μl，200μl，1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压 蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅等 水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液器，电炉， 紫外透射仪，凝胶成像系统。 2．材料 含 pUC19 的 E. coli DH5α，1.5mL 离心管(又称 eppendorf 管)，离心管架。 质粒 DNA（pUC19） ：本实验提取纯化。 限制性内切酶 EcoR I 和 Hind Ⅲ及其缓冲液：购自上海生工。 DNA Marker 和琼脂糖(Agarose)：购自上海生工。 3．试剂 （1） LB 液体培养基： 蛋白胨（Tryptone） NaCl 高温高压灭菌 20 分钟。 （2）LB 固体培养基：液体培养基中每升加 15g 琼脂粉，高温高压灭菌。 （3）溶液Ⅰ： 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0)。 高温高压灭菌 15 分钟，储存于 4℃冰箱。 （4） 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH 1％ SDS，使用前现用现配。 （5）溶液Ⅲ： 5 mol/L KAc 60mL 冰醋酸 11.5mL H2O 28.5mL 高温高压灭菌后，4℃保存。 （6）苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） ：pH8.0，棕色玻璃瓶中 4℃保存。 （7）RNA 酶 A（RNase A）母液： 将 RNase A 溶于 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中，配成 10g 10g， 酵母提取物（Yeast extract） 5 g 溶于 800mL 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5，加去离子水定容至 1 升，510mg/mL 的溶液，于 100℃加热 15 分钟。冷却后用 1.5mL 离心管分装成小份 保存于-20℃。 （8）TE 缓冲液： 10 mmo/L Tris?Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后 4℃储存。 （9）50×TAE 电泳缓冲液： 242g Tris 57.1 mL 冰乙酸（17.4 mol/L） 200mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）补足至 1L （10）6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 （11）溴化乙锭(EB)溶液母液：将 EB 配制成 10mg/mL，用铝箔包裹容器，储于室 温。二、操作步骤 1．质粒DNA的提取 （1）挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于 2.0mL LB（含抗生素，本实验为 50μg/mL 的氨苄青霉素）液体培养基中，37℃振荡培养过夜（约 12-14 小时） 。 （2）取 1.5mL 菌液移入离心管中，室温 8 000 rpm 离心，弃上清，将离心管倒置， 使液体尽可能流尽。 （3）将细菌沉淀重悬于 100μl 预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 （4）加入 200μl 新鲜配制的溶液Ⅱ，温和翻转数次混匀，并将离心管放置于冰上 3-5 分钟，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清） 。 （5）加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，此时可见白色絮状沉淀， 可在冰上放置 3-5 分钟。 （6）4℃下，12 000 rpm 离心 5 分钟，吸取上清液至新的离心管中。 （7）加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃下 12 000 rpm 离心 5-10min。 （8）小心移出上清于一新离心管中，加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冰上放 置半个小时，4℃下 12 000 rpm 离心 5-10min。 （9）用 400μl 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀 1-2 次，4℃下 8 000 rpm 离心 5-10min，弃 上清，将沉淀在室温下晾干。 （10）用 20-50μl TE（含 RNase A 20μg/mL） ，37℃水浴半小时以降解 RNA，-20 ℃保存备用。 2．质粒DNA的限制性酶切及电泳检测 2.1 DNA 酶切反应6（1）利用分子生物学软件 Primer Premier 5.0 或 Vector NTI 查找质粒 DNA 的酶切位 点，选择相应的限制性内切酶，预测酶切产物的电泳结果。 （2） 1.5mL 离心管， 取 用微量移液器分别加入 DNA 5μg 和 10 倍的反应缓冲液 2μl， 再加入重蒸水使总体积为 19μl，将管内溶液混匀后加入 1μl 酶液，充分混匀。 使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 （3）混匀反应体系后，将离心管置于浮子（或插在泡沫塑料板上） ，37℃水浴保温 2-3 小时，使酶切反应完全。 （4）每管加入 10 倍的上样缓冲液，充分混匀以停止反应，置于冰箱中保存备用。 2.2 琼脂糖凝胶的制备及 DNA 电泳检测 （1）取 50×TAE 缓冲液 20mL 加水至 1000mL，配制成稀释缓冲液，待用。 （2）胶液的制备：称取 0.4g 琼脂糖，置于 200mL 锥形瓶中，加入 50mL TAE 稀释 缓冲液，放入微波炉里(电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为 0.8 ％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶 液。 （3）胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约 1cm)紧密封住。将封好 的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面 保持 1mm 左右的间隙。向冷却至 50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB 溶 液使其终浓度为 0.5μg/mL(也可不把 EB 加入凝胶中， 而是电泳后再用 0.5μg/mL 的 EB 溶液浸泡染色)。 用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧， 待 琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶 层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出 现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内 加入 TAE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 （4）加样：取 10μl 酶解液与 2μl 6×载样液混匀，用微量移液器小心加入样品槽中。 若 DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容 量。每加完一个样品要更换 tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作。 （5）电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在 60-80V，电 流在 40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时，停止电泳。 （6）染色：未加 EB 的胶板在电泳完毕后移入 0.5μg/mL 的 EB 溶液 或 Gelred 染液 中，室温下染色 20-25 分钟。 （7）观察和拍照：采用凝胶成像系统进行。7三、思考题 1．本实验所提取的 pUC19 质粒的基本性质有哪些？ 2．使用碱裂解法提取质粒 DNA 操作过程中应注意哪些问题？ 3．质粒 DNA 的纯化需要那些试剂？它们发挥怎样的作用？ 4．使用分子生物学软件分析 pUC19 的多克隆位点都有哪些内切酶切点？ 5．采用两种内切酶来分析质粒如何提高酶切效率？ 6．琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？8实验二基因组 DNA 的提取内 容 提 要以枯草芽孢杆菌为材料，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）提取枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis）的基因组DNA作为基因扩增的模板，并测定其含量和纯度。 本实验要求：提取高质量的基因组DNA为下一步的基因操作准备。原理高纯度、高分子量的基因组DNA是构建基因组文库、Southern 杂交(包括RFLP) 及PCR等后续的分子生物学操作的基础。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与 细胞器或质粒等小分子DNA分离。 加入一定量的异丙醇或乙醇， 基因组的大分子DNA 即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA 则只形成颗粒 状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械 断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA 时应尽量在温和的条件下操作， 如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构 建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb 以上，否则酶切后两边都带合适末端的 有效片段很少。而进行RFLP 和PCR 分析, DNA长度可短至50kb，在该长度以上， 可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR 所扩增的片段(一般2kb 以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种 类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在 提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用 的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较 强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和 酚类物质。 DNA的含量与纯度在研究工作中十分重要，常常需要测定。目前使用较多和较 简便的是紫外吸收法。核酸在260nm波长有一特征吸收峰，根据其光密度（OD）值 可计算DNA浓度。蛋白质在260nm波长处有一特征吸收峰，在260nm处的吸收值仅为 核酸的十分之一或更低，因此当核酸样品中蛋白质含量较低时，对核酸的紫外测定9影响不大。DNA的260nm与280nm吸收比值在1.8左右，当制品中蛋白质含量较高时 此比值下降，比值大于2时表明RNA及核酸碎片多，比值在1.8-1.99表明纯度较好。一、主要仪器、 材料、和试剂 1．仪器 移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅，紫外可见分光光度计。 2．实验材料 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 3．试剂 （1） CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于 80mL H2 O，缓慢加入 10g CTAB，加水 至 100mL。 （ 2 ） 氯 仿 : 异 戊 醇 (24:1) ， 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1) ， 异 丙 醇 ， 70% 乙 醇 ， TE （10mMTris-HCl ， 粉剂)，5mol/L NaCl。 二、操作步骤 1．取 100mL 过夜培养的菌液，5000 rpm 离心 10 分钟，弃上清液。 2．菌体沉淀用 10 mL TE 悬浮，加 0.5mL 10% SDS，50μl 蛋白酶 K，混匀，37℃保 温 1 小时。 3．加 1.5mL 5mol/L NaCl，混匀。加 1.5mL CTAB/NaCl 溶液，混匀，65℃保温 20 分 钟。 4．用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 抽提，5000rpm 离心 10 分钟，移取上清液至 干净离心管。 5．用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。 6．加 1 倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止 10 分钟，10 000rpm 离心 15 分钟得 到 DNA 沉淀。 7．加入 700μl 70%乙醇，70μl 3M NaAc 漂洗 DNA 沉淀，溶解于 1mL TE，-20℃保 存。 8．去除 RNA：加 5μl RNase 加 1/10 体积 3M NaAc 加 2 倍体积无水乙醇 10 分钟后， 将 DNA 沉淀溶于 1mL TE，-20℃保存。 9．用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的完整性。 10．用分光计测定浓度及纯度：产品 DNA 溶液用 TE 缓冲液适当稀释后以 TE 调零， 1mMEDTA, pH8.0） ，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/mL 或10在 260nm 和 280nm 处分别测光密度 OD 值，计算 DNA 浓度（经验公式 ug/mL=OD260×50×稀释倍数）以及含量、产率计算 OD260/OD280 比值，评价 其纯度。三、思考题 1．如何利用分子生物学数据库找到某一物种的基因与基因组信息？ 2．为什么构建DNA 文库时，一定要用大分子DNA？11实验三PCR技术（聚合酶链式反应）扩增目的基因内 容 提 要利用PCR技术扩增目的基因是一个设计性实验。首先对数据库进行基因检索， 并以此为模板，利用分子生物学软件设计引物；然后使用PCR仪进行基因扩增，并 对产物进行电泳检测，凝胶成像系统分析实验结果。此外，还可以用纳米材料来优 化反应条件，提高基因扩增效率。 本实验要求： 1．能够使用 Primer Premier 5.0 等分子生物学软件设计和分析引物。 2．掌握PCR的原理和技术，并能够对PCR反应进行优化。 3．初步学习利用NCBI（美国国立生物技术信息中心）等生物信息学数据库。 原 理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外模拟自然DNA复 制过程的核酸扩增技术，亦称为体外酶促基因扩增。PCR与分子克隆和核酸序列分 析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作的基础。近年来伴随着PCR技术 的发展，PCR不但可以对目的基因进行定性，而且可以定量（即原始模版的确切数 目），因此广泛应用于遗传学、微生物学、医学乃至整个生命科学的研究中。 PCR的原理类似于DNA的天然复制过程。利用耐热的DNA聚合酶，在待扩增的 基因片段两侧和与其互补的两个引物，经过变性、退火和延伸等三步的一个循环， 实现模板DNA拷贝数增加一倍，在以后进行的循环过程中，每一循环的产物作为下 一轮循环的模板。n次循环后，拷贝数增加2n倍 (图1)。因此，进行25-30个循环后， 拷贝数即可达到上百万倍(106)。 PCR的基本反应体系包括：需要扩增的模板（template）、一对寡核苷酸引物 （primers）、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、耐热DNA聚合酶（DNA polymerase） 缓冲液（reaction buffer system）、二价阳离子（Mg2+）等。纳米材料做为新型的PCR 增效剂不仅可以增加PCR特异性和效率， 而且可以提高PCR反应的灵敏度。 这是迄今 为止其它类型的PCR所无法比拟的。实验中用纳米金（10nm）作为PCR的增效剂来 提高扩增效率，使扩增的特异性增强，有利于下一步的基因操作。12本实验由每组学生分别查找枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的相关基因，在教 师的指导下设计引物，利用上次实验提取的基因组DNA作为模板，独立进行PCR、 电泳检测和凝胶成像等操作，并利用学过的知识对PCR反应条件进行优化，提高扩 增的效率。第二个循环第一个循环第二个循环第 n 个循环图 1. PCR 反应原理图 一、主要仪器、 材料和试剂 1．仪器 基因扩增仪（PCR仪），水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移 液器，紫外透射仪，凝胶成像系统。 2．材料 基因扩增的模板为实验2提取的细菌基因组DNA。 3．试剂 Taq DNA聚合酶， 引物， 10×PCR Buffer （含Mg2+） DNA Marker和琼脂糖(Agarose) ， 等购自上海生工公司。13二、操作步骤 1． NCBI 的数据库中查找相关的基因序列，利用 Primer Premier 5.0 等分子生物学 在 软件设计和分析引物。引物序列设计好以后就可以直接委托相关的生物技术公司 合成， 合成好的引物寡核苷酸配置成 20μM 贮存液。 引物设计使用 Primer Premier5 软件，并遵循以下原则： （1）引物的长度一般在18bp~28bp之间，对于长片段扩增来说，引物的长度在这个 范围内适当取长； （2）引物的GC含量一般为40％~60％，不能过高或过低，上下游引物的GC含量应不 要相差太大，另外两对引物的Tm值应尽量接近，一般应相差不超过3℃，这有 利于引物的特异性退火； （3）在其它条件都符合的条件下，尽量选择引物在模板上错配位点少的引物对，另 外，引物3’端应尽量避免出现三个以上的重复碱基和A碱基。这样可以防止错 配引起的非特异性产物； （4）引物二聚体及发夹结构能引起引物的有效浓度降低，从而导致扩增失败。因此 应尽可能避免引物二聚体及发夹结构。 2．在 0.2mL 的 PCR 管内配制 25μL 反应体系： 反应物 10× PCR buffer dNTP 引物 1 引物 2 Taq 酶 Template ddH2O 总体积 92℃ 92℃ 61℃ 72℃ 72℃ 3min 30s 40s 50s 10min 32 循环 (2.5mM) (2μM) (2μM) (5U/μL) 体积/μL 2.5 2.0 2.5 2.5 0.5 1 13 253．将 PCR 反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行 PCR 循环： 预变性 变性 退火 延伸 完全延伸144．琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果 配制 0.8%琼脂糖凝胶，取 5μL 扩增产物电泳。保持电流 40mA。电泳结束后， 利用凝胶成像系统分析扩增效果。 5．PCR反应条件的优化 采用降落PCR（Touchdown PCR）的方法提高基因扩增的特异性。降落 PCR通 过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。最初的循环在高于Tm值大 约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。 最后进行电泳检测，比较基因扩增效果。三、思考题 1．退火温度Tm是如何计算得到？ 2．PCR循环次数是否越多越好？为什么？ 3．如果电泳出现了弥散现象，可能有哪些原因？ 4．如何确保你设计引物的特异性？15实验四大肠杆菌感受态细胞的制备和转化内 容 提 要采用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞，并用质粒pUC19进行转化，利用抗生素来 筛选转化子。 本实验要求： 1．掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。 2．能够计算感受态细胞的转化效率。 原 理将质粒导入大肠杆菌或其他受体细胞内的过程叫转化(Transformation)。受体细 胞经过一系列处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许质粒分子 进入的感受态细胞(Compenent cells)。与电击法等其它方法相比，CaCl2制备法不但简 便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，若制备出的感受态细胞暂时 不用时，即可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存半年以上，因此CaCl2法是分 子生物学研究中最受欢迎的方法。 本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞，采用CaCl2 法制备感受态细胞，并将 pUC19 质粒转化至感受态细胞。进入受体细胞的质粒通过复制，表达实现遗传信息 的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰 系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R?，M?)，它可以容 忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗 性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC19，则在 含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）说明 已导入了pUC19。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切、测序 等进一步鉴定。一、主要仪器、 材料和试剂 1．仪器 移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。162．实验材料 大肠杆菌E.coli DH5a 菌株，pUC19经实验1提取。 3．试剂 （1）1 mol/L CaCl2 17.9g CaCl2?2H2O 溶于 100mL 水中。 （2）100mg/mL 氨苄青霉素（ampicillin） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10mL。分装成小份于 -20℃贮存。常以25ug/mL～50ug/mL的终浓度添加于生长培养基。 （3）LB 液体培养基： 蛋白胨（Tryptone） NaCl 高压灭菌20分钟。 （4）LB 固体培养基：液体培养基中每升加 15g 琼脂粉，高温高压灭菌。 二、操作步骤 1．受体菌的培养 从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5α 单菌落，接种于 3-5mL LB 液体培 养基中，37℃下振荡培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 100mL LB 液体培养基中，37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 ≈0.5 左右。 2．感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) （1）将培养液转入 1.5mL 离心管中，冰上放置 10 分钟，然后于 4℃下 6 000rpm 离 心 10 分钟。 （2）弃去上清，用预冷的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 轻轻悬浮细胞,冰上放置 15-30 分钟后，4℃下 6 000rpm 离心 10 分钟。 （3）弃去上清,加入 4mL 预冷含 15%甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液,轻轻悬浮细 胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 （4）感受态细胞分装成 200μl 的小份，贮存于-70℃可保存半年。 3．转化 （1）从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰 10g 10g， 酵母提取物（Yeast extract） 5 g 溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水定容至1升，高温17上。 （2）加入 pUC19 质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng，体积不超过 10μl)，轻轻摇匀， 冰上放置 30 分钟后。 （3）42℃水浴中热激 90 秒或 37℃水浴 5 分钟，热激后迅速置于冰上冷却 4 分钟。 （4）向管中加入 1mL LB 液体培养基(不含 Amp)，混匀后 37℃振荡培养 1 小时， 使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 （5）将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小 时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养 16-24 小时。 同时做两个对照： 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组 正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl 菌液涂布 于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 4．计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此培养皿中的菌落数 可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞总数＝对照组 2 菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数三、思考题 1．为什么采用 E. coli DH5α 常作为基因克隆中受体菌？18实验五重组质粒的连接、转化及筛选内 容 提 要采用T4 DNA连接酶对带有粘性末端的外源基因和载体pUC19进行连接，产物通 过转化和筛选，得到构建的重组质粒DNA分子。 本实验要求： 1、学习重组质粒的构建和筛选。 2、了解几种连接反应策略。 原 理先用限制性内切酶切割质粒 DNA 和目的 DNA 片段，然后体外使两者相连接， 再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成在质粒载体上进行克隆。为提高克隆的效 率，通过调整连接反应中外源 DNA 片段和载体 DNA 的浓度比例，可以将载体的自 身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略，如载体去磷 酸化等来最大限度的降低载体的自身环化，还可以利用遗传学手段如α互补现象等 来鉴别重组子和非重组子。 外源 DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1．带有相同的粘性末端：用相同的酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须 用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段 和质粒载体 DNA 均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，而且正反两 种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种 DNA 的浓度, 以便 使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体 DNA 的 5'磷酸基团用碱性 磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒 DNA 的自身环化。带 5'端磷酸的外源 DNA 片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在 转入 E. coli 受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 2．带有平末端：是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由 DNA 聚合 酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA 连接酶的浓度和外源 DNA 及载体 DNA 浓度均要高得多。通常还需加入 低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进 DNA 分子凝聚成聚集体的物质以提高转化19效率。 本实验所使用的载体质粒 DNA 为 pUC19，转化受体菌为 E. coli DH5α 菌株。由 于 pUC19 上带有 Ampr 和 lacZ 基因片段，故重组子的筛选采用 Amp 抗性筛选与 α互补现象筛选相结合的方法。 pUC19 上带有 β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和 β半乳糖苷酶 N 端 146 个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点, 但并没有破坏 lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α 菌株带有 β-半乳糖 苷酶 C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pUC19 和 DH5α 编码的 β半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在 pUC19 和 DH5α 融为一体时可形成具有酶活 性的蛋白质。这种 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基 因区段的 β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫 α-互补。由 α-互补产生的 Lac+细菌较易识别，它在生色底物 X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被 IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。 当外源片段插入到 pUC19 质粒 的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去 α互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白 色菌落。 很多 DNA 聚合酶在进行 PCR 扩增时会在 PCR 产物双链 DNA 每条链的 3’ 端加 上一个突出的碱基 A。pUCm-T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的 3’端 带有一个突出的 T。这样，pUCm-T 载体的两端就可以和 PCR 产物的两端进行正确 的 AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把 PCR 产物连接到 pUCm-T 载体中，形成 含有目的片断的重组载体。一、主要仪器、 材料和试剂 1．仪器 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，生化培养箱， 电泳仪，超净工作台，移液器。 2．材料 pUC19 质粒自行提取纯化；宿主菌为 E. coli DH5α；PCR 产物。 根据实验 1 酶切的载体 pUC19 及同时酶切的 PCR 产物，酶切完成后失活备用。 3．试剂 （1）T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)：购自大连宝生物。 （2）X-gal 储液(20mg/mL): 用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成 20mg/mL 的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。20（3）IPTG 储液(200mg/mL): 在 800μl 蒸馏水中溶解 200mg IPTG 后,用蒸馏水定容 至 1mL,用 0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于离心管并储于-20℃。 二、操作步骤 1．连接反应 （1） 将 0.1μg 载体 pUC19 酶切产物转移到无菌离心管中， 加等摩尔量(可稍多)的外 源 DNA 酶切片段。 （2） 加蒸馏水至体积为 8μl,于 45℃保温 5 分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和 物冷却至 0℃。 （3）加入 10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将 液体全部甩到管底,于 16℃保温 8-24 小时。 2．E. coli DH5α 感受态细胞的转化 每组连接反应混和物各取 2μl 转化 E. coli DH5α 感受态细胞。 （1）从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰 上。 （2）加入 pUC19 质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng，体积不超过 10μl)，轻轻摇匀， 冰上放置 30 分钟后。 （3）42℃水浴中热激 90 秒或 37℃水浴 5 分钟，热激后迅速置于冰上冷却 4 分钟。 （4）向管中加入 1mL LB 液体培养基(不含 Amp)，混匀后 37℃振荡培养 1 小时， 使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 （5）将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小 时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养 16-24 小时。 同时做两个对照： 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。 此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液， 但涂板时只取 5μl 菌液 涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 3．重组质粒的筛选 转化后在含抗生素的生色诱导培养基上长出的白色菌落即为转化子。三、思考题 1．本实验体系之外，其它的转化方法和筛选体系有哪些？21实验六 RNA 的提取和 cDNA 合成内 容 提 要利用酸-苯酚法提取植物叶片中的RNA，并对其进行纯化，最后利用反转录酶得 到相应的cDNA，可用于以后的分子生物学操作。 本实验要求： 1、掌握酸-苯酚法提取RNA的方法。 2、了解RNA操作中的重要性。 原 理从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA,通过酶促反应逆转录合成 cDNA 的第 一链和第二链，将双链 cDNA 和载体连接,然后转化扩增，即可获得 cDNA 文库,构 建的 cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析；比较 cDNA 和相 应基因组 DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之 cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。 一、主要仪器、 材料、和试剂 1．仪器 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，生化培养箱， 电泳仪，超净工作台，移液器。 2．材料 植物叶片 3．试剂 （1）RNA 提取液储液： 25g 异硫氰酸胍，29.3mL 灭菌重蒸水，1.76mL0.75M 柠檬酸三钠，于 65℃ 溶解后，加入 2.64mL 10% Sarcosyl（10% Lauroyl sarcosin：在 65℃下，用 90mL 的灭菌重蒸水溶解 10g Sarcosyl，pH 6.7） （2）RNA 提取液：10mL 提取液储液+72μL β-巯基乙醇，现用现配。22（3）AMV 第一链 cDNA 合成试剂盒购自上海生工。 二、操作步骤 1．叶片总 RNA 的提取和纯化 根据 Chomeyrshi，Sacchi 和 Logemann ( 1987 )的酸-苯酚法略作修改。 （1）将 200-400 毫克处理的半叶状体转移到经液氮预冷冻的研钵中，加液氮充分研 磨，再加入 2mL 提取液（提取液成分见后） ，然后转移至 7mL 离心管中，并加 入 200μL 2 M 的醋酸钠（pH4.0）, 振荡混匀； （2） 加入 2mL 水饱和酚 （含 0.1% 8-羟基喹啉） 400μL 氯仿： 和 异戊醇 （V:V = 49:1） , 振荡抽提，冰浴 20－30 分钟； （3）18,000g 在 4℃下离心 20 分钟，取上清液，加入等体积的异丙醇，-18℃放置 1 小时以上； （4）在 4℃下 18,000g 离心 20 分钟，弃上清，用 3M 醋酸钠（pH5.2, DEPC-H2O 配 制） ，轻洗沉淀，然后在室温下以 18,000g 离心 6 分钟, 弃上清； （5）重复步骤（4）一到两次; （6）用 75%乙醇（DEPC-H2O 配制）洗沉淀，室温下以 18,000g 离心 6 分钟，彻底 挥发除去乙醇; （7）用 30-50μL DEPC-H2O 溶解核酸沉淀，得到初步提纯的 RNA 样品。测出核酸 样 品 在 280nm 、 260nm 、 230nm 的 光 吸 收 值 ， 计 算 A260nm/A280nm 、 A260/A230nm 的值，以分析所提核酸样品的质量和浓度。 2．RNA 样品中 DNA 的去除，用 DNase I 来消化，反应体系及程序如下： （1）100μL 反应体系中含有； 1 μg/μL RNA sample DEPC-H2O 10×Buffer DNase I (5u/μL) 混匀以后，37℃温育 30 分钟 （2）加入 80μL 水饱和酚和 25μL 氯仿，充分振荡，冰浴 15 分钟; （3）在室温下以 20,000 g 离心 6 分钟，取出上相（水相） ，加入 1/9 体积的 3M 醋酸 钠（pH 5.2）, 混匀后，再加入 2 倍体积的冷无水乙醇，-18℃下放置 2 小时以 上; （4）20,000 g 离心 9 分钟，弃上清，用 75% 乙醇轻洗沉淀，并在真空中彻底挥发除 60 μL 28 μL 10 μL 2 μL23去乙醇; （5）把得到的 RNA 样品溶于适量的 DEPC-H2O 中，测样品的 OD 值，计算出所提 RNA 样品的总量和浓度。 3．cDNA 的合成 （1）在 200μL 薄壁 PCR 管中依次加入相应的如下试剂 试剂 灭菌 DEPC 水 随机 Primer（100μM） RNA（1μg/μL） （3）再依次加入 试剂 AMV Reverse Transcriptase 5×Reaction Buffer dNTP（10mM） RNase Inhibitor（40U/μL） 2μL 1μL 加入量 4μL 加入量 7μL 1μL 2μL（2）混匀后，65℃温育 5 分钟, 迅速冰浴 5 分钟；RNA（1μg/μL） 2μL（4）混匀后，37℃温育 10min； RNase Inhibitor（40U/μL） 1μL （5）再加入 AMV Reverse Transcriptase，2μL，混匀，终体系为 20μL （6）42℃反应 1h （7）99℃煮沸 5 分钟，冰浴 3min 三、思考题 1．DNA和RNA的提取纯化有什么不同？ 2．为什么mRNA提取是cDNA合成成败的关键？24实验七外源基因在大肠杆菌中诱导表达与检测内 容 提 要本实验利用已经构建好的表达载体，通过IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的诱 导，实现外源基因在大肠杆菌中的表达，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源基 因的表达。 本实验要求： 1．掌握表达载体的特点； 2．了解基因工程的应用。 原 理目的基因被克隆到 pET 质粒载体上，受噬菌体 T7 强转录及翻译(可选择)信号控 制；表达由宿主细胞提供的 T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并 具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅 几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50%以上。在培养体系中加入 IPTG 诱导 T7 RNA 聚合酶生产，继而质粒上的目的 DNA 开始转录。 本实验采用已经构建好的表达载体 pET，该载体带有来源于古细菌的单链结合 蛋白质（SSB）的序列，经 IPTG 的诱导，实现外源基因的表达，并通过 SDS-PAGE 对表达产物进行检测。一、主要仪器、 材料、和试剂 1．仪器 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，垂直板蛋白质电泳装置，生化培养 箱，电泳仪，超净工作台，移液器。 2．材料 含有表达载体 pET-28 的 BL21 菌株。 3．试剂 IPTG 储液(200mg/mL)：在 800μl 蒸馏水中溶解 200mg IPTG 后，用蒸馏水定 容至 1mL，用 0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于离心管并储于-20℃。25二、操作步骤 1．重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 将已经验证的带有 SSB－pET28 重组质粒的大肠杆菌 BL21 在含有卡那霉素 LB 的平板上划线培养。 挑取长出的单菌落接入液体 LB 试管中， 加入卡那霉素至终浓度 为 50ug/mL，37℃摇床过夜。按 1％接种量接入 100mL LB 培养基，加入卡那霉素至 终浓度为 50ug/mL， 37℃摇床培养至菌浓 OD600 达到 0.6 左右， 加入 IPTG 至终浓度 为 1mM，37℃摇床继续培养 4h，诱导 SSB 蛋白表达。每隔两个小时取样进行实验。 2．蛋白质 SDS―PAGE 在蛋白溶液中加入样品缓冲液，100 oC 处理 5min，离心取上清 5－15μL 点样。 于 75V～100V 电泳约 2h， 凝胶在考马斯亮兰 G250 染液中染色 1h， 在脱色液中脱色。三、思考题 1．如何优化表达条件？怎样对表达产物进行下一步的分离纯化？ 2．pET 系列表达载体有哪些特点？本实验所采用的菌株有什么性质？图：pET 表达载体与宿主细胞。26实验八一、实验目的和内容层析柱装填及柱效测定目的：1．掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2．熟悉凝胶层析的一般过程； 3．了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容：1．Sephadex G-50 凝胶柱的装填； 2．凝胶柱柱效测定； 3．凝胶再生的方法。二、实验仪器和试剂 1．实验仪器 层析柱（1×40 cm） ，砝码天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白质检测仪， 记录仪，滴头吸管 2．实验材料和试剂 Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0 的 PBS 缓冲液，5％丙酮（PBS 缓冲液作为 溶剂）三、实验步骤 清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据 Sephadex G-50 的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量 10 倍的 0.02 mol/L PBS 在 100℃水浴中加热溶胀 1 小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约 1/4 柱容积的洗脱液27（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约 2-3cm 后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约 5cm 处时停止装柱，关闭出水口通过 2-3 倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速 0.5～1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将 5%丙酮溶液 0.6 mL 小心加到凝胶床面上，应避免 将床面凝胶冲起 （参考完成时间 11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶 面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用 1 mL 洗脱液冲洗管壁 2 次加入 3－4 mL 洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连， 比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来， 设置好基线的位置洗脱时， 打开上、 下进出口夹子， 0.02mol/L 用pH8.0 的 PBS， 0.5～1 mL/min 以流速洗脱，记录 tr(记录仪纸速设为 12cm/h，电压 200mv；核酸蛋白监测仪检测波长28254nm，灵敏度为 0.1A)， 计算单位高度的柱效 （参考完成时间 16：00）柱效计算公式：N = 5.54? θr/( W ［ 1mm。1/2)］2其中，θr 为平均洗脱时间，W 1/2 为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到 [Sephadex G-100 每米理论塔板数为 ]四、注意事项 1．各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2．装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快， 避免因此压紧凝胶。 3．始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干， 使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 4．所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。五、演示 1．核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法 （1）在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插 上电源插头。 （2）接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同 的走纸速度。记录仪量程调在 10mV 档上。 （3）将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到 100％T 档。 （4）按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某 一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置 5mV 左右数字显 示为 50 左右。仪器开机稳定时间大约在 1 小时左右，待基线平直后，可加样 测试。 （5）把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光 率为“0”厂家巳调好，光密度 A 要调零，量程开关拔到 100％T，调节光量旋 钮，使记录仪指针在 10mV 数字显示为 100，即透光率为 100%。把量程开关拔 到“A”挡，缓慢调节 A 调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ， 同时调节记 录仪零位旋纽使记录仪指示在&0&位 。 （6）上述 5 个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检29测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。 （7）测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。 2．记录仪光吸收 A 读数 当采用 l0mV 量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于 A 量程开关所对应 的 A 读数范围。如 A 量程开关选定在 0-0.5A 时，则记录仪满量程光吸收 A 读数 为 0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为 0.25A。 数字显示光吸收 A 读数(可变量程读数模式)：当 A 量程开关选定在 0-1.0A 档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收 A 的实际读数，如显示为 080 即表 示为 0.80A。 当 A 量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收 A 读数为：A 量程选定 在 0-2.0 档时，数显读数×2=实际光吸收读数 A；A 量程选定在 0-1.0 档肘，数 显读数×1=实际光吸收读数 A 3．部分收集器的操作方法： （1）将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放 开 “停” “快” “慢” “定” 按 或 ( 仍按着)至所需的定时时间， 放开&慢&和 “定” ， 再按一下&停&设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下 “定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒” 键。 （2）定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转 至终点， 这时报警器工作， 报警指示灯亮， 然后将 “顺/逆” 键置于 “逆” “顺” 或 状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外 的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根 试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。六、实验报告 1．如实完整地记录实验流程、现象及结果，计算理论塔板数并对其进行深入分析和 讨论。 2．结合理论塔板模型，分析柱效的影响因素，以及如何提高柱效。参考文献 [1] 王璞，林红，朱滨．凝胶过滤层析实验中 Sephadex 的溶胀与回收保存．实验技 术与管理，):24-25．30实验九一、实验目的和内容蛋白质标准曲线的制作目的：学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和 方法 内容：制作测定蛋白质浓度的标准曲线。 制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。一般用分光光度法测物质的含 量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。考马斯亮蓝法测 定蛋白质浓度，是利用蛋白质D染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、 灵敏的方法。考马斯亮蓝 G－250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋 白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定 律（Beer’s law） 。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸 收由 465nm 变成 595nm，通过测定 595nm 吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体 系中呈现的颜色变化主要是 G-250 分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同 引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式 呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl 的含量。Coomassie Dye-Based 蛋 白质 定量O C H2 CH3Coom as sie G-2 50P ROTEI NNH++ CH 3C H2 N C H2C H3CC H3N CH2 CH 3 C H2 SO3 SO3 NaAc idBLUEA m ax = 5 95 nmP ro tein - D ye Co mpl ex蛋白质和染料结合是一个很快的过程， 2min 即可反应完全， 约 呈现最大光吸收， 并可稳定 1h，之后，蛋白质D染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质D染料复合 物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋 白质 5?L/mL 时就有 0.275 光吸收值的变化，比 Lowry 法灵敏 4 倍，测定范围为 1031－100?g 蛋白质，微量测定法测定范围是 1－10?g 蛋白质。此反应重复性好，精确度 高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两 种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线 弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇， （NH4）2SO4 无干扰。强 碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris， 乙酸，2D巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA 及微量的去污剂如 Triton XD100，SDS， 玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂 的存在对颜色影响太大而不易消除。二、实验仪器和试剂 1．试剂 （1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝 G－250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇，加入 100mL 85% H3PO4，用蒸 馏水稀释至 1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%（W/V）考马斯亮蓝 G― 250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 （2）标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度 同 0.15mol/L NaCl 配制成 1mg/mL 蛋白溶液。 2．器材 721 型分光光度计、移液管（10mL） 、移液枪、试管及试管架三、实验步骤试管编号 1mg/mL 标准蛋白（mL）0 01 202 403 604 805 1000.15mol/L NaCl （mL） 1 考马斯亮蓝试剂 （mL） 50.98 0.96 0.94 0.92 0.9 5 5 5 5 5充分摇匀，20min 内以 0 号管为空白对照,在 595nm 测定 A595nm －标准蛋白含量为横坐标 （六个点为 20?g、 ?g、 ?g、 ?g、 40 60 80 以 A595nm 为纵坐标，32100 ?g） ，在坐标轴上绘制标准曲线。 1．利用标准曲线查出回归方程。 2．用 Excel 作图，测出回归线性方程。即 A595nm=a×X。相关系数一般大于 0.9。 3．未知样品蛋白质浓度的测定： 测定方法同上，取合适体积的未知样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内 （0～100?g，最好在 40～80?g） ，根据所测定的 A595nm，利用标准曲线或回归方程求出 相当于标准蛋白质的量（?g） ，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL） 。 一般被测样品的 A595nm 值在 0.1―0.5 之间，所以上述样品如果 A595nm 值太大，可以 减少取样量，如果仍然很大，可以定量稀释后再进行测定。四、注意事项： 1．蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合的反应十分迅速，在 2min 左右反应达到平衡； 其结合物在室温下 1h 内基本稳定。如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的 5－20min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 2．测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的 吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 （1）Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应+ + 2+ 用于蛋白质含量的测定。有些阳离子，如 K 、Na 、Mg 、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如 TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。 （2）测定时仅使用一套比色杯（2 个），并从低浓度到高浓度依次测定。中间 不要用蒸馏水润洗比色杯，仅用待测液润洗 2～3 次即可。 （3）玻璃仪器要洗涤干净并保持干燥，避免温度变化；取量要准确；分光光度 计十分灵敏，测定时要认真仔细。五、问题与思考 1．为何制作蛋白质标准曲线？ 2．酶活的一般定义？在提取过程，为何要测定蛋白质浓度？33实验十一、实验原理与目的果胶酶的提取与活性测定果胶酶在食品、酿酒、环保、医药、纺织及洗涤剂行业应用十分广泛。 盐析是通过破坏蛋白质表面的亲水基团和带电颗粒而使蛋白质发生沉淀的方 法，不同蛋白质分子颗粒不同，故盐析所需要的浓度不同，从而将蛋白质分离。 通过硫酸铵逐级沉淀果胶酶进行初步的分离纯化，通过凝胶层析法进一步分离 纯化。学习果胶酶的提取方法，并测定果胶酶的酶活。二、实验材料与设备 1．实验材料 （1）果胶酶粗酶液 挑 取 酵 母 果 胶 酶 工 程 菌 单 菌 落 ， 接 种 于 装 有 25 mL BMGY 培 养 基 的 250 mL 摇瓶中， 30 ℃、 r/min 条件下培养约 18 h， 在 250 然后室温下 6 000 r/min 离 心 5 min，收集菌体，用 mBMMY 诱导培养基(约 200 mL ) 重新悬浮菌体，使 OD600 约为 1.0；将上述菌液置于 1 L 的摇瓶中，用双层纱布封口，置于 30 ℃ 、 250 r/min 的摇床上继续培养，每 24h 向培养基中添加甲醇至其体积分数为 1%， 诱导培养 96h，4℃、6 000 r/min 离心 20 min。收集上清液，即为果胶酶粗酶液， 于 4 ℃保存备用。 （2）硫酸铵 （3）pH 值=3.5 的醋酸-醋酸钠缓冲液 （4）0.1N 碘液：准确称取碘化钾 5g，用蒸馏水溶解后，加入 2.54g 碘，溶解后定容 至 100mL。 （5）0.025mol/L 硫代硫酸钠：准确称取 6.2g 硫代硫酸钠，加蒸馏水后定容至 1L （6）0.5%可溶性淀粉指示剂：准确称取可溶性淀粉 0.5g 放入沸水中消煮至透明。 （7）1M 碳酸钠溶液：准确称取 10.6g 碳酸钠，定容于 100mL 的水中 （8）2N 硫酸：吸 10mL 的浓硫酸倒入 170mL 的水中 （9）1%果胶溶液：准确称取分析纯果胶 1g，用酸水溶解煮沸，冷却后过滤， 定至 100mL。 （10）酶样的制备：准确称取 1.000g 固体酶或移取 1mL 液体酶样，定容至 100mL， 于 50℃水浴浸取 1 小时，过滤，滤液为供试酶液。则该酶已经稀释 100 倍。342．实验设备 电子天平、恒温水浴锅、紫外-可见光分光光度计、凝胶 Sephadex G-75 三、实验内容 1．果胶酶粗酶液的硫酸铵沉淀 取 9 份 50mL 果胶酶液粗酶 80mL 离心管中，加入硫酸铵粉末，使离心管中 硫酸铵的饱和度分别为 0、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%和 90%， 4 ℃静置过夜, 10000 r/min 离心 20 m in，收集上清液, 4 ℃保存，沉淀用 10 mL 醋酸缓冲液（pH 5.8） 溶解，然后在同种缓冲液中充分透析，检测上清 液和透析处理液中果胶酶的活性。 测定随着硫酸铵饱和度的增减，上清液中酶的相对活性的变化情况，并标出 在饱和度为多少时，上清液中酶活性下降最快，这时表明果胶酶沉淀量在相应增 大； 当硫酸铵饱和度超过某一数值时， 上清液中果胶酶活性下降呈现出减缓趋势， 此时表明果胶酶已经基本沉淀完毕。在硫酸铵饱和度达到此数值时，果胶酶回收 率，继续提高饱和度，果胶酶的回收率基本不变。 2．Sephadex G75 凝胶柱洗脱 取经硫酸铵沉淀、 透析和浓缩后终体积为 2 mL 的果胶酶液加入到充分平衡 的凝胶中， 然后用醋酸缓冲液(pH5.8) 洗脱， 控制洗脱速度， 建议为 0.3 mL/min， 每 3 min 收集一管，测定每管中的蛋白质含量和果胶酶活性，当检测不到果胶 酶活性时，终止洗脱，并用测得的蛋白质含量和酶活数据绘制凝胶过滤曲线。 3．测定项目及方法 （1）果胶酶活性测定 取 1%果胶酶 10mL 加入 5mL 酶液和 5mL pH3.5 的缓冲液，在 50℃水浴中 保温反应 1 小时。取出后加热煮沸 2~3min，冷却后，补水至 20mL。取 5mL 反 应液于 100mL 碘量瓶中，加 1M 碳酸钠溶液 1mL，0.1N 碘液 5mL，摇匀，具塞， 于室温暗处下放置 20min。取出后加 2N 硫酸 2mL，立即用 0.05N 硫代硫酸钠溶 液滴定至浅黄色，加 1mL0.5%可溶性淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失为止。空 白试验以煮沸失活的酶液或蒸馏水代替酶液进行滴定。 每个酶样最少做两个平行 样。将测得的各平行样求 OD 值的均值。 在上述酶反应体系中，1g (或 1mL 液体酶) 酶粉,于 50.0℃、pH3.5 条件下, 每分钟催化果胶水解生成 1 微克半乳糖醛酸的酶量为一个活力单位(U )。 （2）计算酶的活性单位依据以下公式35酶的活力= [(B-A)*N*0.5*175*20*n*1000]/[51*52*W*60 ]，单位：U/g(mL) 式中 A：样品滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。 B：空白滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。 N：硫代硫酸钠摩尔浓度。 0.5：1 当量硫代硫酸钠相当于 0.5 当量半乳糖醛酸。 20：反应液总体积 51：酶液体积以 1mL 计 52：吸取反应液 n：稀释倍数 （3）蛋白质含量测定 盐析和 SephadexG75 凝胶过滤洗脱液中的蛋白质检测均采用 280nm 紫外分 光光度计法，蛋白质含量以 280nm 吸光值(A280)来表示。 四、思考题 1．利用盐析方法提取酶的原理？ 2．酶的其他分离纯化的方法有哪些？36实验十一一、实验目的和内容果胶酶的纯度鉴定与分子量测定通过本次实验的学习与操作，使学生在实验过程更好的理解 SDS-聚丙烯酰胺凝 胶（PAGE） 测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据。 要求学生掌握电泳原理以及 SDS－PAGE 垂直板电泳分离蛋白质技术的应用，熟 悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，凝胶图谱的绘制与计算，了 解在电泳中分子量标准物的使用。二、实验仪器与试剂 1．实验仪器 SDS-PAGE 电泳设备，电炉，脱色摇床 2．实验材料及试剂 实验材料：实验十所得发酵液（S1） 、实验十发酵液的硫酸铵粗分离样品（S2） 、 Sephadex G75 凝胶柱洗脱峰峰谷段样品（S3） 、Sephadex G75 凝胶柱洗脱峰峰尖样品 （S4） ，橡胶手套 实验试剂：2×上样缓冲液、10%SDS、30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液（1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液） 、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液） 、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly 电泳缓冲液、染色液、脱色液三、实验步骤 1．蛋白样品的处理 取 200?L 上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入 200?L 的 2×上样 缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在 100℃沸水 浴中加热 3～5min，取出后 10000r/min 离心 10min，取上清待用。 2．SDS-PADE 实验步骤（适用于大板，若为天能公司的小板，参考附录中的方法） （1）电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。( 试样格（梳子）临用前 用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。) （2）用电泳缓冲液配制 1%的琼脂糖凝胶，煮沸溶解后冷却至 55℃左右，加入制板 槽槽内封板。 （固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.） （3）按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约 5cm 左右，之后加少许蒸馏水，37静置 30 分钟。 （凝胶配制过程要迅速, 催化剂 TEMED 要在注胶前再加入,否则 凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使 分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面。 ） （4）倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶 至离边缘 5mm 处，迅速插入样梳，静置 25 分钟。 （样梳需一次平稳插入,梳口 处不得有气泡,梳底需水平。 ） （5）拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。 （要使 锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.） （6）加样 5 个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积 的样品和蛋白 Marker。其中蛋清（S1）和 Marker 加样量为 2?L，S1、S2、S3、 和 S4 加样量为 10?L。为了练习和比较上样量的影响，可以加 20?L 的 S1～S4 作 为对照（注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。 为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。 ） （7）电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在 160V，当进入分 离胶后改为 240V，溴酚蓝距凝胶边缘约 5mm 时，停止电泳。 （8）凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下 一角作为加样标记， 然后放在大培养皿内， 加入染色液， 42℃染色 40min 左右。 （剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 ） （9）脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带 清晰。 （10）将凝胶室温保存于 10％甘油水溶液中，至凝胶扫描分析。 （11）凝胶扫描仪扫描并进行数据分析,求出溶菌酶的相对分子质量。分析各样品中 溶菌酶相对含量的变化。附表 1浓缩胶 双蒸水 （10mL） 4% 6.1mL Tris-HCl 2.5mL 1.3mL 100μL 10μL 100μL 0.5mol/L pH6.8 胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP38附表 2分离胶 双蒸水 （20mL） 12% 6.6mL Tris-HCl 5mL 8mL 200μL 8μL 200μL 1.5mol/L pH8.8 胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP汇总所有实验结果，完成下表 3：样品 体积 mL 蛋白浓度 mg/mL 总蛋白 Mg 活力 u/mL 比活力 u/mg 总活力 U 回收率 % 提纯倍数S1 S2 S4V1＝ V2＝ V4＝1001其中：总活力＝比活力×体积 回收率＝回收的样品活力占总活力的百分数 提纯倍数＝提纯的比活力与初始比活力的比值四、注意事项 1．N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直 接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。 2．安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 3．用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 4．加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器 针头挑除。五、演示 1．垂直电泳系统的组成及工作原理； （1）电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管 式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽 （2）电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳 200～600V，载 体两性电解质等电聚焦电泳 V，固相 梯度等电聚焦 V39（3）外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却； （4）灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子； （5）其他：可以选配电泳转移装置、电泳洗脱仪、凝胶扫描和摄录装置等。 2．制分离胶与浓缩胶。六、实验报告 1．如实完整地记录实验流程、现象及结果。 2．根据电泳图分析实验结果；溶菌酶的纯度以及根据蛋白质 marker 估计其分子量。 3．总结本次实验的问题并讨论。七、问题和思考 1．在不连续体系 SDS-PAGE 中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 2．电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3．在不连续体系 SDS-PAGE 中,分离胶与浓缩胶中均含有 TEMED 和 AP,试述其作用? 4．样品液为何在上样前需在沸水中加热几分钟?40实验十二一、实验目的发酵液中凝乳酶的提取纯化通过发酵液中凝乳酶的提取纯化，了解酶提取纯化的方法，学习凝胶层析法的 工作原理和基本操作技术。二、实验原理 凝乳酶是一种酸性蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切 Phe105- Met106 连 接的κ-酪蛋白，导致牛奶凝结，从而被广泛应用干酪生产中。 有机溶剂对于许多蛋白质 （酶） 核酸、 、 多糖和小分子化合物都能发生沉淀作用。 其原理是降低水溶液的介电常数，削弱溶剂分子与蛋白质分子之间的相互作用力， 增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 凝胶层析法是广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物高分子的分离分析的有效力 法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。此类层析的固相 载体是具有分子筛作用的凝胶。目前使用较多的是具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶 (商品名为 Sephadex)， 其它还有琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶、 聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。 Sephadex 是由细菌葡聚糖(以右旋葡萄糖为残基的多糖)用交联剂环氧氯丙烷交 联形成的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决 定其交联度的大小(交联度大， “网眼”就小)，从而得到各种规格的 Sephadex，即不 同型号的凝胶。 “G”表示交联度，G 越小，交联度越大，吸水量也就越小。将充分 溶胀的凝胶装入层析柱中，再加入样品以后，由于 Sephadex 的三维空间网状结构， 小分子能够进入凝胶，比较大的分子则被排阻在交联网状物之外，因此各组分在层 析柱中移动的速度因分子的大小而不同。分子量大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔 隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析柱。分子量小的物质可以透入 凝胶颗粒，流程长，移动速度慢，比分子量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集 流出液，分子量不同的物质便互相分离。SephadexG10 到 G50 通常用于分离肽或脱 盐。G75 到 G200 可用于分离分子量大于 10000 的蛋白质。 三、实验材料与试剂 1．材料：微生物工程菌株 2．试剂：土豆、无水乙醇、Na2HPO4q12H2O、NaH2PO4q2H2O、Sephadex G-100、41脱脂奶粉 3．PDA 培养基：取去皮土豆 200 g，切成黄豆大小的碎块，加蒸馏水 500mL，煮沸 1 h 后，单层纱布过滤，补充蒸馏水至 1 L，115oC 灭菌 20 min 4． 0.005 mol/L pH 6.2 Na2HPO4-NaH2PO4 溶液： 准确称量 0.2184 g Na2HPO4q12H2O、 0.6851 g NaH2PO4q2H2O，加水溶解后定容至 1L 四、实验仪器 台式离心机、水浴锅、电子天平、铁架台、层析柱、恒流泵、摇瓶、试管、量 筒、烧杯、玻璃棒五、提取工艺流程 1． 分别挑取微生物工程菌株单菌落， 接种于 4 瓶装有 50 mL PDA 培养基的 500 mL 摇 瓶中， 30℃、 r/min 条件下培养约 36 h， 在 250 合并发酵液， 3500r/min 离心 5min， 取上清， 向其中加入 2 倍体积的无水乙醇， 4℃沉淀 30min， 8000r/min 离心 15min， 弃上清，将沉淀溶于 0.005 mol/L pH 6.2 的磷酸盐缓冲液，得到粗酶液。 2．利用 Sephadex G-100 纯化粗酶液 （1） Sephadex G-100 的预处理 取 2.5 g Sephadex G-100 至于烧杯中，加入蒸馏水轻轻搅拌，弃去悬浮颗粒， 如此反复洗涤几次后，加入过量 0.005 mol/L pH 6.2 的磷酸盐缓冲液，室温下溶 胀 72 h。 （2）装柱 取直径 1.0 cm，长 50 cm 的层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的 止水螺丝旋紧，向柱中加入约 5~7 cm 的 0.005 mol/L pH 6.2 的磷酸盐缓冲液，然 后缓慢加入溶胀好的凝胶，注意使柱中无气泡，打开出样阀。凝胶缓缓下沉，继 续加入，用玻璃棒轻轻搅拌，使柱中无界限。待凝胶柱装好后，在凝胶表面放一 层滤纸，避免上样时破坏胶面。用缓冲液平衡层析柱，并打开恒流泵控制流速为 12 mL/h。 （3）上样 将柱的上端打开，用吸管将凝胶上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液 面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱凝胶表面。拧开下端的 螺旋夹，使样品进入凝胶中，快要进完时，加 1~2 mL 缓冲液冲洗柱壁，随即用 多量的洗脱液洗脱。42（4）洗脱、收集 当样品完全进入凝胶后，用 0.005 mol/L pH 6.2 的磷酸盐缓冲液洗脱样品， 洗脱速度为 12 mL/h，并分管收集，1mL/管，收集 80 管。 （5）凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方 法有三种： ①在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为 0.02% NaN3 或 0.002%洗必泰）或高压灭菌后 4 ℃保存。此法至少可以保存半年以上。 ②用完后，以水冲洗，然后用 60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在 半收缩状态下保存。 ③长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐 加大乙醇用量，最后用 95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干， 于 60℃~80℃干燥后保存。 3．测定凝乳酶酶活，绘制纯化曲线。 取 5 mL 100 g/L 的脱脂乳，在 37 ℃保温 5 min，加入 0.5 mL 凝乳酶，混匀， 准确记录从加入酶液到乳凝固的时间。 40 min 凝固 1 mL 100 g/L 的脱脂乳的酶 把 量定义为一个索氏单位(Soxhelt Unit)，记作 U，并以相对活力(Ru)表示各因素的 影响效果。 U=2400/T×5/0.5×D T 为凝乳时间(s)；D 为稀释倍数。 六、思考题 1．酶提取主要有哪些方法？有机溶剂沉淀法有什么优点？ 2．影响有机溶剂沉淀的因素有哪些？ 3．如何对凝乳酶的纯度进行检测？43实验十三一、实验目的和内容溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定本次实验采用离子交换层析对实验二获得的初提液，进行进一步的分离纯化以 得到较高纯度的溶菌酶。通过本次实验的学习和操作，要求学生掌握离子层析的原 理以及离子交换层析的操作方法，掌握离子交换树脂的再生和保存，掌握比色法测 定溶菌酶的酶活。二、实验仪器与试剂 1．实验仪器： 分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，高速离心机（可用 50mL 离心管） ， 冰箱，可见光分光光度计、摇床、烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸 2．实验材料及试剂： 样品 S1、 S－2， S2、 CM-Sepharose F.F.， 0.02mol/L pH8.0 的 PBS， 0.5mol/L NaCl， 烧杯（50mL，250mL） 、枯草芽孢杆菌过夜培养物（37℃，18h，160r/min,100/250mL） 、 0.02mol/L pH8.0 的 PBS(测活缓冲液, 含 50mmol/L NaCl), 0.02mol/L pH8.0 的 PBS(离子交换洗脱溶液，含 0.5mol/L NaCl)三、实验步骤 1．溶菌酶的分离纯化 （1）装柱：取 20mL CM-Sepharose FF，1.0*20cm 层析柱，以 0.02M PBS,pH8.0 为 缓冲液装柱。装柱方式与第一次课大家装填分子筛层析柱的方法一样。注意不 能使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当加入溶液时，树脂间隙中会产生 气抱， 而使交换不完全。 对于重复使用的填料， 需要先冲 3 倍柱床体积蒸馏水， 将保存用的乙醇洗脱出来。 （2）平衡：用泵将 3 倍柱床体积的 0.02M PBS pH8.0 过柱。这一步的作用是使得柱 床体系的内外达到平衡与均一，以利后续目的蛋白的结合。 （3）上样：用泵将 S－2 样品泵入层析柱，经过一段时间之后，蛋白将通过离子交 换的方式，与介质相互作用而挂柱。注意观察并记录 280nm 下吸收值的变化。 （4）冲平：用 3～4cv 0.02mol/L pH8.0 的 PBS 洗涤离子交换柱至无穿透峰为止， 流速约 1.5mL/min。在吸收峰下降段留样 S3，取约 1mL 于 Ep 管－20℃冻存备44用) （5） 洗脱： 100mL 含 0.5mol/L NaCl 的 0.02mol/L pH8.0 的 PBS 和 100mL 0.02mol/L 用 pH8.0 的 PBS 进行梯度洗脱。收集洗脱峰，记录洗脱时间和洗脱峰体积 V4。取 0.5mL 清液并加入等量 40％甘油于 1mL Ep 管中，制备 2 管，-20℃备用（留样 S4） （6）再生：用泵将 2 倍柱体积的 2mol/L NaCl 过柱，然后水洗 4 倍柱体积。洗脱完 成后，需要进行离子交换填料的再生处理。离子交换基团为一些盐所覆盖，影 响下次的重复使用。 因此， 先用高浓度的盐将与介质结合紧密的杂质洗脱下来， 然后再恢复其离子交换功能。对于 CM-sepharose 而言，只需要用水过柱即可 以使其离子交换功能得到恢复。 （7）保存：用泵将 2 倍柱体积的 20%乙醇过柱。介质回收用于蛋白质分离纯化的介 质多保存于液体中。保存时需加入一些抑菌剂，如叠氮化钠等。对于本介质， 只需采用 20%乙醇保存即可。 （8）对于洗脱下来的样品，我们无法确证是否含有溶菌酶。因此需要进行监测。一 般采取活性监测的方式。本实验中利用溶菌酶水解枯草芽孢杆菌细胞壁，使得 枯草芽孢杆菌裂解，以 595 nm 下光吸收值的变化来确定溶菌酶所在的吸收峰。2．溶菌酶的活性测定 取 6mL 枯草芽孢杆菌的过夜培养物，3500rpm 常温离心 5 分钟，弃上清，沉淀用 6mL 0.02mol/L PBS 缓冲液悬浮，利用可见光分光光度计测其 OD595 并记录（吸光度在 0.5～1.0 范围，如果读数过高可适当稀释） 。比色皿编号见下表，其中 1 只加入 PBS 作为仪器调零空白，2 作为对照，3、4 用于平行测定然后取平均值） ，30s 测定一次 吸光度值，约 3min 内至吸光度达到稳定。比色皿 PBS 缓冲液/mL 细胞 PBS 悬液/mL 分别用酶液 S1～S4/mL1 3 -2 3 -3 2.9 0.14 2.9 0.1在室温，以 1 号管为对照，每隔 30s 分别测定 2、3、4 在 595nm 的吸光度。 （因 仪器数量有限，请各组错开时间进行，确保仪器准备完毕才加入酶液）45时间 （s） 2号 3号 4号0306090120150180观察悬液 OD595 反应前后的变化。 根据以下的酶活定义， 测定溶菌酶 S1～S4 活性。 其中活力单位（U） ：酶在室温（25℃） ，pH8.0 条件下，OD650 每分钟降低 0.001 为 1 个活力单位 U。处理数据后完成下表： S1 酶活 U/mL S2 S3 S4四、注意事项 1．离子交换树脂再使用前需要再生，阴离子交换树脂以“碱酸碱”的顺序进行处理， 阳离子交换树脂以“酸碱酸”的顺序进行处理和再生。装柱时要求粒度均匀，比 较致密，柱床表面平整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象。 2．加样蛋白浓度低于 20 mg/mL，上样体积小于柱体积的 1/3。 3. 在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。过大，会使填料压缩紧密，导致 流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的 活性变化。对于 CM Sepharose FF 填料，最适流速在 100cm/h 以下。因此，在我 们的实验中，控制流速为 2mL/min。 4．冲平过程一定不能省。因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完 全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结合不紧密 的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。五、演示 由于本实验装柱操作与实验一凝胶过滤层析的操作方法相同， 所以演示略。 洗脱 时，梯度混合器中高盐溶液与低盐溶液的放置。依据洗脱目的进行。如果是离子交 换，采用低盐上样高盐洗脱的方式，就需要将低盐放置在靠近洗脱液出口的容器中。 如果是疏水层析，采取的是高盐上样低盐洗脱的方式，则将高盐溶液放置在靠近洗 脱液出口的那个容器中。注意老师的演示。六、实验报告461．如实完整地记录实验流程、现象及结果；分析记录仪上所绘制的峰型与所分离的 蛋白质纯度的关系。 2．实验报告中必须包含原始数据以及洗脱曲线图（同组可以复印同一张图） 本实验的数据处理：根据酶的动力学特性可知，在特定的时间段，酶促反应 的速度是相等的，即产物浓度随时间成线性变化。根据此特性，将所得数据在坐标 纸上作图，以时间为横轴，OD595 值为纵轴，将数据定位后，根据拟合直线的斜率，即 为单位时间内 OD 值的下降值，然后再除以 0.001，即可得到所取测量酶液的活力单 位。除以酶液体积，即可得到酶浓度（u/mL） 。0.66 0.655 0.65 0.645 0.64 0.635 0.63 0.625 0 50 100 150 200 y = -0.0002x + 0.657 R2 = 0.9805溶菌酶活力单位(U)=△OD/0.001 其中△OD 为一分钟内 OD 值的下降值。七、问题和思考 1．离子交换树脂填料如何再生即使用时的注意事项。 2．为什么要使用冲平这一步骤？ 3．为何要在整个分离纯化过程中，不断监控酶的活性？S 4．分光光度法测定溶菌酶活力的原理是什么？注意事项有哪些？参考文献 [1] 李蓉，陈国亮．高效阳离子交换色谱法分离纯化蛋清中的溶菌酶．色谱，2002， 20(3)：259-261． [2] 张文会， 王艳辉， 马润宇． 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶． 食品工业科技， 2003， 23(6)：57-59．47实验十四一、实验目的硅胶色谱法分离甘油三酯通过从粗油中分离甘油三酯，学习运用凝胶色谱法分离油脂中各个成分的方法。二、实验原理 吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以 使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。硅胶色 谱频繁使用在脂质中的单一脂质，糖脂质以及磷脂质的分离。各种脂质被硅胶吸附， 随着洗脱溶液的极性增加，各种极性不同的化合物被分离出来。三、实验仪器 1．层析柱(1.5×75cm) 2．250mL 三角容量瓶 3．分析天平（0.001g） 4．真空浓缩装置 5．搜集瓶 6．氮气 四、实验材料与试剂 1．正己烷 2．乙醚 3．蒸馏水 200mL 15mL 1.3mL4．硅胶（100 目左右） 25g 五、实验步骤 1．活化硅胶（110 度，6 小时干燥）25g 中加入 5%蒸馏水使其部分钝化并充分混匀 放置 30 分钟。加入正己烷至刚好淹没硅胶为止并用超声波脱气 3 分钟。 2．层析柱底部放入脱脂棉少许（防止硅胶泄漏） ，将硅胶放入到层析柱中正己烷溶 液要没过硅胶层表面。 3．准确称取食用油 1±0.001 g 加入到硅胶层析柱中用 150mL 正己烷/乙醚（87∶13，48v/v）洗脱，洗脱速度为 2-3 滴/min。洗脱时表面不能干和。 4．收集的洗脱液用真空浓缩装置浓缩至无有机溶剂气味为止。 5．准确称取浓缩物质量。 六、回收率计算 回收率= Ws/W×100% Ws：回收的甘油三酯质量（g） W：食用油质量（g） 七、思考题 1．实验中加水的目的是什么？ 2．怎样验证洗脱液中收集的甘油三酯的纯度？49实验十五一、 实验目的HPLC 法测定脂肪族羰基化合物通过学习测定羰基化合物，了解高压液相检测的基本原理，掌握高压液相操作 方法。二、实验原理 食用油脂在被氧化的过程中生成多种羰基化合物。油脂氧化生成的短链的醛、 酮、醇等低分子挥发性分解产物是油脂呈香的主要成分。其中很大部分是脂肪族羰 基化合物。羰基化合物与 2,4-二硝基苯肼反应生成 2,4-二硝基苯腙，2,4-二硝基苯腙 在 365nm 处具有吸收峰。利用高压液相分离柱（C18 柱）将各个羰基化合物分离并 鉴定。三、实验材料与试剂 1．异丙醇（分析纯） 2．2,4-二硝基苯肼 3．乙腈（色谱纯） 4．蒸馏水（色谱纯） 5．己醛，2-己烯醛，2,4-己二烯醛（标准品） 四、实验仪器 1．高压液相测定仪 2．恒温水浴锅 3．10mL 带塞子的玻璃试管 1 支 4．过滤针头（油性，0.45μm）1 个 五、实验步骤 1．称取 50 mg 2,4－二硝基苯肼于 100mL 容量瓶中，加入含 3.5 mL 浓盐酸的精制异 丙醇 90mL，用精制的异丙醇定容到 100 mL。 2．称油样 0.04～1.0g 放入 10mL 容量瓶中用异丙醇溶液定溶后振荡至混匀。 3．配制 50～500?M 的标准醛和酮的异丙醇溶液504．取标准羰基化合物或油样 1mL 放入 15mL 离心管中，加入 1mL2,4-二硝基苯肼 （2,4-DNP）溶液，盖上塞子在 45℃水浴中加热 30 分钟。 5．冷却后，用过滤针头（0.45?m）过滤。 6．提取过滤液 20?L 注入到 HPLC 中。 HPLC 分析条件 色谱柱 流动相 检测器 柱温 流速 注入 SUPELCOSIL LC-18 5?m（25cm×4.6mm ID） 乙腈：水（80：25，v/v） UV365nm 常温 1.0mL/min 20?L六、含量计算 X=Ax/Am×M 式中 X：某种醛的含量，mg/100g； Ax：样品峰面积； Am：标准样品峰面积； M：标准样品浓度 mg/L； 七、思考题 1．分离不完全会对色谱柱产生什么影响？ 2．怎样辨别反应是否完全？51实验十六一、实验目的气相色谱分析脂肪酸通过分析甘油三酯中的脂肪酸的构成，学会运用衍生的方法和萃取的方法，掌 握气相色谱的操作程序。二、实验原理 食用油脂的主要成分是甘油三酯。甘油三酯是由一分子的丙三醇和三个分子的 脂肪酸经酯化形成的。甘油三酯在酸性条件下分解生成丙三醇和游离脂肪酸，游离 脂肪酸与甲醇反应生成脂肪酸甲酯（甲酯化） ，通过有机溶剂的萃取将脂肪酸甲酯提 取。将提取的脂肪酸甲酯注入到气相色谱柱中进行分离，定性及定量。三、实验材料与试剂 1．甲醇（色谱纯） 2．正己烷 分析纯 3．浓盐酸 4．无水硫酸钠 5．10mL 带塞子的玻璃试管 1 支 四、实验仪器 1．气相色谱仪 2．恒温水浴锅 3．分析天平 0.001g 4．混匀器 五、实验步骤 1． 准确称取 0.010±0.001g 油脂放入到玻璃试管中， 加入 2mL 的 4%HCL 甲醇溶液， 盖上塞子。在 60 度下反应 60min 直至看不到油滴为止。 2．冷却后，向玻璃试管中加入 1mL 蒸馏水和 1mL 正己烷溶液萃取脂肪酸甲酯。 3．将萃取液移入到干净的试管中加入适量的无水硫酸钠进行脱水。 4．提取 1μL 注入到气相色谱中进行检测。52色谱条件： 载气为 N2， 流速 36 mL/min， 进样温度 250℃， 柱温 170℃ （保持 10min） ； 以 4℃/min 升温至 225℃（保持 15min） 六、计算 根据各种脂肪酸标样的保留时间和未知样比较，来确定脂肪酸的组分，同时根 据峰面积以使用归一法计算各种脂肪酸的含量。 脂肪酸组分含量（质量分数）= Ai / ∑Ai × 100% 七、思考题 1．什么样的物质不能使用气相色谱测定？ 2．气相色谱中使用的载气选择依据是什么？53实验十七一、实验目的香菇多糖的分离提取让学生了解香菇多糖的理化性质及提取工艺流程，掌握真空浓缩技术。二、实验原理 香菇是一种药食两用真菌，具有提高免疫力、抗癌、降糖等多种生理功能。水 溶性多糖作为香菇主要活性成分之一，主要以 β-1,3-葡聚糖的形式，分子量从几万到 几十万不等。通过有机溶剂提取，真空浓缩技术进行分离提取。三、实验材料与试剂 原料：干香菇 500g 试剂：氯仿、正丁醇、医用纱布、浓硫酸、重蒸酚、工业酒精四、实验仪器 组织捣碎机、水浴锅、旋转蒸发器、1cm 比色皿、751 分光光度计、电子天平、 台式离心机、试管、量筒、烧杯、玻璃棒五、提取工艺流程 1．1kg 干香菇切成小块，以 1：10（重量比）加入水，用组织捣碎机进行均质； 2．取 200mL 均质液放入 1L 烧杯中，再加入 300mL 蒸馏水，加热至沸后，温火煮 沸 1 小时， （注意：煮沸过程中用玻璃棒不断搅拌，以免烧杯底部发生糊结；并 间歇加入少量水，使杯内液体体积保持在 500mL 左右； 3．加热完毕后，将杯内液体用 8 层纱布过滤，除去残渣，上清液转入另一烧杯中； 4．将上清液倒入圆底烧瓶中，在旋转浓缩仪上进行浓缩，浓缩条件为-0.1MPa 、 60℃，浓缩液体积至 100mL 左右停止； 5．将浓缩液在 1×10000g 离心 10min，将上清液转入另一烧杯，除去残渣； 6．上清液中加入等体积的氯仿正丁醇浓液（体积比为 4：1） ，搅拌 5min，静置 30 分钟； 7．将混合液体在 1×5000g 下离心 20min,分离水相； 8．在水相中加入终浓度为 80%的酒精，搅拌均匀，静置 20min，1×5000g 下离心5410min； 9．取出沉淀物，放入已称重的干燥表面皿中，在真空干燥箱中 80℃下真空干燥； 10．干燥后，称重，计算多糖的产率； 11．准确称取干燥后多糖 20mg 于 500mL 容量瓶中，加水定容； 12．取定容液 2mL 加入 6%苯酚 1mL，混匀，再加入浓硫酸 5mL，混匀，放置 20min 后，于 490nm 测吸光度； 13．葡萄糖标准曲线的制定：准确称取葡萄糖 20mg 定容于 500mL 容量瓶中，分别 取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 及 1.8mL，补水至 2mL，依 12 步骤反应液， 并分别测吸光度，根据葡萄糖浓度和吸光度绘制标准曲线； 14．根据香菇多糖吸光度和葡萄糖标准曲线，计算多糖纯度。 六、思考题 1．根据以上实验步骤，表达多糖产率及纯度的计算公式； 2．利用所学生物化学知识，分析多糖沉淀原理。55实验十八一、实验目的不同茶叶产物的提取及分离让学生了解不同茶叶产物的性质和提取工艺，掌握溶剂萃取技术和离子沉淀方 法。二、实验原理 茶叶中含有大量的茶多酚、茶多糖等物质，它们具有抗氧化、提高免疫力等生 理功能。茶多酚是一种小分子酚酸类物质，主要以儿茶素、表儿茶素的形式存在， 可通过大吸附树脂、离子沉淀等技术进行提取。茶多糖是一种糖缀合物，主要与酚 类及蛋白质结合，可通过乙醇沉淀进行提取分离。另外本实验中也涉及了咖啡因的 脱除方法。三、实验仪器 小型万能粉碎机、搅拌器、水浴锅、离心机、旋转蒸发仪、循环水式真空泵、 分液漏斗、干燥箱、烧瓶、烧杯、玻璃棒、量筒四、实验材料与试剂 原料：茶叶 500g 试剂：工业酒精、二氯甲烷、无水硫酸钠、盐酸、氯化锌、乙酸乙酯五、实验步骤 1．用小型粉碎机将茶叶粉碎为 40 目左右； 2． 20g 粉末放入 1L 烧杯中， 1： 比例加入蒸馏水， 70℃下搅拌提取 1 小时； 取 按 8 在 3．1×5000g 离心 10min，将上清液移入另一烧杯中； 4．加入终体积为 80%的酒精，混匀，静置 20min； 5．1×5000g 离心 10min，分离出沉淀即为茶多糖； 6．将上清移入烧杯中，在-0.1MPa、60℃下进行真空浓缩，浓缩至体积 30mL 左右； 7．将浓缩液移入分液漏斗中，以体积比 1；1 比例加入二氯甲烷进行萃取，分离有 机相，并加入少量无水硫酸钠干燥，滤纸过滤，40℃下挥干，得晶体即为咖啡因； 8．用 2M 盐酸将分液漏斗中水相调 pH 值为 6 左右，并加入饱和氯化锌溶液，至沉56淀产生完全； 9．1×5000g 离心，分离沉淀； 10．将沉淀物用 6M 盐酸水解，至沉淀完全溶解，再加入等体积乙酸乙酯萃取； 11．分离有机相，在干燥箱中于 40℃下进行真空干燥，所得固体即为茶多酚。 六、思考题 1．利用相似相溶的原理，分析不同茶叶产物的性质； 2．观察咖啡厅结晶现象，并试分析影响结晶因素。57实验十九植物材料中总黄酮分离提取及鉴定一、实验目的 为充分利用天然植物资源，避免资源的浪费，探讨植物总黄酮的提取及鉴别方 法 。二、实验原理 采用超声波乙醇浸提法从植物材料（银杏叶或菊花）中提取黄酮类物质，对所 提取的黄酮