2.5 骨髓诱导巨噬细胞--中国科学技术大学（中校区）生命科学学院结构与免疫学实验室
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2.5 骨髓诱导巨噬细胞
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骨髓诱导巨噬细胞（BMDM）
简介（INTRODUCTION）
Bone marrow-derived macrophages (BMDM) 是骨髓细胞在特定生长因子的刺激及诱导下得到的原代细胞。M-CSF与GM-CSF均可以诱导BMDM，但两种细胞因子诱导下得到的BMDM极化特性不同。目前一般采用M-CSF（或者用分泌M-CSF的L929细胞系的培养上清）来诱导成熟的BMDM。
材料（MATERIALS）
o& 试剂（REAGENTS）
L929细胞培养上清或者M-CSF（Peprotech）
红细胞裂解液（碧云天）
DMEM完全培养基
o& 实验前准备（SETUP）
所有手术器械进行高压灭菌
200目尼龙网，纱布等装在饭盒中高压灭菌
所有的15 ml以及50 ml离心管需要无菌
o& 器械（EQUIPMENT）
2 ml注射器（无菌）
Culture dish (untreated, Biofil)
实验步骤（PROCEDURE）
分离骨髓细胞 ►预计时间消耗：1小时
无菌环境下将小鼠后退腿骨取出，并剥离好放在培养基中。待全部腿骨取出后，用2 ml注射器将骨髓吹出，并用注射器吹打数次，将骨髓吹散。
将细胞悬液过200目尼龙网至15 ml离心管，2000 rpm离心5分钟。
弃上清，用红细胞裂解液重悬，并在4℃裂解10分钟。
加培养基终止裂解，2000 rpm离心5分钟。
重悬细胞并计数。最终将浓度调整至2×106/ml。
细胞诱导与极化 ►预计时间消耗：7天
BMDM诱导培养基成分：含10% FBS的DMEM完全培养基，10 ml/ml M-CSF（或者20%
L929上清）
cm培养皿中可加入7-8 ml细胞，每2-3天换液，7天可收获成熟BMDM。
7天的BMDM可以进行刺激或者极化，目前常用的两种极化条件：
M1型BMDM刺激条件：100 ng/ml LPS+20 ng/ml IFN-γ，刺激24小时
M2型BMDM刺激条件：10 ng/ml IL-4+10 ng/ml IL-13，刺激24-48小时。
针对性建议（TROUBLESHOOTING）
使用untreated培养皿可以更好地吹离贴壁的BMDM，加入5 mM
EDTA在培养箱中孵育5分钟左右，可以有效地吹离成熟的BMDM。
（2016年 尹雪莹撰 From Lian Lab）
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标题: 骨髓巨噬细胞的分离和培养(巨噬细胞,骨髓,血细胞)
摘要: [骨髓巨噬细胞的分离和培养(巨噬细胞,骨髓,血细胞)] 大家好，我是一个新手，我在分离骨髓巨噬细胞过程中有很多的血细胞，离心之后还是有厚厚的一层血细胞，请教一下大家是怎么解决这个问题的？谢谢 关键词:[巨噬细胞 骨髓 血细胞]……
大家好，我是一个新手，我在分离骨髓巨噬细胞过程中有很多的血细胞，离心之后还是有厚厚的一层血细胞，请教一下大家是怎么解决这个问题的？谢谢
回复用百分之零点八三的NH4CL去破它，一般1分钟到1.5分钟离心即可！回复BMDM吧？骨髓里直接分离到的巨噬细胞不多吧。红细胞用一定浓度的tris-NH4Cl裂掉，或者密度梯度离心也可以。然后是诱导培养，其实诱导个几天，红细胞也就都自己崩解掉了。回复谢谢各位高手指点！
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各处来源巨噬细胞的区别？
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有几个问题一直不明白，想咨询一下大家1.骨髓来源巨噬细胞（BMDM）、血液中的单核细胞、腹腔来源巨噬细胞之间有什么区别？2.以上三种来源的都是M1、M2还是M0？3.有paper说分离外周血的单核细胞注射到小鼠体内，那么BMDM可以吗？
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我也想知道 最近在做腹腔巨噬细胞 想知道骨髓和腹腔有啥区别
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关于丁香园我的宠物小仓鼠在二楼不见了！我有两只仓鼠一只黑色一只奶茶色的现在只见到了一只小仓鼠怎样才能让小黑鼠_百度知道
我的宠物小仓鼠在二楼不见了！我有两只仓鼠一只黑色一只奶茶色的现在只见到了一只小仓鼠怎样才能让小黑鼠
我的宠物小仓鼠在二楼不见了！我有两只仓鼠一只黑色一只奶茶色的现在只见到了一只小仓鼠怎样才能让小黑鼠自己跑到笼子边
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把屋内食物清理干净，只在笼子边放吃的并给它放一个舒服的小屋子，里面放些木屑。
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您好，用食物引诱
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我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。异氟烷对小鼠巨噬细胞胞葬作用及肺部炎症恢复的影响--《广西医科大学》2016年博士论文
异氟烷对小鼠巨噬细胞胞葬作用及肺部炎症恢复的影响
【摘要】：第一部分异氟烷预处理对小鼠巨噬细胞胞葬作用的影响目的:本研究从体内实验和体外实验观察吸入麻醉药异氟烷预处理对巨噬细胞胞葬作用的影响。方法:从小鼠体内提取骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞体外培养;用不同浓度0.5MAC、1MAC和2MAC的异氟烷预处理1h,用荧光染色的方法在体外监测BMDM和肺泡巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬情况;在体内实验,方案一:随机分为三组,CON组、BMDM组和ISO组,首先用CLOD去除三组小鼠肺内肺泡巨噬细胞,2天后,CON组小鼠气管内滴入相同体积的生理盐水,而BMDM组和ISO组小鼠气管内滴入LPS(3.5mg/kg),5天后给予CON组小鼠气管内相同体积的生理盐水,给予BMDM组小鼠气管内滴入BMDM(2×106,40μL),给予ISO组小鼠气管内1MAC异氟烷预处理后BMDM(2×106,40μL);方案二,随机分为CON组、LPS组和LPS+ISO组,给予CON组小鼠气管内相同体积的生理盐水,给予LPS组和LPS+ISO组小鼠气管内滴入LPS(3.5mg/kg),3天后给予LPS+ISO组小鼠吸入1MAC异氟烷1h,其他各组小鼠吸入空气。2h后后收集两种方案中三组小鼠肺泡灌洗液,通过甩片,用Diff-quick染色监测巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬情况。结果:体外研究发现,与未处理组比较,1MAC和2MAC异氟烷预处理的小鼠BMDM细胞对凋亡细胞清除能力明显增强,差异具有统计学意义(P0.05)。而0.5MAC异氟烷对小鼠BMDM细胞与未处理组相比,差异无统计学意义。1MAC异氟烷预处理的小鼠肺泡巨噬细胞对凋亡细胞清除能力明显增强,差异具有统计学意义(P0.05)。体内研究发现,用浓度为1MAC异氟烷预处理的小鼠BMDM细胞1h后,BMDM细胞在肺里对中性粒细胞的吞噬功能明显高于未处理组,差异具有统计学意义(P0.05)。与未处理组比较,用1MAC异氟烷处理后可以增强小鼠肺泡巨噬细胞对中性粒细胞的吞噬能力明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:体外实验结果显示,1MAC吸入麻醉药异氟烷预处理1h可以增强小鼠BMDM细胞和肺泡巨噬细胞对凋亡细胞的清除能力即增强小鼠巨噬细胞的胞葬作用;体内研究结果显示1MAC吸入麻醉药异氟烷处理后可以增强小鼠BMDM细胞的对凋亡细胞的清除能力,也可以增加小鼠肺内肺泡巨噬细胞的吞噬能力。第二部分异氟烷预处理对小鼠巨噬细胞胞葬作用机制的研究目的:观察吸入麻醉药异氟烷对BMDM细胞Mer蛋白表达变化、ADAM17的蛋白变化和AMPK的磷酸化变化的影响,探讨吸入麻醉药异氟烷预处理对小鼠BMDM巨噬细胞胞葬作用机制。方法:用不同浓度0.5MAC、1MAC和2MAC的异氟烷预处理BMDM细胞后,提取细胞内总蛋白,用免疫蛋白印记的方法检测总蛋白Mer的变化;1MAC异氟烷预处理BMDM细胞后,处理后分别在0h、0.5h、1h、1.5h和2h,提取总蛋白、膜蛋白、细胞质蛋白和收集上清液中蛋白,用免疫蛋白印记的技术监测总蛋白、膜蛋白、细胞质蛋白和收集上清液中蛋白中蛋白Mer的变化;总蛋白、膜蛋白和细胞质蛋白中ADAM17的蛋白变化;及总蛋白中AMPK的激活情况;通过先加入AMPK抑制剂Compound C 25μM或者用si RNA干扰沉默AMPK,后用1MAC异氟烷预处理细胞,观察细胞内Mer蛋白的变化情况、ADAM17的蛋白变化和AMPK的磷酸化情况;通过用si RNA干扰沉默BMDM细胞内AMPK,观察异氟烷预处理对AMPK基因沉默后的BMDM细胞,观察BMDM细胞胞葬作用的变化。结果:与未处理组比较,1MAC和2MAC异氟烷预处理组可以诱导BMDM细胞中Mer含量增加,具有明显的统计学差异(P0.05)。0.5MAC异氟烷处理组和未处理组比较,两组细胞内Mer蛋白含量差异无统计意义;与未处理组比较,1MAC异氟烷预处理后1h、1.5h和2h,BMDM细胞总蛋白中Mer蛋白明显增加,膜蛋白Mer蛋白中增加,差异具有统计学意义(P0.05),细胞质中Mer蛋白各时间点的变化无统计学差异,细胞培养液中的可溶性Mer蛋白明显降低(P0.05);总蛋白中ADAM17蛋白含量无明显变化,膜蛋白中ADAM17的含量明显减少,细胞质中ADAM17的含量明显增加(P0.05);与未处理组细胞内的AMPK的磷酸化水平比较,异氟烷预处理后0.5h、1h、1.5h和2h细胞内的AMPK的磷酸化含量有增加趋势,具有明显的统计学差异(P0.05);AMPK激酶的抑制剂化合物Compound C能够抑制BMDM细胞AMPK的磷酸化水平,抑制Mer蛋白在BMDM细胞总蛋白中、膜蛋白水平增加,抑制ADAM17在膜蛋白中的减少,具有明显的统计学差异(P0.05)。应用干扰技术沉默BMDM细胞AMPK后,可以明显抑制BMDM细胞Mer蛋白的表达(P0.05)。通过沉默BMDM细胞AMPK后,能抑制异氟烷增强BMDM的胞葬作用,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:吸入麻醉药异氟烷可以诱导BMDM细胞中的AMPK的磷酸化,减少细胞膜蛋白ADAM17的含量,从而影响ADAM17的功能,抑制可溶性蛋白Mer的生成,导致巨噬细胞膜蛋白Mer的增加,增强巨噬细胞的胞葬作用。第三部分异氟烷对脂多糖诱导小鼠肺炎症损伤的恢复的影响目的:探讨吸入麻醉药异氟烷预处理对脂多糖诱导的小鼠肺炎症损伤恢复的影响。方法:通过建立脂多糖诱导小鼠肺损伤模型,方案一,小鼠随机分为五组:空白对照(CON)组;经气管给予等体积的生理盐水;脂多糖(LPS)组,滴入LPS(3.5mg/kg)经气管内刺激;CLOD+LPS组,先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬细胞,后气管内滴入LPS(3.5mg/kg)刺激;CLOD+LPS+BMDM-CON组,先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬细胞,后气管内滴入LPS(3.5mg/kg)刺激,刺激后3d后气管内滴入BMDM细胞2×106(40μL);CLOD+LPS+BMDM-ISO组,先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬细胞,后气管内滴入LPS(3.5mg/kg)刺激,刺激后3d,后气管内滴入用异氟烷处理过的BMDM细胞107(40μL)。方案二:空白对照组;脂多糖(LPS)组,气管内滴入LPS(3.5mg/kg)刺激;LPS+ISO组;气管内滴入LPS(3.5mg/kg)刺激,刺激后3d,给小鼠吸入异氟烷1h。两种方案于LPS刺激之后1、3、5、7和9d收集肺组织标本和相应的肺泡灌洗液,进行监测肺泡灌洗液中中性粒细胞、蛋白和细胞因子的变化及肺组织内MPO、肺叶湿干比及肺组织的切片的变化。在方案一的基础上增加一组CLOD+LPS+BMDM(AMPKsi RNA)-ISO组,观察脂多糖刺激后第五天,肺泡灌洗液中TNF-α、白介素-6、TGF-β和白介素-10的水平变化。结果:在脂多糖刺激小鼠后5、7和9d,CLOD+LPS+BMDM-CON组和CLOD+LPS+BMDM-ISO组肺泡灌洗液中的中性粒细胞数目、灌洗液中蛋白、TNF-α和IL-6含量及显著低于CLOD+LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。与CLOD+LPS+BMDM-CON组比较,CLOD+LPS+BMDM-ISO组肺泡灌洗液中的中性粒细胞数目、灌洗液中蛋白、TNF-α和IL-6含量下降更加显著,差异具有统计学意义(P0.05);CLOD+LPS+BMDM-CON组和CLOD+LPS+BMDM-ISO组肺组织内MPO变化和肺组织湿干比显著低于CLOD+LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。与CLOD+LPS+BMDM-CON组比较,CLOD+LPS+BMDMISO组肺组织内MPO变化和肺组织湿干比下降更加显著,差异具有统计学意义(P0.05);CLOD+LPS+BMDM-CON组和CLOD+LPS+BMDMISO组肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量显著高于CLOD+LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。与CLOD+LPS+BMDM-CON组比较,CLOD+LPS+BMDM-ISO组肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量显著增高,差异具有统计学意义(P0.05)。脂多糖刺激后5d肺组织切片HE染色结果显示CLOD+LPS+BMDM-CON组和CLOD+LPS+BMDM-ISO组肺组织损伤评分显著低于CLOD+LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。与CLOD+LPS+BMDM-CON组比较,CLOD+LPS+BMDM-ISO组肺组织损伤评分比较低,差异具有统计学意义(P0.05)。按照第二种方案处理结果:在脂多糖刺激小鼠后5、7和9d,LPS+ISO组肺泡灌洗液中的中性粒细胞数目、灌洗液中蛋白水平、TNF-α和白介素-6含量显著低于LPS组(P0.05)。LPS+ISO组肺组织内MPO变化和肺组织湿干比显著低于LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。LPS+ISO组肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量显著高于LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。肺组织切片HE染色结果显示LPS+ISO组肺组织损伤评分显著低于LPS组,差异具有统计学意义(P0.05)。与CLOD+LPS+BMDM-ISO组相比,CLOD+LPS+BMDM(AMPKsi RNA)-ISO组肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6的含量增加,TGF-β和IL-10的含量减少,差异具有显著性差异(P0.05)。结论:吸入麻醉药异氟烷预处理BMDM可以明显减少脂多糖诱导的小鼠肺损伤肺泡灌洗液中的中性粒细胞的数目、蛋白含量、TNF-α和IL-6含量,减轻肺组织内MPO变化、肺组织湿干比变化和肺损伤评分,增加肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10的含量,从而加快脂多糖导致小鼠肺损伤的炎症恢复。
【学位授予单位】：广西医科大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2016【分类号】：R614
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