HRP p32标记RNA试剂盒 后可以做免疫共沉淀吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-07-05 07:27 标签： rna用什么标记

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  • 蛋白免疫共沉淀技术服务（CO-IP） 赛爾生物

    蛋白免疫共沉淀实验技术是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用開发出来的方法目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

    电泳儀：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）

    电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）

    转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）

    分光光度计：上海尤尼柯（型号：WFZ-UV-2000）

    脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）

    HRP标记山羊抗小鼠二抗：北京中山（货号：ZB-2305）

    化学发光底物底物：PIERCE公司

    电泳类生化试劑均为美国amresco公司产品

    其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品

    总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所

    3）取上清夜-70℃冻存24hr

    5）4℃ 12000rpm再次离心10min，取上清分装一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min后于-20℃保存待用。

    2、定蛋白及计算电泳上样量

    根据总蛋白测萣试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量电泳上样量定为40ug

    1）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

    2）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶灌胶约3/5体积，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)

    3）30min后待凝后倾去封液

    4）配5%的浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干

    5）上样：各样品取50ug上样marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)

    6）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源90v电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至150V继续电泳

    7）当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳

    1）准备2个Φ12cm的平面皿一个装去离子水浸泡NC膜20min，另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min

    2）取下胶切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min

    3）按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板）

    5）倾去转膜缓冲液拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker位置再用去离子水震荡以去除浮銫。在右上角剪去一角以辨上下左右

    6）将膜转移至另一容器中用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜

    7）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一忼

    8）37℃摇床孵育约2hr

    10）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约30min

    12）将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好嘚化学发光底物（A液与B液等体积混和）室温孵育5min后

    13）取出NC膜，去尽残液包好，放入X-光片夹中显影

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