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棉花VIGS系统的建立及应用研究
Establishing and Application an Efficient VIGS System in Cotton
公开范围：
报告类型：
报告作者：
[1]张鹏(中国科学院上海生命科学研究院)
中文摘要：
本研究旨在利用从棉花中分离的双生病毒，构建病毒及伴随卫星DNA的侵染性克隆载体，将其改造成诱导基因沉默（VIGS）的病毒载体，并建立和优化棉花的基因沉默（VIGS）体系。进一步利用建立的基因沉默（VIGS）体系鉴定相关的棉花未知功能基因，以实现对棉花中重要功能基因的高通量、高效、快速功能分析和验证。分离并测定了两个棉花曲叶病毒CLCuMV（GenBank登录号：JN968573）和CLCuSV （GenBank收录号JF416947）的全基因组DNA-A及两个其伴随卫星DNAb（GenBank收录号：JF416948及JN968574）的全基因组序列。构建了CLCuMV-GD37和CLCuSV病毒DNA-A及其伴随卫星DNAb的侵染性克隆，利用农杆菌接种本氏烟，证实了CLCuMV在烟草中具有很强的致病性，但在棉花中没有检测出致病性。CLCuMV病毒DNA-A具有独立的侵染能力，而DNAb不能独立侵染。DNA-A和DNAb混合侵染，可以提高病毒的致病性。筛选获得CLCuMV病毒DNA-A及其伴随卫星DNAb的侵染性克隆具有较强的侵染性。CLCuSV亦在本氏烟和棉花中均没有致病性。构建和优化了棉花皱叶病毒CLCrV病毒基因组DNA-A和DNA-B的侵染性克隆，农杆菌混合侵染显示其在本氏烟和棉花中均有很强的侵染能力。利用CLCuMV的卫星DNAb基因组构建VIGS载体。缺失DNAb基因组中bC1基因，并引入多克隆位点，改造成了VIGS载体。利用CLCrV DNA-A基因组，缺失外壳蛋白基因，引入多克隆位点，并连接进植物表达载体pCAMBIA2300，构建成了VIGS载体。选择ChlI基因作为目的基因，在烟草和棉花上测试病毒侵染能力和效率。CLCuMV-VIGS载体在烟草上具有很高的沉默效率，但在棉花上却没有表现出侵染性和沉默能力。CLCrV-VIGS载体在烟草和棉花上的沉默效率都比较高。采用棵斤棉和中棉所12做为受体进行侵染，其沉默效率较高。经过多个不同棉花品种的比较，发现棵斤棉和中棉所12做为受体进行侵染，其沉默效率较高，可达到90%以上。受体棉花的龄期以子叶期为佳。以农杆菌（OD600为1.0左右）侵染棉花子叶，效果最佳。对CLCuMV侵染的烟草及CLCrV侵染的烟草和棉花进行了总small RNA的提取，并已开展测序和分析，获得差异表达的miRNAs及其靶标基因。也开展了针对棉花抗病基因相关基因如乙烯受体GhCTR1的功能验证。该研究不仅克隆了几个棉花双生病毒及其卫星DNA的序列，构建了侵染性克隆并在烟草及棉花中进行了验证，并且在棉花中建立了基因棉花双生病毒的VIGS体系，经过多个基因的测试，确证了该体系的应用潜力，为我国开展棉花功能基因验证提供了技术，并为改良棉花的品质和产量打下基础。
英文摘要：
This study aims to isolate the cotton germiniviruses and their satellite DNAs for establishing an efficient VIGS system by the use of infectious clones. The technology should be important for studying the unknown function of cotton genes in cotton plants to achieve high throughput, high efficiency and rapid functional analysis and validation. The full sequences of two cotton leaf curl viruses (CLCuMV, GenBank No.JN968573; and CLCuSV, GenBank No.JF416947) DNA A and their satellite DNAb (GenBank No.JF416948 and JN968574) were obtained. Infectious clones of CLCuMV-GD37 and CLCuSV DNA-A as well as their satellite DNAb have been constructed and confirmed their infectivity in Nicotiana benthamiana, but not in cotton. DNA A of CLCuMV showed infecting ability independently, while the DNAb did not have any infection capacity alone. Increased pathogenicity was observed by the mixed infection of DNA-A and DNAb. The geminivirus CLCuSV was failure to infect both benthamiana and cotton plants. The construction and optimization of infectious CLCrV DNA-A and DNA-B clones were carried out. Strong infection ability was confirmed both in benthamiana and cotton by the mixed agroinoculation. A VIGS vector was developed by the use of satellite DNAb of CLCuMV in which the bC1gene was deleted and replaced by a multiple cloning site. Similarly, the VIGS system was also established using the coat protein-replaced CLCrV DNA-A genome. The VIGS working efficiency was tested in benthamiana and cotton plants by silencing the ChlI gene as the target. CLCuMV-VIGS system works effectively in tobacco but not in cotton. In contrast, CLCrV-VIGS system showed high efficiency of silencing in both plants, and cotton cultivars Kejimian and Zhongmiansuo12 as host were proved to be much better in gene silencing test with the frequency of more than 90%。The suitable condition for infection is to use the cotyledon stage cotton seedling with OD600 value of Agrobacterium suspension 1.0. Small RNAs of CLCuMV infected tobacco and CLCrV infected tobacco and cotton were extracted, sequenced and deep analyzed. Differentially expressed miRNAs as well as their target genes were studied. Using the CLCrV VIGS system, the functions of miR156b, transgenic Bt cotton, Actin and CHL were verified, further demonstrating the application potential of this system. The functional study of other key genes related to disease resistance, e.g., GhCTR1 of ethylene receptor, has been ongoing. Overall, the study not only cloned several cotton geminviruses and their satellite DNAs but also tested their infectivity in tobacco and cotton plants. The efficient VIGS system based on these viruses was also established and used to study cotton genes with known or unknown functions. This technology shows great potential in application of cotton improvement.
中文关键词：
棉花；双生病毒；棉花曲叶病毒；棉花皱叶病毒；侵染性克隆；VIGS载体；小分子RNA
英文关键词：C CLCuV; CLCrV; VIGSsmall RNA
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茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析 园艺学报，)：691–701. Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.17-0643；http：//www. ahs. ac. cn 691 收稿日期：收稿日期：；修回日期：修回日期： 基金项目：基金项目：国家自然科学基金项目（） ；中国农业科学院科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；农业部中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（5） ；重庆市院士引导专项（cstc2017jcyj-yszxX0005） ；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 共同第一作者 ** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：） 茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功 能初步分析 齐东霞1,*，张 映1,*，赵 祯1，张伟伟1，陈钰辉1，连 勇1，田时炳2，刘富中1,** （1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所，重庆 400055） 摘 要：摘 要：以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）载体 PYL156 为工具，采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片，通过表型比较、TRV 病毒分子检测和荧光定量 PCR 技术分析，探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子 TRV-VIGS 沉默体系的影响。结果表明，昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时，接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显，侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低；早春日光温室和秋季日光温室条件下，侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为 200 bp 左右时目的基因的沉默效果最好；侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑，而接种 6 周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证，结果表明显著抑制了 SmIAA19 的表达，其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低，表明 SmIAA19 是 1 个与生长素代谢途径相关的基因。 关键词：关键词：茄子；烟草脆裂病毒；病毒诱导的基因沉默；生长素诱导基因 中图分类号：中图分类号：S 641.1 文献标志码： 文献标志码：A 文章编号： 文章编号：X（1-11 Optimization of Virus-induced Gene Silencing System and Function Identification of SmIAA19 Gene in Eggplant QI Dongxia1,*，ZHANG Ying1,*，ZHAO Zhen1，ZHANG Weiwei1，CHEN Yuhui1，LIAN Yong1，TIAN Shibing2，and LIU Fuzhong1,** （1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2The Institute of Vegetables and Flowers，Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400055，China） Abstract：：Virus-induced gene silencing（VIGS）system is a very useful tool for evaluating gene function and molecular mechanism. Many factors，such as vector，viral proliferation and systemic movement throughout the plant，affect the efficiency of VIGS. In order to improve the VIGS silence efficiency in eggplant （Solanum melongena L.） ， three parameters （environment temperature， seedling age and gene fragment size）were optimized. The results showed that the silencing efficiency was higher in Qi Dongxia，Zhang Ying，Zhao Zhen，Zhang Weiwei，Chen Yuhui，Lian Yong，Tian Shibing，Liu Fuzhong?. Optimization of virus-induced gene silencing system and function identification of SmIAA19 gene in eggplant. 692 Acta Horticulturae Sinica，)：691–701. temperature controlled greenhouse[ （25 ± 3） ℃， daytime and （20 ± 2） ℃， night]than in room temperature greenhouse. After inoculation of the cotyledons of eggplant，the plants had obvious silence symptom，but there was no obvious silence effect when the six-week-old true leaves were inoculated. The silence frequencies of the gene fragments 597 bp，442 bp and 205 bp were 56.67%，62.5% and 68.75% respectively，indicating that about 200 bp might be the most suitable fragment size for VIGS. Then，the function of SmIAA19 from eggplant IAA family genes was evaluated using this VIGS system. The SmIAA19 silence plants presented obvious phenotypic symptoms after inoculation for 4 weeks. The transcript levels of SmIAA19 and auxin content in the SmIAA19 silenced plants were significantly reduced compared to the control. It showed that SmIAA19 was an auxin metabolic related gene in eggplant，and TRV-VIGS system was a reliable method for the function identification of eggplant gene. Keywords：： eggplant； Tobacco rattle virus （TRV） ； virus-induced gene silencing （VIGS） ； SmIAA19 病毒诱导的基因沉默 （virus-induced gene silencing， VIGS） 是一种转录后基因沉默技术 （Ratcliff et al.，1997） ，通过含有目的基因的重组病毒载体沉默植株同源基因，从而导致表型变异，实现对该基因功能的分析（Scofield et al.，2005；Senthil-Kumar & Mysore，2011） 。VIGS 技术具有快速、有效、操作简单和适用范围广等优点（彭燕 等，2002；Lu et al.，2003；Qu et al.，2003） ，其中烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）诱导的基因沉默（TRV-VIGS） ，具有病毒症状温和，持续时间长和沉默效率高等特点，是应用较为广泛的一种沉默体系（Huang et al.，2012） ，已在番茄（Ryu et al.，2004；Fragkostefanakis et al.，2014） 、烟草（Senthil-Kumar et al.，2007；Senthil-Kumar & Mysore，2014） 、 辣椒 （Zhang et al.， 2015） 、 马铃薯 （张晓萝 等， 2014） 和矮牵牛 （Spitaer et al.， 2007； Broderick & Jones，2014）等植物中成功应用。Liu 等（2012）也证明了 TRV-VIGS 体系能在茄子中成功应用，但其影响因素需进一步探索。 影响 VIGS 沉默效果的因素可以概括为病毒与宿主植物的相互作用及其生长的环境条件（Burch-Smith et al.，2004） 。如插入片段与目的基因的同源性（Thomas et al.，2001；Holzberg et al.，2002； Tuttle et al.， 2008） 、 插入片段的长度 （Burch-Smith et al.， 2006； 张增艳 等， 2006； Liu & Page，2008） 、环境温度（Liu et al.，2002；Tuttle et al.，2008） 、侵染方式（Fu et al.，2005；Liu et al.，2012）和植株的生育期（Cai et al.，2006）等。插入片段与目的基因的同源性越高，沉默效果越好，同源性超过 85%即可产生有效的基因沉默（Thomas et al.，2001；Holzberg et al.，2002） 。TRV 载体插入片段应控制在 23 ~ 1 500 bp（张增艳 等，2006） ，目的基因片段长度 200 ~ 350 bp 时沉默效果较好（Burch-Smith et al.，2006；Liu & Page，2008） 。温度是影响病毒传播和宿主植物生长最重要的环境因素之一，有研究表明，较低的温度沉默效果优于较高的温度，当温度高于 25 ℃时沉默效果不明显（Liu et al.，2002；Tuttle et al.，2008） 。侵染方式对 VIGS 的沉默效果也有不同程度的影响（Fu et al.，2005；Liu et al.，2012） 。寄主的不同生育期对病毒侵入、增殖和移动均有影响，同时也会影响VIGS 的沉默效率（Cai et al.，2006） 。 本研究中以茄子单性结实品系 D-10 为材料，构建实验室克隆的两个单性结实相关基因：茄子（Solanum melongena L.）甲硫氨酸亚砜还原酶 A 基因（methionine sulfoxide reductase A，SmMsrA）（张映 等，2011a）和生长素诱导
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烟草属(Nicotiana)抗病基因VIGS沉默系统构建.pdf 44页
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烟草属(Nicotiana)抗病基因VIGS沉默系统的构建
植物中已经克隆出来的抗病基因大多数包含NBS．LRR结构域，这类基因经常
以簇的形式存在于基因组中，其中有功能的抗病基因会与其相应病原体的无毒基因
作用，发生程序性细胞死亡(即过敏反应)，从而限制病原物的扩散来保护植株的其
它部位不受侵染。本实验以烟草野生种为对象，研究接种苗龄、农杆菌浓度、乙酰
丁香酮浓度和培养温度等四个方面对11种烟草野生种VIGS(virusgene
mmol／L，培养环境为22℃，16h黑暗；18。C，8h光照条件下，可以获得VIGS沉
默的最佳效果。此外，本研究在该条件下对另外14种烟草野生物种VIGS沉默效率
也进行了研究。同时根据茄科中已知的抗病基因的序列设计引物，在Nicotiana
个载体，覆盖了茄科中所有已知的抗病基因家族。利用已知功能的Ⅳ基因，对该系
码的各种抗性，并快速克隆抗病基因，从而为烟草、番茄、马铃薯等作物提供新的
抗性资源。
关键词：过敏反应；TRV；抗病基因克隆；VIGS载体
华中农业大学2011届硕士研究生学位论文
Mostcloned
encodenucleotide
site．1eucinerich
resistance僻)genes binding
S·ERR)domain．Plants
genesrecognize
correspondingpathogens．and
triggershypersensitive
response(rm)afterinfection，which
pathogeninto
consequentlyprotects
plants systemic
methodsforR
1 Nicotiana
genecloningexpensive
time-consuming．1
studiedonthe
seedlingsage，Agrobacterium
concentrationandcultural
temperaturerespectively optimizesilencing
system．The
concentration
system：seedlings
leaves，Ag
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