503 Service Unavailable
No server is available to handle this request.文档分类：
在线文档经过高度压缩，下载原文更清晰。
淘豆网网友近日为您收集整理了关于甲壳动物抗菌肽的研究进展和前景的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：甲壳动物抗菌肽的研究进展和前景 2003’青岛·全国水产养殖研讨会论文集甲壳动物抗菌肽的研究进展与前景栾伟李富花王在照相建海中国科学院海洋研究所青岛 266071)摘要抗菌肽是一种存在于动物体液中具有广谱抗菌活性的多肽.在动物体内普遍存在,种类众多。与近年陆生动物大量抗菌肽的发现和研究相比.甲壳动物抗菌肽的研究较为滞后。目前报道的甲壳动物抗菌肽分为四类,包括PeIlaeidin家族,Crustin家族.节肢动物多肽抗生素家族和阴离子抗茁肽家族。Penaeidin家旗抗菌肽是在对虾血细胞中呈组成型表达的抗菌肽,其N端富含脯氨酸,C端含6个半胱氨酸,形成3个二硫键.对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑制活性;Crustin家族抗菌肽是一类具有抗菌活性的蛋白,在对虾、蟹中均有报道,其特点是富含脯氨酸,可抑制革兰氏阳性菌和阴性菌;节肢动物多肽抗生素家族是在马蹄蟹中发现的,包括Tachystatin家族、Tachycitin、Big defensin,与角质素有特异性结合位点,对革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌均具有抑制活性;阴离子抗菌肽家族是一类新型抗菌肽.等电点为5.65—6.54,这类抗菌(来源：淘豆网[/p-.html])肽是对虾血兰蛋白c端的片段,其作用机制与血兰蛋白有密切关系,能特异性地抑制真菌的活性。基于抗菌肽的广谱抗菌活性以及对环境的安全性。抗菌肽有望成为一类新型的抗菌药物.在水产动物的病害防治中会具有广阔的应用前景。无脊椎动物在抵抗环境病原微生物的长期进化过程中,形成了一整套非特异性的免疫也答体系。由于它不具备脊椎动物的特异性免疫系统,而是通过体液免疫和细胞免疫的方式来抵抗外来病原的侵入,因而在对虾中不能借鉴脊椎动物疾病防治中所采用的疫苗免疫的方法。随着养殖生产的发展和不断扩大,养殖病害问题已经成为制约水产养殖健康发展的重要因素。在水产动物的育苗和养殖生产中,大量抗生素的使用,不仅使病原菌的酎药性提高,降低了药物的有效性.而且会直接影响养殖动物的种质.引起养殖动物抵抗力下降,生长速度减慢,病害频发等。此外,抗生索的大量使用.还会给环境安全造成巨大危害。针对近年来养殖业出现的病害日益严重的问题。开发一种有抗菌作用但对环境无害的产品来替代传统上所用的抗生素,箍终达到抗病的目的,是许多科学家努力的一个目标(来源：淘豆网[/p-.html])。经济甲壳动物的养殖在我国的养殖业中占有举足轻重的地位,对甲壳动物免疫系统和免疫相关基因的研究引起越来越多的重视。甲壳动物的免疫机制可分为细胞免疫与体液免疫.细胞免疫是指血液中的粒细胞将外界抗原物质吞噬、包裹、溶解、排出,达到清除异物的目的。体液免疫则是通过体液免疫因子实现对抗原的识别、凝集、溶解或直接将病原微生物杀灭.这些因子包括抗菌肽、溶菌酶、凝集素等。还有~些免疫因子不直接对抗原起作用.而是通过调节和诱导免疫反应.如酚过氧化物酶级联反应(prophenoloxidase cascade,pPO)、凝结反应(clotting cascade)和炎症反应,或是通过调节细胞的状态,起到防御的作用。这些因子包括丝氨酸蛋白酶及其抑制剂、热休克蛋白、硫氧还蛋白、以及与细胞凋亡有关的蛋白等。即使是细胞免疫,也需要这些因子的识别和调理作用。其中,抗菌肚的研究已经引起研究者的广泛重视。取得了~系列进展,本文主要对甲壳动物免疫因子一抗菌肽或抗菌蛋白的研究方面取得的进展进行评述,并对其可能的应用前景进行展望(来源：淘豆网[/p-.html])。抗菌肽(antibacterial peptide),又叫抗微生物肽(anfimicrobhl peptide),是在动物体液系统中具有广谱杀菌、抗病毒、抑病毒、抑杀肿瘤细胞等作用的一类膜活性多肽。1981年瑞典科学家Bornan等用丈肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hyatophora cecropia).发现了世界上第一种抗菌肽Cecropin(Steiner,1981)。此后20多年.人们相继在其他动物体内发现了170多种抗茵肽。尽管已经发现的抗菌肽数目众多、来自不同物种,但是它们的一级结构仍有不少的相似之处,如分子量小,耐热,N端亲水.c端疏水等。根据抗菌肽结构特征的不同,将抗菌肽分为3种类型:(1)具n-螺旋的线性抗菌肽;(2)含半胱氮酸可形成分子内二硫键的抗菌肽:(3)富含如脯氨酸、甘氨酸或某种特定氨基酸的抗菌肚。也可根据抗菌肽分子的等电点大小将其分为阳离子抗菌肽和阴离子抗菌肽(Munozet a1.,2003)。不同类型的抗菌肽,结构有所不同,抗菌类型也不同(Vizioli&S(来源：淘豆网[/p-.html])alzet,2002)。——一!望塑:宣墨:全璺查兰蠢堕堕过叁堡塞叁有关抗菌肽的作用机制.一般认为,抗菌肽在细胞膜上形成膜通道进而改变细胞的内外环境使细胞死亡.基本步骤如下:(1)抗菌肽分子通过静电作用被吸附到膜表面。(2)抗菌肽分子的疏水基团插入到细胞膜的磷脂双分子层。(3)抗菌肽的***分子a一螺旋插入膜内.多个抗菌肽分子共同作用最终形成离子孔道(BacheR eta1.,2000;Muooz et a1.,2003)。与在陆地节肢动物中发现的大量抗菌肽相比,甲壳动物中分离得到的抗菌肽相对较少,可粗略地归为四类:Peoaeidin家族、Crustin家族、节肢动物多肽抗生素家族和阴离子抗菌肽家族。1 Penaeidin家族抗菌肽的研究Penaeidin家族抗菌肽是在甲壳动物中发现较早、较大的一类抗菌肽。Destoumieux等(1997)利用HPLC从凡纳对虾的血淋巴中分离纯化得到三种具有抗菌或抑菌活性的多肽组分,命名为Penaeidin.1(5484.8Da)、Penaeidin-2(5(来源：淘豆网[/p-.html])520.0Da)、Penaeidin-3(6617.4Da)。这3种肽的~级结构显示出共同的特征,即N端富含脯氮酸,C端含6个半胱氨酸,形成3个二硫键。基因序列分析得知,成熟的Peneaidin抗菌肽是由前体分子加工得到的。前体分子在N端有保守性报强的信号肽.成熟肽有翻译后修饰的过程.或者c端酰氨化,或者N端由焦谷氨酸环化。Penaeidin—l和Penaeidin.2都由50个残基组成.带7个正电荷;Penaeidin-3由62个残基组成。带8个正电荷。与前两种肽相比.Penaeidin-3的N端被焦谷氨酸封闭。Penaeidin.2和Penaeidin.3的cDNA序列开放阅读框(o啪最后面一个***基酸为甘氨酸,但在测序时得到的成熟肽序列中已被去除,因此认为这两个分子的C端是酰氮化的。这种方式在昆虫Cecropin中也有发现(Destoumieux et al。1997)。Destoumieux等(2000)利用NorthernBlot方法研究了Penaeidins的组织表达。发现血细胞是(来源：淘豆网[/p-.html])Penaeidins的主要合成部位.Penaeidins在血细胞中为组成性表达.而表达的个体差异可能反映动物不同的免疫刺激状态或对虾肽基因表达的遗传差异。通过免疫荧光分析、Evan氏蓝染色以及免疫金标记等技术研究发现:Penaeidins在血细胞中合成后并不直接分泌到血浆中,而是在细胞质中以储存颗粒的形式贮存.这同人的嗜中性粒细胞的防御机制很相似(Destoumieux et ai.2000)。Penaeidins的表达和分布是通过血细胞对微生物的反应来调控的(Munozetal,2002)。NorthernBlot和RT-PCR的研究结果表明,Penaeidin基因在幼虾中就有表达.但表达量报低.仅有极少量表达Penaeidin基因的细胞存在于幼虾体内(Mtmoz etal..2003)。与昆虫抗菌肽相比较,Penaeidins有以下不同:(I)Penaeidins分子具有两类昆虫抗菌肽分子的特点,即富含脯氮酸的N端区域和含有3个二硫键的环型c端区域,对应着两类不同的昆虫抗菌肽:线型的富含(来源：淘豆网[/p-.html])脯氨酸的抗菌肽.具有抗革兰氏阴性菌的活性:具有3个分子内二硫键、环形的富含半胱氨酸的抗菌肽,多数具有抗革兰氏阳性茵的活性。因此.Penaeidins同时具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的广谱抗菌活性。(2)翻译后修饰。昆虫防御素类一般没有N端的环化和c端的酰氮化,而在Penaeidins-3中同时存在着两种方式的翻译后修饰。(3)合成部位不同。昆虫抗菌肽一般是在脂肪体中合成,而Penaeidins是在血细胞内合成。(4)表达方式不同。绝大多数昆虫抗菌肽是在诱导后迅速而短暂地合成,而Penaeidins则为组成性表达.即在对虾血细胞内持续不断地合成。(5)释放方式不同.昆虫抗菌肽合成后迅速释放,Penaeidins合成后则在细胞质颗粒内以成熟肽的形式储存,受到刺激后才释放(V'nioli&salzE‰2002)。国内在中国对虾抗菌肽研究上也取得很好的进展。王金星教授的实验室根据已报道的凡纳对虾(Litopenaeusvannamei)的抗菌肽Penaeidin.2的序列设计兼并引物,(来源：淘豆网[/p-.html])利用RT-PCR扩增。得到了特异性扩增片段。经过克隆、测序.获得一个123bp的开放阅读框,在基因库中进行相似性检索表明,该序列与凡纳对虾的抗菌肽相似.其中与Penaeidin-2的相似性为58%.与Penaeidin-1的相似性为55%,与Penaeidin-3的相似性为53%(康翠杰等,2001)。目前已经获得中国对虾抗菌肽的全长cDNA序列,并已经完成了体外重组表达和功能验证.2 Crust in家族抗菌肽的研究Crustin家族抗菌肽是一类分子量比Penaeidin大.具有抗菌活性的蛋白,在对虾、蟹中均有报道。2.1蟹Crustins从三叶真蟹CarcinusmaegRⅡ中分离得到的Crustin是从甲壳动物中得到的第一种抗菌蛋白.分子量2003’青岛·全国水产养殖研讨会论文集6.5KDa-富含脯氨酸·对于革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑制活性。部分测序结果表明.其N端氨基酸序列与来源于牛嗜中性粒细胞的抗蔼肽Bactenecin.7具有60%以上的同源性。其~级结构中(来源：淘豆网[/p-.html])含有Pro.Am。Pro结构域(Sehnapp ct al,1996)。2.2对虾Crustins对虾的Crustms是由Bartlen等(2002)从凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)和白滨对虾(Litopenaeusset扮r&)血细胞的cDNA文库中克隆获得的.其中在凡那对虾血细胞的eDNA文库存在三种不同的Crustins形式(Genbank注册号为AF430071,AF430072和AF430073),白滨对虾血细胞的cDNA文霹存在另外三种不同的Crustim形式(Genbank注册号为AF430077,AF430078和AF430079)。从凡纳对虾克隆到的crustins,其氨基酸序列的N端存在一段信号肽序列.这段序列长度为25个氨基酸残基。信号肽序列之后是一个富含脯氨酸的重复序列区域,大约跨越了50个氨基酸残基的长度。前导序列和富含脯氨酸的区域都是疏水性的。c端到这段重复序列之间为一段富含脯氪酸和半胱氨酸的区域.这个区域含有12个半胱氨酸,形成了(来源：淘豆网[/p-.html])6个分子内二硫键。从自滨对虾克隆到的Crustin与凡纳对虾的Crustin基因的主要差别在于其重复序列的长度和构成上(Battler et a1..2002)。2.3凡纳对虾的Crustin与三叶真蟹的Crustin的比较从凡纳对虾克隆到的Crtlstin,分子量为11.5KDa,比从三叶真蟹得到的Cmstin(6.5KDa)大的多。前者的N端有一个畜含甘氨酸的重复区域,重复序列为5'-VGGGLG.3’,这段重复区域跨越了40~50个残基的长度。二者的相似区域在c端的后80个氨基酸残基(Bartlett et a1.2002)。3节肢动物多肽抗生素家族1waIlag《2002)在马蹄蟹血细胞的颗粒中发现了具有抗菌活性的多肤分子.包括Tachystatin家族抗菌肚,Tachycitin和Big dcfemin.3.1 Taehysmtin家族抗苗肽在马蹄蟹血细胞中发现的Tachystatin家族抗菌肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌有广谱抗菌作用。在这个家族中,TachystatmC是抗菌最有效的。TachystatinA与TaehystatinB有同源性,但是Tachystatmc与Tachystatin A、Tachystatin B没有明显的相似序列。鉴于马蹄蟹与蜘蛛的近亲关系.得到的Tach),statins与蜘蛛的神经***在序列上有很大的相似性(1wanaga,2002)。3.2 Taehycit/nTachycitin由73个氨基酸构成.内含5个二硫键且N端无糖基连接。Taehycitin本身的抗菌活性并不强,但是它能有效地增强Big sin的抗菌话性。只要极少量的Taehycitin存在,B.g defensin就可以仅用正常情况下抑制革兰氏阴性菌的浓度的1/50.即可将革兰氏阴性菌生长能力降低到50%。Taehyeitin在三维结构上大致可以分为N端区和c端区,后者有~个双B-折叠构成的发卡结构.这个结构可以看作是一种从橡胶树中分离出的抗真菌肽hevekn的角质素结合位点的缩小版.尽管二者在序列上没有相似性。Tachycitin有与角质素结合的能力。因疏水结构都集中在双B一折叠构成的发卡结构,这个结构起着角质素结合位点的作用。角质紊是真菌细胞壁的成份之一.也是节肢动物外骨骼的基本结构成份。因此.抗菌物质从血细胞中释放出后很可能通过识别伤口处暴露的角质素来识别作用部位。它们可能不仅仅起着抗菌的作用,还可能通过激活或者促进角质鬃在伤口处的生物合成从而起到愈合伤口的功效(1wanaga,2002)。3.3 Big defensinBig defensin也是存在于马蹄蟹血细胞颗粒中的一种抗菌肽.它能强烈地抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌以及部分真菌。Big defensin由79个氪基酸残基构成,sins相似。但是,big defemin与哺乳动物的defensins在大小上有很大的差异,后者仅有29~34个氨基酸残基。值得一提的是,big sin中二硫键的特征与从牛嗜中性细胞得到的13-defensin一致.但与昆虫的defensim有很大差别,不仅仅在二硫键的分布上.在分子大小上二者的差距也是报大的(1wanaga’2002)。!!塑:童曼:全里坚兰菱堕堡过盒堡壅塞4阴离子抗菌肽家族Destoumieux-G{u'zon等(200D从大西洋白对虾和凡纳对虾的血淋巴中利用HPLC技术分离到了3种独特的具有抗真菌活性的肽类:PsHctI,PsHct2和PvHct3,均带负电荷。经Edrnan降解法测序,结果证明前两种分子都是对虾血蓝蛋白C端的片段。另外,从凡纳对虾(LitopenaeuS vannamei)酸性血浆中纯化得到的抗真菌肽PvHct3.分子量为2.7KDa。相似性检索表明,这种肽与凡纳对虾血蓝蛋白c端的相似性报高(DestoumieIl=x等,2001)。这三种肽在生理pH条件下.等电点为5.65—6.54.与其他的阳离子抗菌肽——如前面的Penaeidins家族抗菌肽~刚好相反。虽然它们是血蓝蛋白C端不同长度的片段。但分子结构中不包含铜离子结合位点.因而其抗菌活性与金属离子或二价阳离子的结合无关.至于它们的作用机制.到目前为止仍没有较为令人满意的假说来解释(Destoumieuxeetal,2001)。当对虾被感染后.在它的血淋巴中检测到更高浓度的PvHct.这表明血蓝蛋白的裂解是由生物学信号引起的.而非出现在抽提过程中。虽然血蓝蛋白的加工机制还不清楚,但是推测它缀可能是由酶驱动的。实验发现.螯虾和对虾被微生物感染后有免疫活性的细胞有胞吐的现象,对虾技微生物感染6一12h后.作为血细胞胞吐作用的结果。可以观察到PvHct的浓度有相对的增长。因而.可以推翻这些酶来源于血细胞,血细胞胞吐作用有助于血蓝蛋白裂解酶的释放(Deslo∞ieux&Garzon.2001)。通过对多种微生物(细菌和丝状真菌)的液体生长抑制分析来检测PvHct的抗菌谱。发现PvHct对14种革兰氏阳性菌、5种革兰氏阴性菌和两种虾的病原菌(Fibrio harveyi,F;:briopenaeicida)都没有抗菌活性.但对真菌显示出广谱的抗菌活性,进~步的免疫分析表明,在感染微生物lh内。血浆抽提物中的血蓝蛋白c端片段PvHct的浓度开始增长。6h后达到平台期,以后逐渐降低,72h后仍比对照的浓度高.表明由这种血蓝蛋白水解产生了抗菌肽(Des幻tunieux&Garzon,2001).自上个世纪80年代抗菌肽的首次发现到今天,抗菌肽的研究历经二十年,天然抗菌肽的发现为抗击病原微生物提供了有力的武器,晟近的研究表明,有些阳离子抗菌肽和非阳离子抗苗肚在许多脊椎和无脊椎动物中同时表达.这些抗菌肽可能协同作用以抗击外界病原的入侵。但是不能不清醒的认识到,甲壳动物抗菌肽的研究仍没有广泛开展,相对于哺乳动物和昆虫抗菌肽的研究,甲壳动物抗菌肽的研究是比较滞后的。到目前为止.抗菌肽的研究与其预期的应用还相去甚远,不仅仅是甲壳动物抗蔚肽。几乎所有已发现的抗菌肽的作用机制、表达调控中尚有许多悬而束决的问题有待研究。在全面了解抗茵肽的作用机理,调控方式.全基因序列等的基础上,通过体外重组表达大量生产后,抗茁肽在制药、治病等方面的价值才能充分发挥。抗菌肽作为传统的抗生豢的替代品,在水产养殖业上会具有十分广阔的应用前景。参考文献I康军燕.3.柬盛.王金星.帽建海.海水彝殖生物寮害笈生与控镧.海洋出版社,200l,呷llI-117 2 B雎慨E,D n嘲伽ml姒P Bulet,2000 Pecaekli蝇枷mi口ob削pe—ides of小n呷:●咖p帅虬●钠出妇d如日oaofWeimmua/ty.^quacullare191.71-98 3 Bartlett.L B Cwmbemon.E Shcpard,Rna呷T啮qPCams andG W_L 2002 C删柚峨bomologues of柚ll 5-km锄曲鲥日“pep姚,‰t帅q脚缟ofpemeid曲呻.L.open—swei^口d“foJ捌‘枷sef咖na M札掰雠酏I叩d 4 278-293 4 Dc如峨i叫.D.SaukmerD。Gamier Jd吐2001 0I嘲啪Ⅱimm“olty:,muruagaJlX'-'伸d,es村gtaeratcd如mtl'e ctcrmmasofslhimplI曩Docy蚵nin r唧哪eiom/cmbm}dadJeap JB“Ch弧276.47070—■7077 5 Destoumieux.D.MMt帅z卫Bulcf耐EBad船≈2000 Pc确蛐^familyofamimic=obialIg'Iai&sfrompetmeidshamp(cm☆憾.Decapoda).CelluLar孤dbtolecutIrI如Scjl:aces 57f”l6 1wanaga,S.2002 Themd%ul*basi50fW蛔如岫m■ch舯目}-∞曲Currentop“onmhmmmology,14:87-95T M岫oz.M-.Ev抽出d,u‘矗e.D Fmulni甘andE BIcI峨2002 E***∞ss如n‘nddis岍butionofpe哺ci血amdmicrobi目【刚d靠-mm曲ed竹咖oc”efc越nansmm耙r曲瑚dlIIIdl自酣岫叩Fair.J蹦。曲口^269:267摹.2689 8 Munoz.M,F v.IId蛐b-IIc咄YG畔g嶂~EB越k删3 hP嘟i∞of畔tdin柚liIl肿rob神i:rptidesinearlylm~sl stagesofthe shnmg舶I卯蚶咖,Ⅺm“Deve,'铆acaal量c(H￥岫6坩妇曲删轴豺27:28:3-259 9 RochP.1998 stmedlammxs and出螂c口H目击∞in白r酬衄碑mv=rtebnat*mAquacul札m172.125-145 10 Sdma坤D.G.D Kem,u,VJ Srmth,|996 n蛐∞fI∞andd盥越”iz匝舶of4proline*richantt油ctedalpepudcwith sequ蛐ceqmnari|ytobacteaecin-_)fromnlehaeumcvt瞄of恤jhO他crabCaecmus肿孵R茁E珥Jmodma240:532·S39t1、_qz/*oli.J州M S山吒2∞2^枷a曲Wpep6des丘呻柚蛔-Il=fbc世offinvectdrates.TrendsinFaammcologicalScimces494--1342播放器加载中，请稍候...
该用户其他文档
下载所得到的文件列表甲壳动物抗菌肽的研究进展和前景.pdf
文档介绍：
甲壳动物抗菌肽的研究进展和前景 2003’青岛·全国水产养殖研讨会论文集甲壳动物抗菌肽的研究进展与前景栾伟李富花王在照相建海中国科学院海洋研究所青岛 266071)摘要抗菌肽是一种存在于动物体液中具有广谱抗菌活性的多肽.在动物体内普遍存在,种类众多。与近年陆生动物大量抗菌肽的发现和研究相比.甲壳动物抗菌肽的研究...
内容来自淘豆网转载请标明出处.&旗下网站·中国农业百强网站（政府类三十强）
> 水产动物抗菌肽基因异源表达研究进展
水产动物抗菌肽基因异源表达研究进展
&&&&&&& 抗菌肽是生物体抵抗病原体感染的一类小分子多肽，广泛存在于细菌、真菌、昆虫、动植物及人体内。抗菌肽除具有非特异性杀病原微生物、抗肿瘤作用外，还以其不易产生耐药性、活性稳定、不会污染环境等优点而成抗生素最可能的替代品之一。在众多来源的抗菌肽中，水生动物的抗菌肽以其杀菌作用更强、溶血效应较小、种类更多样化而显示了更具优势的应用前景。因此，用廉价的方法大量获取水生动物抗菌肽是对其进行深入研究及广范应用的前提。传统的方法是直接分离并对其进行相应的研究，但此方法工作繁琐、外界条件对抗菌肽的提取影响较大，而天然抗菌肽含量低、无法从体内大量提取；另一种方法化学合成肽则价格昂贵。因此，利用基因工程技术生产水产动物抗菌肽就成为一种必然选择。目前，国内已有国家海洋局采用水产动物重组抗菌肽研发水产抗菌新药、厦门大学以鱼类抗菌肽做为饲料添加剂即将问世的报道，但水产动物抗菌肽种类繁多，找到抗菌能力更强、应用范围更广的重组抗菌肽仍是当下研究的热点。为此，本文对水产动物抗菌肽在不同表达系统中的研究进展做一综述，以期为水产动物抗菌肽相关研究提供参考。 中国乡村网
1& 大肠杆菌表达系统 乡村网
&&& 大肠杆菌做为基因重组技术的重要宿主细菌之一，有着较清楚的遗传背景、易于培养且周期短、目标蛋白易于纯化等诸多优点，使之成为表达外源蛋白的首选表达系统。但在表达抗菌肽时，因为抗菌肽对宿主可能具有的细胞毒性、其自身在宿主细胞中也可能被降解以及抗菌肽编码的基因较小等原因，因此单独在大肠杆菌系统中表达抗菌肽的报道较少：相关的研究是将日本牙鲆的hepcidin基因克隆到PEt21a中，并转化至大肠杆菌DE3细胞中，产物以包涵体形式存在。 本文来中国乡村网
&&& 针对以上问题，研究人员采用了诸多策略，其中融合表达方式在水产动物抗菌肽的表达上应用较为广泛。融合表达是依据抗菌肽自身特点(分子量小、阳离子型等)，在其N端连接一段可以在细菌中表达的蛋白质序列，该序列可以中和抗菌肽的正电荷、同时便于切割、回收、纯化。早在1997年，Pierce等采用融合表达方式，把鲎血细胞抗菌肽的编码基因克隆到大肠杆菌中进行表达，表达产物与天然抗菌肽活性相似，在浓度8～12&g/mL条件下，对牡蛎的一种寄生原虫有明显的抑制作用；Zhang等在大肠杆菌中表达了具有WAP结构域的中国对虾抗菌肽CruFu，其表达产物对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用；Amparyup等以PFT28b做为表达载体，将斑节对虾的Ⅱ型Crustin基因进行重组表达，表达产物对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强的抑菌活性；Moon等将泛素做为伴侣分子，与鱼抗菌肽Piscidins进行融合，经低温诱导，酵母泛素水解酶处理，获得了相对分子量、抗菌活性与天然Piscidins类似的重组产物。在国内，水产动物抗菌肽也得到了较深入的研究，多种抗菌肽被克隆和表达：付百玲等将对虾抗菌肽Penaeidin-2克隆至PET-32a(+)表达载体中，并在大肠杆菌DE3中表达，表达产物对革兰氏阳性菌、阴性菌和抗氨苄青霉素大肠杆菌均有一定的抑菌作用；张虹等从斑点叉尾鲴肝脏中克隆了抗菌肽(LEAP-2)，并构建了“PET32a-IpL-2”的重组表达质粒，并将其转化至大肠杆菌BL21，结果表明可溶性融合蛋白得到高效表达。 乡村网
&&& 此外，密码子优化和嵌合表达等策略也得以在大肠杆菌表达系统中应用。密码子优化策略是针对大肠杆菌基因偏爱特定密码子的特点而设计抗菌肽的编码基因，如张钫等将鲎抗菌肽基因开放阅读框末端添加密码子Asn，并将其与PET-28c(+)连接、转化至BL21，表达产物在体外表现出较强的抑菌活性；而嵌合表达则是二种抗菌肽基因嵌合成长序列，这样外源基因长度增加，且表达产物无需切割，同时兼具二种抗菌肽的抗菌谱。郝淼闻等采用overlap-PCR将对虾抗菌肽PEN-3和PEN-4连接，组成嵌合基因序列，将其克隆表达，表达产物对枯草杆菌和溶藻弧菌具有明显抑制作用。 本文来中国乡村网
2& 酵母菌表达系统 本文来中国乡村网
&&& 酵母菌表达系统和大肠杆菌相比，其基因表达调控机制更完备、不产生内毒素、且具有原核和真核表达系统的双重特点，表达产物可维持天然蛋白质的结构和生物学活性，具有表达产量高、易培养、易纯化等诸多优点。 本文来中国乡村网
&&& 1999年，Destoumieux等将南美对虾抗菌肽一对虾素2和对虾素3a的编码基因克隆到酿酒酵母中，表达产物在结构上与天然分子有一定的差异，但抗菌活性相似；2010年，Wu等筛选35条厚壳贻贝mytilin和myticin基因，构建了相关的真核表达载体，并成功的将其转化至S78酿酒酵母中，为后续工作打下了良好的基础；同年，申望等将克隆的三疣梭子蟹I型Crustin抗菌肽基因，构建分泌型真核表达质粒，并转化至酿酒酵母S78，经RT-PCR和SDS—PAGE验证，证明重组Crustin表达成功；2008年，李伟等将大菱鲆hepcidin基因成熟肽序列经部分改造后，构建了重组胞内融合表达载体，并在毕赤酵母SMDll68中实现了表达；次年，蔡晶晶等将黑鲷抗菌肽hepcidin前体肽和成熟肽基因整合到毕赤酵母基因组中，其表达产物具有很强的热稳定性，且能抑制多种革兰氏阴性菌和阳性菌的生长。 中国乡村网
&&& 虽然酵母表达系统是抗菌肽基因应用最为广泛的表达系统之一，但也受到宿主菌的状态、内源蛋白酶的活性、转化基因表达效率等诸多因素的影响，其表达结果也有不甚理想的报道：李胜杰等构建的大口黑鲈hepcidin基因的毕赤酵母工程菌，虽可检测到hepcidin的转录，但却未检测到表达产物及抗菌活性；而Burrowes等在鱼类防御素pleurocidin的毕赤酵母表达时，也出现了同样的现象。因此，在毕赤酵母表达体系中，应注意影响其外源基因表达的各种因素。 乡村网
3& 转基因动植物表达系统 中国乡村网
&&& 以动物或动物细胞做为表达系统将抗菌肽基因转入，主要是为了获得抗病群体或含有抗菌肽的动物性产品(如血清等)。目前，以水产动物为宿主表达抗菌肽的研究，主要集中在为提高水产动物抗病力、获得抗病群体的研究上：Samasika等将几种cecmpin基因导入鲑鱼胚胎细胞中，经检测，该基因已成功融入鲑鱼胚胎细胞中，同时以细胞分泌物做抑菌试验，证明，其可以抑制多种病原菌生长；Rex等将惜古比天蚕的抗菌肽基因导入斑点叉尾鮰，其子代鱼抗病能力明显增强，试验结果表明已初步获得抗病个体。虽然抗菌肽基因转基因动物是获得抗病群体的理想途径，但研究者也面临着研究周期长、成功率低等诸多问题。 本文来中国乡村网
&&& 在转基因植物方面，研究人员将抗菌肽引入植物宿主，可以获得抗病能力较强的植株或物种：王维等将中国对虾抗菌肽基因导入水稻中，获得阳性植株系，该植株系对农艺性状未产生显著影响，通过感染试验，认为中国对虾抗菌肽对水稻白叶枯病菌可能具有较广谱的抗性。 本文来中国乡村网
4& 结语 中国乡村网
&&& 随着抗生素在水产养殖业中的广泛使用，水产品的药物残留、耐药菌株的出现等问题也日益严重。而抗菌广谱、机理独特的抗菌肽的出现，给解决上述问题带来了曙光。运用基因工程技术将抗菌肽基因异源表达，不仅可以获得大量抗菌肽，而且相比直接提取、其费用低廉，为广‘泛应用奠定基础。但以目前的状况来看，要想使水产动物抗菌肽得以广泛应用，其异源表达仍面临有待解决的问题：如何提高抗菌肽基因转导的成功率；如何提高表达产物的回收率及产量；转基因动植物表达抗菌肽如何提高表达量、保证产物稳定性等。相信基因工程技术不断完善及研究的深入，这些问题将会被人们认识并解决。为水产动物安全用药、绿色添加剂的使用、以及转基因抗病群体的研究，提供强大的理论依据和技术支撑，水产动物抗菌肽将会更广泛的使用。 中国乡村网
&&& 作者单位：(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.柳河县安口镇中学，吉林柳河 135304) 本文来中国乡村网
&&& 文章采集：caisy http://www.
&&& 注明：吉林省科技厅项目（） 本文来中国乡村网
------分隔线----------------------------
------分隔线----------------------------
相关阅读：
本站部分信息由企业自行提供，该企业负责信息内容的真实性、准确性和合法性。对此不承担任何保证责任
中国三农信息发布平台·中农兴业工程指定网站&
中国新农村发展建设协会 主办
&版权所有&&京公网安备Copyright &
Inc All Rights Reserved
联系邮箱：&&联系电话：010--00—789—008业务洽谈：&&技术咨询：
客服QQ：&业务洽谈QQ：