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怎么样提取细胞中的总蛋白质？
怎么样提取细胞中的总蛋白质？
取决与你要做什么了。。。 最常用的是：用细胞裂解液提取呀，最后你是要做含量测定还是啥的？含量测定酶标仪或紫外光度计。
具体的方法很多你可以参考
蛋白质提取与制备
蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用
材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适
用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均
可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有
机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶
解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这
些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子
强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。
将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性
的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的
角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、
糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用
水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取
液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH 用适当缓冲液控制时，共稳定性及
溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫
酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin)溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱
溶液抽提。
一、蛋白质类别溶解性质的介绍
简单蛋白质：
球蛋白：溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。
真球蛋白：一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。
拟球蛋白：溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出
醇溶蛋白：溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇
壳蛋白：在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液
精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀
组蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀
硬蛋白质：不溶于水、盐、稀酸及稀碱
缀合蛋白：包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋
白和氮苯蛋白等。 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋
白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如
脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。
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二、蛋白质提取与制备概述
蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来
虽有了不少改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差
别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和
结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达
到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的
物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、
形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分
子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按
电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性
有亲合层析法等。
由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由
于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可
循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化
学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样
进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得
预期结果。其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯
化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种
外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过
分析鉴定来判明。
另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物质结合，这
给分离精制带来了困难。如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用，若被除去
则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。如高峰淀粉酶A 的Ca2+，胰岛素Zn2+等。此
外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限制
了分离精制的方法。通常是根据具体对象联用各种方法。为得到天然状态的蛋白质，尽量采
用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，并还要注意防腐。
注意共存成分的影响。如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中需引起重视。
纯化蝮蛇神经毒素时，当室温超过20℃时，几乎得不到神经毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶
能被0.1mol/L EDTA 完全抑制，因此在进行柱层析前先将粗毒素0.1mol/LEDTA 溶液处理，
即使在室温高于20℃，仍能很好的得到神经毒素。
整个制备过程一般可分为5 个阶段：①材料的选择和预处理，②细胞的破碎（有时需进
行细胞器的分离），③提取，④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层
析、超离心及结晶等），⑤浓缩、干燥及保存。以上5 个阶段不是要求每个方案都完整地具
备，也不是每一阶段截然分开。
不论是哪一阶段使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性。保存
活性防止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、
遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失。因此选择的条件应为十分
温和。同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。
三、蛋白质提取与制备具体操作方法
1、原料的选择
早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经
常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，
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因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成
本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量
来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属
的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查
制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解
蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属
必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但
使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对
动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
a、细胞的破碎
材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷
冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先
将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难
易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即
可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法
主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达
10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两
个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的
也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局
部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损
⑵物理方法
主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
Ⅰ反复冻融法
于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大
部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细
胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。
Ⅱ冷热变替法
将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部
分细胞被破坏。
Ⅲ超声波法
暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便
且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一
些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。
Ⅳ加压破碎法
加一定气压或水压也可使细胞破碎。
⑶化学及生物化学方法
Ⅰ有机溶媒法
粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，
破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，
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经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。
将待破碎的鲜材料在一定pH 和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞
内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取
羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左
右较早溶化。自体融解过程中PH 显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自
溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。
与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶
处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量
高，而多易结晶化。1g 菌体加1～10mg 溶菌酶， pH6.2～7.01h 内完全溶菌。于生理食盐水
或0.2mol 蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤
维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。
表面活性剂处理
较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。
此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。
b、细胞器的分离
制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器
上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于
制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传
学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益
增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之
一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA 几乎全部集中在细胞核内。RNA 则大
部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时，
预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。以肝细胞为例整理如表
表1 蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况
细胞器名称 主要蛋白质及酶类 核酸类
细胞核 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 RNA占总量10%左右
DNA 几乎全部
粒线体 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、
脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等
RNA 占总量5%左右DNA 微量
内质网（微粒体） 蛋白质合成酶系、羟化酶系 RNA占总量50%左右
溶酶体 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、
组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）
高尔基氏体 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶
细胞膜 载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP 酶、
环化腺苷酶、5’-核苷酸酶、琥珀酸
脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等
细胞液 嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、
可溶性蛋白类
RNA（主要为tRNA）占总量
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细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利
用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分
离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚
集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡
萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。
水溶液提取：
大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。
稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。
盐溶液提取：
以盐溶液及缓冲液提取蛋白质进常注意下面几个因素。
􀂾 盐浓度
等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。
0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠
液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也
常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如
脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶液
中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及
PH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采
用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。
􀂾 PH 值：
蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等
电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋
白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C 属碱性蛋白质，常用稀酸提取，
肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分
物质结合常以离子键形式存在，选择PH3～6 范围对于分离提取是有利的。
􀂾 温度：
多数酶的提取温度在5℃以下。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适
当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及
许多多肽激素类，选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。
此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。
􀂾 有机溶剂提取：
有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或
分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的
有机溶剂提取。从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含多量脂
质物质中提取蛋白质时，采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变
性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水
之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再
结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及温度选择范围较
广（pH3～10，温度-2℃至40℃）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。
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丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又
能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面
可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。
􀂾 表面活性剂的利用：
对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷
基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐
等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton
X-114、吐温60 及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起
酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两
者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋
白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。
􀂾 对提取物的保护：
在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。
前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水解
酶的最适PH 在3～5 或更高些，因在较低PH 条件下可降低蛋白质水解酶引起
的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状态，
不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨酸为活
性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。提取溶液
中加有机溶剂时也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很大，上述条件
均视具体对象而变化。
有一些蛋白含巯基，这些巯基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带入
金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA，后者可加入还原
剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护，
不要使酸基丢失。
四、蛋白质的分离纯化
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋
白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般
总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以
后操作。常用有机溶剂提取除去。
对于异类物质，提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶水解，有机溶
剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。小分子物质常在整个制备过程中通过多次液相与固相
转化中被分离或最后用透析法除去。而对同类物质如酶与杂蛋白、RNA、DNA 以及不同结
构的蛋白质、酶、核酸之间产分离，情况则复杂得多。主要采用的方法有盐析法、有机溶剂
沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。其中盐析法、
等电点法及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多，有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多，柱层
析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛。如前所述，蛋白质的分离纯化较难，
而且其本身的性质又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微细特征，巧妙的联用各
种方法并进行严密的操作，同时有必要了解精制各过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋
白质可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。其他蛋白质可
用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度。如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。
可见对确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。根据经验即或纯净的标准品，有极微量的不纯
物时，也会给实验带来较大的影响。不稳定的蛋白质，如分离SH-酶时使用试剂及缓冲液等，
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要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与
低分子化合物不同，必须经过独特的繁琐操作。
蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。诸如分子形状、分
子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。
蛋白质提取液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）外，还含有其它蛋白质、多糖、脂类、
核酸及肽类等杂质。除去的方法有：
1）核酸沉淀法
该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。必要时也可用脱氧核糖核酸
酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量DNase,于4℃保温30～60min，可使DNA 降解为足够
小的碎片，以致不影响以后的纯化。
2）醋酸铅沉淀法
利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质）缓缓变性
而失去活性，所以用这类试剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂脱离接触。
3）调pH 值或加热沉淀法
利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度系数差异，可
在一定的PH 下将蛋白提取液加热到一定的温度，使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。
4）选择性变性法
利用各种蛋白质稳定性的不同，可用选择性变性法来除去杂蛋白。例如胰蛋白酶及细胞
色素C 等少数特别稳定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸处理，此时其它杂蛋白均变性而沉淀，
而胰蛋白酶和细胞色素C 则仍留在溶液中。
小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后用透析法除
1、利用溶解度不同的纯化方法
原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。
至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白
质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加（盐溶，与离子强
度10～1 间成比例增加）。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降
并先后析出（盐析）（离子强度I2～10）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基
团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，
使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷
大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在
一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。盐析时蛋白质的溶解度与溶液
中离子强度的关系，可用下式表示：
1g-----=-ks×l
式中S0 为蛋白质在纯水（离子强度I=0）中的溶解度，S 为蛋白质在溶液的离子强度为I 时
的溶解度，KS 为盐析常数。离子强度可用下式计算。： 1
I=---∑miZi2
式中mi 为溶液中各种离子摩尔浓度，Zi 为各种离子的价数。①式中当温度一定时，S0 对于
某一蛋白质在某溶液中的溶解度是一常数，故（1）式也改定为：
lgS=β-ks×I
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式中β=lgS0，也为一常数，β值主要取决于蛋白质性质，其次与溶液的PH 和温度有关。
ks 值主要和盐的性质（包括盐离子价数和平均半径）有关，也与蛋白质结构有关。一般来
说，蛋白质在某一盐液中ks 愈大，盐析效果愈好。蛋白质是具有许多亲水基团的偶极离子，
常需用要较高的I 值才能从溶液中析出。根据（3）式分离纯化蛋白质，可在一定的PH 和
温度下改变盐的I 值，称为“ks 分段盐析法”，提纯前期常应用此法；也可在一定I 值下改
变PH 及温度，称为“β分段盐析法”，常用于提纯后期，特别是使某些蛋白质结晶析出时。
盐的选择：
如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取
决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白质的溶解度。控制方法最常
用的是加入中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁 、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广
的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱满和溶解度为4.1mol,即767g/l;0
℃时饱满和溶解度为3.9mol,即676g/l）。在这一溶解度范围内，许多蛋白质均可盐析出来，
且硫酸铵价廉易得，分段效果较其它盐好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时对蛋白氮的
测定有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效
果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以下溶解度太低。其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫
酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸铵，
但在不同温度下它的溶解度变化不大，这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。
硫酸铵浓溶液的PH 常在4.5～5.5 之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH 值往往降至
4.5 以下,当用其他PH 值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.
硫酸铵饱和度计算及加入方式
在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度为100%。用硫酸铵盐
析时其溶液饱和度调整方法有3 种。一种是当蛋白质溶液体积不大所需调整的浓度不高时，
加入饱和硫酸铵溶液。配制法是加入过量的硫酸铵，热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去
沉淀，再生0℃或25℃下平衡1～2 天，有固体析出时即达100%饱和度。盐析所需饱和度
可按下式计算：
V=V0--------------
式中V 及V0 分别代表所需饱和硫酸铵溶液及原溶液体积，S2 和S1 分别代表所需达到的和
原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，
但这由体积改变所造成的误差一般小于2%，可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而
溶液的体积又不再过分增大时，可直接加固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：
G（S2 - S1）
X = ----------------
式中X 是将1I 饱和度为S1 的溶液提高到饱和度为S2 时所需硫酸铵的重量（g），G 及A 为
常数，与温度有关。G 在0℃时为707，20℃时为756，A 在0℃时为0.27，20℃时为0.29。
在室温及0℃时所需硫酸铵饱和度可查表。第3 种调整饱和度的方法是将盐析的样品液装于
透析袋内对饱和硫酸铵进行透析，此法浓度变化较连续，不会出现盐的局部过高现象，但盐
析时测定盐的饱和度手续较繁，运用较少。
确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法
将少量样品冷却到0～5℃，然后搅拌加入固体硫酸铵粉末，见蛋白质产生沉淀时，离心除
去沉淀，分析上清液确定所要蛋白质的浓度，如它仍在溶液中则弃去沉淀，再加更多的硫酸
铵于上清液中，直到产生蛋白质沉淀时止。以所要提取的蛋白质在溶液中的浓度对硫酸铵浓
- 111 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation
度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一
些，使纯度高一些。
盐析时注意的几个问题：
盐的饱和度 不同蛋白质盐析时要求盐的饱和度不同。分离几个混合组成的蛋白质时，
盐的饱和度常由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增
加盐的饱和度，使第2 种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质饱和度达20%
时，纤维蛋白原首先析出；饱和增至28～33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至33～50%
时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上时清蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，
可从牛胰酸性提取液中分离得到9 种以上蛋白质及酶。
pH 值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况外，pH 值
常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的pH 值低于7，
如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液中进行。
蛋白质浓度 在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。
如血清球蛋白的浓度从0.5%增至3.0%时,需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至
24%.某一蛋白质欲进行两次盐析时,第1 次由于浓度较稀,盐析分段范围较宽,第2 次则逐渐变
窄.例如胆碱酯酶用硫酸铵盐析进时，第1 次硫酸铵饱和度为35%至60%,第2 次为40%至60%.
蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉作用.因此,必须选择适
当浓度尽可能避免共沉作用的干扰。
由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行。至于某些对热特
别敏感的酶，则宜维持低温条件。通常蛋白质盐析时对温度要求不太严格。但在中性盐中结
晶纯化时，温度影响则比较明显。
蛋白质用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能获得纯品。脱盐方法最常用的是透析法。透
析法所需时间较长，常在低温下进行并加入防腐剂避免微生物污染。透析使用前必须处理，
方法是将透析袋置于0.5mol/LEDTA 溶液中煮0.5h,弃去溶液,用蒸镏水洗净,置50%甘油中保
存备用。也可用分子筛层析，常用SephadexG-25 柱层析法，上样不要超过床体积的20%。
此外，有些金属离子能和蛋白质形成较为专一的结合而使蛋白质沉淀。这虽不是典型的
盐析，但在制备蛋白质中有许多成功的例子。锌离子在特定pH 下与胰岛素结合形成沉淀就
是这种例子。
蛋白质从悬浮液中沉淀出来的速度极慢，必须用强力离心来促进这个过程。
2、有机溶剂分离纯化法
有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度
降低。有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析
出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混
合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过
大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水
或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操作时的pH 值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点
附近。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。一般
在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol 左右,过多不仅耗费有机溶剂,而且可能导致
沉淀不好.沉淀的条件一经确定,就必须严格控制,才能得到重复性结果.有机溶剂浓度通常以
有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示.故操作条件比盐析法严格。
许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后则分成两
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相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。某些第3 组分的存在可以改变两相的比例和组成。
有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有
不同的分配系数。根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。因要求实验室温度恒定且
操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白
质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶
解度小且易变性。
疏水层析是近年发展的新方法。它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载
体在高盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱
而纯化。此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。
利用分子形状和大小不同的分离方法
蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。蛋白质的分子量从6000
左右开始，有各种大小，大的可以大到几百万。利用这些差别，有几种方法可用来分离蛋白
凝胶层析：
属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，
混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间
多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶
及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内
加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大
小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗 粒间的空
隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出
柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在
分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。
凝胶过滤是分子筛的一种，在介绍凝胶过滤法之前，首先介绍分子筛的由来。
McBain(1928)提出了分子筛的概念。后来发现这一现象在许多地方都存在。Synge 与Tiselins
（1950）在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。此后发现在柱层析中也
有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。至1959
年Porath 与Flodim 找到部分水解的葡聚糖凝胶将其交联，得到了商品名为交联葡聚糖
（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采
Lathe 与Ruthven(1956)曾利用分子筛效应测定过分子大小与分子量。Flodin 与Granath（1961）
发现不同分子量的葡聚糖级分，其凝胶过滤行为与分子量大小有关。Andrew（1962）发现
蛋白质中也有类似的性质.此后经过不少人的实际应用，完善了这一方法，形成一个可靠的
测定高分子分子量的方法。
凝胶层析是60 年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。由于设备简单、操作
方便和不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，所以目前它已被生物化学、
分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。
与沉淀蛋白质或酶原理相同，结晶的溶液PH 值一般选择在被结晶的蛋白质或酶的等电
点附近，以利于晶体的析出。
除少数情况外，通常选择低温条件进行。低温条件对蛋白质和酶不仅溶解度低且不易变
性。在中性盐溶液中结晶时，温度可在0℃至室温范围内选择，在有机溶剂中结晶一般要求
温度较低。
- 113 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation
不易结晶蛋白质和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶结晶可导致大量结晶的形
成。有时用玻璃轻轻摩擦容器壁也可达到此目的。需加晶种才能形成结晶的蛋白质或酶，大
多数结晶收率都不高。
金属离子：
有些蛋白质和酶结晶时还需加入金属离子，如铁蛋白在硫酸铵溶液中结晶时，加入少量镉离
子才形成菱状结晶，烯醇化酶也常加入汞盐后形成结晶。
结晶时间：
在结晶条件比较适合的情况下，在几小时甚至几分名即可获得结晶。但有些情况需数天
甚至数月才能结晶完全，视各种蛋白质和酶的具体情况不同而定。蛋白质和酶的结晶大多数
是针状、棒状、片状，有的为八面体或立方体的菱状结晶。结晶的大小与结晶时间及条件有
干燥是将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水分（或溶剂）蒸发除去的过程。根据水分
在固体中分布情况可分为表面水分、毛细管水分和被膜所包围的水分3 种。表面水分附着于
固体表面，蒸发时完全暴露于外界空气中，干燥最快、最均匀。毛细管水分存在于固体极细
孔隙的毛细管中，水分子逸出比较困难，蒸发时慢并需较高温度。膜包围的水分如细胞中被
细胞质膜所包围的水分，需经缓慢扩散至膜外才能蒸发最难除去。被干燥的物质其湿度与周
围空气的湿度是一个动态平衡关系，暴露于大气中的物质是不会绝对干燥的。若使被干燥的
物质所含水分低于周围空气中水分，则必须放在严密封盖的容器中进行干燥。用这种方法可
得到含水量极低的干燥样品，生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止变质易于保存和
运输，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥，某些无活性核酸、微生物酶
制剂和酪蛋白等工业产品则较多地应用喷雾干燥、气流干燥等直接干燥法。
在相同温度下，被干燥物质所含水分或溶剂由于周围空气压力的降低蒸发速度增加。真
空度愈高，溶剂沸点愈低，蒸发愈快。其原理与真空浓缩（或称减压浓缩）相同。真空干燥
适用于不耐高温、易氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器、及真空泵3
部分。干燥器顶部连接一带活塞的管道接通冷凝器，气化后的蒸气由此管道通过冷凝管凝聚，
冷凝器另一端连接真空泵，干燥器内常放一些干燥剂如五氧化二磷、无水氯化钙等，以便干
燥保存样品。
冷冻真空干燥
冷冻真空干燥除利用真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同的压力下，水蒸气
压随温度的下降而下降。在低温下低压下冰很容易升华为气体。操作时通常将等干燥的液体
冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。干燥后的产品具
有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。样品干燥时
先在培养皿内铺成薄层（厚度不超过1cm 的液体），置于低温冰箱内冻固。另在真空干燥器
内用两个培养皿分别放置固体氢氧化钠和五氧化二磷，真空干燥上端抽气通过五氧化二磷干
燥管与真空泵相连。当放进等待干燥的冻块后，立即封闭干燥器，开动真空泵，红5～10h
后得冷冻干燥品。也可将待干燥物质置于圆底容器中，然后浸入干冰-乙醇混合而成的冷却
剂中，容器内液体迅速冻成固体，抽真空后等干燥冻块的水分子升华变成气体，经过冷凝器
凝结为霜。冰冻的样品逐渐失去水分变成疏松的干燥粉末。上述操作关键在于真空泵的高真
空度及管道的口径要合适。
喷雾干燥是将液体通过喷洒装置喷成雾滴后，与干燥介质（通常为热空气）直接接触干
- 114 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation
燥的方法。由于液体分散为雾滴时，直径通常只有1～200μm 大小，与热空气接触面大，
水分蒸发很快。在100℃的热空气中只需不到1 秒的时间即可干燥。因干燥时间短和水分蒸
发时吸收热量，使液滴及其附近的空气温度较低，故工业上常用。
样品贮藏保存：
保存方法和生物大分子稳定性有很大关系，生物大分子的贮藏保存可分为干态和液态贮
藏两种。但不论是干态或液态贮藏均应避免长期暴露于空气中防止微生物的污染。温度对生
物大分子的稳定性影响很大，低温保存在大多数情况下是有利的。
干态贮藏：
干燥的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，要低温情况下物质大分子活性可在数月
甚至数年无显著变化。贮藏方法也很简单，只将干燥后的样品置于干燥容器内（内装有干燥
剂）密封，保存于0～4℃冰箱中即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染，
可先将样品分装于许多小瓶中，每次用时只取出1 瓶。
液态贮藏的优点是使样品免去干燥这一步骤，生物大分子的生理活性和结构破坏较少；
缺点是需要较严格的防腐措施，贮藏时间不能太长，如样品量大时封装运输不方便，实验室
常采取少量安瓿封存法。液态贮藏注意事项如下：
样品不能太稀，必须浓缩至一定浓度后才能封装贮藏，样品太稀时易引起生物大分子变性作
一般需加入防腐剂和稳定剂，常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和
酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外
钙、锌、硼酸等盐溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸
与氯化钠的标准缓冲液中。
贮藏温度要求较低，大多数在0℃左右冰箱保存即可，有的则要求更低温度，但注意某
些具有活性的大分子如DNA 溶液低温保存时，不宜使溶液结冰以免其分子结构被破坏。另
有文献报道某些蛋白质和酶在低温中反而引起变性。故应分加情况对待，不能一概而论。
总之，生物大分子的贮藏和保存，温度和水分是影响稳定性的两个主要因素。其次，各种稳
定剂的应用是否适当关系也很大。实际应用时应全面加以考虑。
蛋白质纯度
蛋白质提纯以后需要有指标来说明它的纯度，从原则上看有许多制备纯化蛋白质的方法
是可以将它们改成分析方法的，如各种分析的电泳、微量凝胶过滤法、各种层析、结晶出现、
生物活力及免疫分析等。用一种方法一个条件来分析蛋白质的纯度是不够的。由于蛋白质数
量多，性质相似者在所难免，一个条件下两个蛋白质不能分开的可能性是很大的，一般均希
望用两种以上的方法来分析蛋白质的纯度。只有一种检定方法时应该用两种以上条件来鉴
定。对蛋白质纯度的要求因工作需要而异，生物制品考虑制品体内的副作用，物理化学研究
要求不干扰对象的物化性质，化学结构分析要示杂质含量低于分析方法的灵敏度等等均要作
具体分析。
确定蛋白质（或多肽）样品的纯度标准大致如下。即分子大小是否均一，电荷 是否均
一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N 末端和C 末端残基，进一步纯化时生
物活性是否再有提高及能否结晶等，从N 末端测顺序一般在4 步以上。如果都是单一的氨
基酸残基，则含杂质可能为十六万分之一。
上述几条是较严格的要求，很难全都达到。通常以电泳时呈现一条带以及末端残基鉴定
是单一的即可进行顺序测定。
随着分析技术水平的不断提高，经常还将一种曾认为是纯的蛋白质分离成几个组分，即
出现微不均一性（Microheterogeneity）的现象。这种不均一性可分为两类情况。一类是在蛋
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白质肽链合成后在加工中产生的，如糖蛋白由于含糖量不同，它们的电泳行为常表现很大差
异，又如赖氨酸的甲基化，丝氨酸的磷酰化以及磺酰化等，也会产生电泳行为的不均一性；
还有一些则是在分离纯化过程中人为产生的，如脱酰氨等，这种不均一性对蛋白质顺序分析
不会带来太大的困难。另一类不均一性是由于基因家族产生的，它们之间的不同表现为个别
氨基酸的替换、N 端或C 端肽段的缺失等，这种不均一性会给蛋白质分析带来很大困难。
但蛋白质分子的一部分分子的一个侧链酰基变成了羧基，糖蛋白的配基相差一个单糖，这种
情况下蛋白质化学结构仍是单元一蛋白质，生物功能也无任何影响。此外还有同功蛋白质
（Isoprotein），它的功能相同但化学结构不同，从功能上看纯了从结构上看不纯。因此，纯
度属相对的概念，具体情况要多做具体分析，切不可简单化。 有点难，就是光蛋白提取，其他的多糖核酸不下来。关注中。。。。 如果不要求活性，提取总蛋白最好方法就是用trizol，至于protocol你在网上下一个trizol说明书就好！Good luck！ 细胞离心后加裂解液TBSN buffer 并加入蛋白酶抑制剂，超声，离心取上清。 根据你的材料和实验目的来设计的，查找相应的文献，肯定能找到做同样目的的方法，谷歌也行，我刚随便搜几个关键词就一堆，如果实验室有钱的话，用试剂盒就更方便了
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