PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究--《华中农业大学》2012年硕士论文
PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究
【摘要】：水牛是南方的重要品种资源,具有较强抗病抗逆耐粗的能力,而且水牛奶具有高蛋白高乳脂率的特征,将是南方鲜奶和高端奶的重要来源。我国政府大力支持在南方养殖奶水牛,然而水牛的繁殖性能较低,是水牛业发展的瓶颈问题。抑制素(Inhibin, INH)、卵泡抑素(Follistatin, FST)对促卵泡素(Follicle-stimulating hormone, FSH)具有反馈调控作用,从而在一定程度上影响卵巢功能及卵泡发育。目前已开展了许多有关INH或FST单个基因免疫和提高动物繁殖力的研究,并取得了较好的效果；利用转基因和RNAi技术同时抑制INH和FST表达是否可以调控水牛卵巢功能和卵泡发育及提高繁殖性能,以及提高FSHβ表达水平对生殖生理和繁殖性能的影响,这方面报道还不多。PiggyBac转座子(PB)是一种DNA转座子,已作为基因转移和插入诱变等基因研究的有效工具,广泛应用于哺乳动物基因功能和转基因的研究。本研究利用PB转座系统,构建了同时干扰INHA和FST的双干扰载体,在细胞水平分析表达和干扰效率、筛选稳定整合的阳性细胞；构建含有水牛卵巢特异性启动子的FSHβ表达载体,分析其特异表达特性和表达效率。为水牛基因功能、卵巢功能和卵泡发育调控机理及转基因技术打下基础。
本研究的主要结果如下：
(1)针对INHA和FST基因序列设计RNAi干扰片段,构建了含有两个转录元件的双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2。
(2)比较分析了双干扰载体的瞬时转染和与PB转座酶共转染的转染效率。分别利用瞬时转染和共转染方法转染水牛卵巢颗粒细胞(Buffalo fetal fibroblast cells, BuGCs)和水牛胎儿成纤维细胞(Buffalo fetal fibroblast cells, BuFFs),分别统计转染第24h、48h和72h时载体中绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中绿色荧光表达量。在转染24h时瞬时转染的细胞转染率高于共转染,而在其它时间共转染的转染效率均高于瞬时转染。
(3)证明了双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2对INHA和FST基因具有一定的抑制效果。通过Q-PCR检测,细胞内INHA和FST的mRNA的表达均因RNAi而有所减少,其中INHA在共转染BuGCs时被干扰程度最大(37.37%),其表达量显著地低于空白对照组；在瞬时转染黄牛卵巢颗粒细胞(Bovine granulosa cells, BGCs)中FST干扰率为3.55%。
(4)筛选出了INHA和FST基因RNAi片段稳定整合到基因组的阳性细胞。经G418筛选转染细胞,观察荧光表达情况,转染第7天后BuGCs和BuFFs荧光表达基本稳定,并且通过PCR鉴定转染后细胞基因组含有PB转座子的序列。
(5)构建了分别含卵巢特异性启动子CYP19、OSP-1(广西大学惠赠)的pB-CYP19和pB-OSP1表达载体；
(6)构建了水牛FSHβ全长cDNA的卵巢特异表达的pB-CYP19-FSHβ和pB-OSP1-FSHβ载体；
(7)证明了两个表达载体具有卵巢特异表达的特性,pB-OSP1-FSHβ载体超表达效率较高。将两个载体分别转染BuGCs和BuFFs,利用RT-PCR技术检测出了BuGCs的FSHβ表达,而在BuFFs中却没有表达,证明了这两个载体具有水牛卵巢特异表达特性：而且pB-OSP1-FSHβ载体的FSHβ表达效率(13.04%)高于PB-CYP19-FSHβ载体(1.2%),故pB-OSP1-FSHβ载体可用于水牛卵泡发育等繁殖调控的研究；同时也证明OSP-1是水牛卵巢特异表达的有效启动子。
【关键词】：
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：S823.83【目录】：
摘要8-10ABSTRACT10-12缩略词表(Abbreviation)12-131 文献综述13-28 1.1 抑制素及其功能研究13-14
1.1.1 抑制素结构13
1.1.2 抑制素功能13-14 1.2 卵泡抑素及其功能14
1.2.1 卵泡抑素的结构14
1.2.2 卵泡抑素的功能14 1.3 促卵泡素及其应用14-16
1.3.1 促卵泡素的结构14-15
1.3.2 促卵泡素的功能及其应用15-16 1.4 转座子的研究进展16-21
1.4.1 LINE-1(L1元件)16-17
1.4.2 Tol2转座子17
1.4.3 SB转座子17-18
1.4.4 PB转座子18-21 1.5 RNA干扰及其应用21-24
1.5.1 RNAi的分子机理21
1.5.2 RNAi的特征21-22
1.5.3 RNAi技术的应用22-24 1.6 原核生物及真核生物启动子24-28
1.6.1 真核生物启动子分类25
1.6.2 哺乳动物组织特异性启动子25-26
1.6.3 卵巢组织特异性表达启动子26-282 研究目的与意义28-293 材料与方法29-47 3.1 试验材料29-34
3.1.1 细胞与样品29
3.1.2 载体与菌株29-32
3.1.3 主要试剂与试剂盒32-33
3.1.4 主要仪器设备33-34
3.1.5 分子生物学分析工具34 3.2 实验方法34-47
3.2.1 双干扰载体的构建34-38
3.2.2 FSHβ表达载体的构建38-41
3.2.3 黄牛和水牛卵巢颗粒细胞的制备与培养41-42
3.2.4 水牛胎儿成纤维细胞的培养42
3.2.5 G418对颗粒细胞最低致死浓度的筛选42
3.2.6 脂质体法优化PB载体瞬时转染颗粒细胞的条件42-43
3.2.7 优化PB载体与转座酶共转染颗粒细胞的条件43-44
3.2.8 以最优条件对颗粒细胞进行转染44-45
3.2.9 转染后颗粒细胞总RNA提取及检测45
3.2.10 RT-PCR合成第一链cDNA45
3.2.11 INHA、FST和FSHβ基因相对表达量分析45
3.2.12 转座子插入基因组的检测45-474 结果与分析47-60 4.1 双干扰载体的构建及鉴定47-49
4.1.1 克隆载体pEASY-U6的构建及鉴定47
4.1.2 中间载体pB-H1-U6的构建及鉴定47-48
4.1.3 干扰载体pB-H1-RNAil-U6-RNAi2的构建及鉴定48-49 4.2 FSHp卵巢特异表达载体的构建及鉴定49-51
4.2.1 中间载体pBCYP19/pBOSP1的构建及鉴定49-50
4.2.2 pBCYPl9-FSHβ/pBOSP1-FSHβ载体的构建及鉴定50-51 4.3 G418对BuGC最低致死浓度的筛选51 4.4 干扰载体转染技术的优化及其表达效果的分析51-55
4.4.1 瞬时转染BuGCs和BGCs的条件优化51-52
4.4.2 与PB酶共转染BuGCs的条件优化52-53
4.4.3 双干扰载体瞬时转染BuGCs和BGCs53-54
4.4.4 双干扰载体与PB转座酶共转染BuGCs、BGCs和BuFFs54-55
4.4.5 双干扰载体在BuGCs共转染中高效表达55 4.5 水牛FSHβ表达载体转染技术优化及其表达效果的分析55-56
4.5.1 表达载体瞬时转染BuGCs的条件优化55
4.5.2 表达载体瞬时转染BuGCs和BuFFs55-56 4.6 双干扰载体的干扰效果、特异表达载体的表达特征的分析56-59
4.6.1 RNA提取的鉴定56
4.6.2 定量引物PCR检测56-57
4.6.3 BuGCs和BGCs中INHA相对表达量57
4.6.4 BuGCs和BGCs中FST相对表达量57-58
4.6.5 BuGCs中FSHβ相对表达量58-59 4.7 利用双干扰载体整合到基因组的阳性细胞的筛选和鉴定59-605 讨论60-64 5.1 细胞中RNAi干扰的探讨60-61 5.2 卵巢特异性启动子的探讨61-62 5.3 PB转座子在细胞中转染效果的探讨62-63 5.4 脂质体介导转染细胞的探讨63-646 总结64-65 6.1 小结64 6.2 特色创新64 6.3 进一步研究内容64-65参考文献65-74硕士期间发表的文章或申请专利74-75致谢75
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转座子在转基因动物中的应用
日期： 作者： 来源：《畜牧兽医科技信息》.-2007,(7).-18-19 点击：
1.1& DNA& DNADNA—DNADNADNADNA(autonomous element)(nonautonomous element)AcDsc(Activator)Ds(Dissociation)AcDs
1.2 & &DNA—RNA—DNADNA(1ong terminal repeat sequenceLTR)LTRLTR(endogenous retrovirusesERV)LTR(1ong interspersed nuclear elementsLINEs)short interspersed nuclear elementsSINEs)(processed retropseudogene)
&&& ——DNADNADNADNA
3.1 &P& PPP29kb31bp(IRT)()P
3.2 &Minos& MinosD.hydeiMinos1.4bp100bp(IRT)1MinosGO1-3%Ancpheles stephensiiDVirilis
3.3 &Mosl(mariner) &Mosl(mariner)DMauritiana28bp(IRT)TAMinos
3.4 &hobo &PHoboHoboHermer(Musca domestic)Homer(Bactrocera tryoni)hopper(B.dorsalis)He~nerHermer2739bp17bp(IRT)Hermerhsp70A e.aegytiTribolium castaneumStomoxyscalcitransCulex quinquefasciatusCeratitis capitata
3.5 &piggyBac& piggyBacDNA(Baeulovirus)TriehoplusianiTN368
&&& 1998CarypiggyBacBombyxpink bollwormDrosophila melanogasterMediterranean fruiftly
4.1 && piggyBacpiggyBac3
4.2& & .0%-20%(100%)marinerTc1Tc31998Fadoolmariner
4.3 && Roslinmariner
&&& 1998SangD.mauritianamarinerMosl lMoslpMosl()12DNAPCRMosl1Mos127%(1244)mariner20(1%)79%(2329)MoslG1Mosl29%(2793)10G1MoslMos1marinerTAMoslG2mariner50%marinerG1G2marinermarinerD.melanogaster0.11%marinerTetRmarinermariner
&&& Nariner
4.4 && PB(PiggyBac)(Transposon)PB20057cellPB(PiggyBac)
&&& DNApiggyBacpiggyBacTTAApiggyBacpiggyBac
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piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探
摘　要：为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法，以家蚕核型多角体病毒（BmNPV）极早期蛋白基因（ie-1）启动子元件驱动新霉素抗性基因（neo＇），并克隆至具有绿色荧光蛋白基因（gfp）标记的昆虫转座子载体piggyBac中，构建转基因载体pigA3-IE—Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞，用终浓度800μg／mL的遗传霉素（geneticin，G418）筛选3个月，获得了稳定转化的细胞，呈现绿色荧光的细胞数达80％以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neo基因和gfp基因的存在。编辑干细胞基因，唤醒人类自愈能力 | 科学人 | 果壳网 科技有意思
编辑干细胞基因，唤醒人类自愈能力
编辑人类基因序列，从而修正干细胞中的基因突变——这种方法结合了干细胞治疗和基因修正。现在科学家在这方面取得了进展。
10月12日发表于《自然》的这项研究中，科学家第一次结合基因编辑技术，对病人自身诱导干细胞（induced stem cell）的基因突变进行修正，修正了一个代谢性肝病患者细胞中的基因突变。这一进展开辟了一条新的道路：重新调整人自身的细胞，治愈遗传病，而不是靠器官移植或药物治疗。
胚胎干细胞和诱导多功能干细胞(iPS cells) 能转化为任意种类的细胞，它们有潜力转化成需要的细胞，治愈病症。不过，它们也可能发生有害的变异。首先，诱导多功能干细胞也和主人的其它细胞一样，有相同的基因缺陷，所以在利用它们时先要去除这些缺陷。可是，移除可能做不到很精确；现有的基因编辑方法可能产生癌症或其它不良副作用。最近的基因编辑方法进展还不能用于干细胞。
要利用干细胞治疗疾病，必须先非常小心地利用基因编辑方法去除干细胞中不正确的基因序列，然后用正确的序列代替。这是研究人员现在正在做的事情。
英国桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）和剑桥大学的研究者致力于研究一种基因突变，这个基因负责编码肝脏中的一种特定蛋白质。这是个常见的突变，在欧洲血统人里每2000人中就有1个人具有；同时这种突变结构简单，仅有一个基因转位。
研究小组取了患者的皮肤细胞，将其转变为诱导多功能干细胞。然后，利用锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs ）剪断基因突变位置的基因序列。剪断基因序列后，研究人员利用PiggyBac（PB）转座子剪切粘贴遗传信息。这样，人们就能修正基因的突变。
一旦修正了干细胞缺陷，研究团队随即将其诱导为肝脏细胞。它们被移植到肝功能失调的小鼠体内。研究人员说，这些细胞会修复肝脏功能。
刊物:popsci网站，日
图片来源:Wikimedia Commons
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同问，不会需要关机重启吧？引用狼风的回应：似乎已经接触到上帝的层面了...另，基因调整的话，是怎么影响到全身的，因为毕竟科学家"施工“的应该是极少数的细胞吧？还是说被调整的“正确的基因”会自动同步到身体DNA里（生物还给老师的人不知道意思表达清楚没有...）
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唤醒自愈能力……往极端的想，能不能开启干细胞无限更替将死的老化细胞的能力？永生？
机械工程硕士生，DIYer
召唤编辑、召唤细胞基因，唤醒人类自愈能力！
引用Metaverse的回应：唤醒自愈能力……往极端的想，能不能开启干细胞无限更替将死的老化细胞的能力？永生？额，其实我们都是被慢性毒死的吧。
也许会开启一个全新的时代。
这会动摇人类的伦理道德常识吗会不会人为制造出类似蜘蛛侠这样的情况
……如果干细胞能让我被人捅一百刀没死，而且过几天就好了，那么我是一个多么可怕的人呀……我会牺牲一百次一千次一万次，来反对房地产，反对炒股，反对一切泡沫浮云的东西……
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干细胞总被冠以恶名，源于它太过强大？
我第一个想法是啥时候可以打一针干细胞到牙床替换掉所有的坏牙，从此人类再无牙病之苦
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(C)2013果壳网&京ICP备号-2&京公网安备　　生物通报道& 在动物的性腺中，诸如转座子这样的基因组寄生物会对进化适应性（evolutionary fitness.）造成严重的威胁。由于它们能够跳跃于基因组中，往往会造成危险的突变。为了保护基因组的完整性，动物进化出了复杂的机制，即所谓的piRNA信号来沉默这些有害的转座子。目前对于这一分子过程，以及构成piRNA信号通路的因子知之不多。
来自奥地利科学院(&OAW)分子生物技术研究所（IMBA）的研究人员，现在鉴别出了大约50个基因，证实它们在黑腹果蝇piRNA信号通路中起重要的作用。这一研究成果发表在《分子细胞》（Molecular Cell ）杂志上。
基因组寄生物密集地填充着大约50%的人类基因组，其他动物、植物和真菌的DNA也是如此。这些自私的DNA元件许多都可以在宿主遗传物质中自由的移动。它们被称之为转座子，其移动可引起DNA断裂和突变，导致严重的基因组损害。
尽管它们是有害的，大多数的生物却并没有特异地从DNA中除去转座子。如此大规模的干预有可能给生殖细胞基因组和物种繁殖适应性带来极大的风险。为了应对这些潜在的危险，植物和动物都拥有相应的防御系统。在所有的情况下，均基于小RNA沉默机制，这些系统有可能能够回溯到真核生物进化的早期。古老的沉默系统能够选择性干扰转座子表达，防止它们造成损害。
在动物中，最显著的沉默信号通路就是piRNA信号通路。由PIWI蛋白结合22-30nt长的piRNAs构成的RNA诱导沉默复合体（RISC），在它的核心起作用。通过小RNA，PIWI复合物识别转座子RNAs，这诱导了转座子RNA降解，负反馈作用于宿主DNA上的编码位点，抑制转座子转录。
IMBA的开拓精神
piRNA是一个相对年轻的研究领域，全世界还只有少数这方面的专家。分子生物学家Julius Brennecke就是其中之一。7年来，这位IMBA研究小组的领导者一直在果蝇生殖腺中研究转座子控制机制。果蝇是分子遗传学家的一个重要遗传工具，piRNA生物学的许多方面都是率先在这一模式系统中进行探索。Brennecke在美国从事博士后研究期间就着迷于这一系统：“这是最古老的宿主―寄生物斗争之一，在分子和遗传水平上了解它真是令人着迷。”
当他来到IMBA后，他设法在奥地利建立了这一竞争激烈的领域。他的研究工作具有开拓性，因为目前对于这一古老的piRNA信号通路和潜在的机制仍知之甚少。“我们真的想详细地了解，果蝇是如何成功地抑制转座子的，”Brennecke说。
在他们近期的研究工作中，Brennecke和研究小组朝着解析piRNA信号通路迈出了重大的一步。组合利用遗传、分子和计算机方法，研究小组筛查了果蝇性腺中与piRNA信号通路相关的因子。总的说来，他们检测了7000个不同的基因，手动检测了大约60.000只果蝇寻找转座子沉默缺陷。
果蝇库成为知识的金矿
为了完成筛查，Brennecke和研究小组利用了维也纳果蝇RNAi中心（VDRC）库，这里收集了大约30.000种果蝇品系，使得能够在所需的细胞种类中沉默特异的基因。
在2年的研究工作中，Brennecke和研究小组发现了大约50个对于一个全功能piRNA信号通路至关重要的基因。Brennecke实验室的博士生、本研究的第一作者Dominik Handler解释说：“发现的许多基因，在人类基因组中都可以找到同源基因。因此我们的研究结果将对普遍了解这一转座子沉默系统产生广泛的影响。”其中一些基因是piRNAs生物合成的必要条件，而另一些则将防御系统与诸如线粒体代谢、RNA转运、转录等基本过程或染色质生物学联系到一起。
信号转导通路潜力巨大
Brennecke说，获得的研究结果为未来多个线路开展研究创造了条件。鉴别的这些因子将在了解这一信号通路机制框架中起重要作用，它们也是了解这一沉默系统纳入到卵子发生过程机制的唯一入口点。“piRNA信号通路的核心概念在生物体之间高度保守。毫无疑问，我们的研究结果将对了解基因组进化，甚至有可能对于人类医学产生深远的影响。”
（生物通：何嫱）
生物通推荐原文摘要：
The Genetic Makeup of the Drosophila piRNA Pathway
The piRNA (PIWI-interacting RNA) pathway is a small RNA silencing system that acts in animal gonads and protects the genome against the deleterious influence of transposons. A major bottleneck in the field is the lack of comprehensive knowledge of the factors and molecular processes that constitute this pathway. We conducted an RNAi screen in Drosophila and identified ∼50 genes that strongly impact the ovarian somatic piRNA pathway. Many identified genes fall into functional categories that indicate essential roles for mitochondrial metabolism, RNA export, the nuclear pore, transcription elongation, and chromatin regulation in the pathway. Follow-up studies on two factors demonstrate that components acting at distinct hierarchical levels of the pathway were identified. Finally, we define CG2183/Gasz as an essential primary piRNA biogenesis factor in somatic and germline cells. Based on the similarities between insect and vertebrate piRNA pathways, our results have far-reaching implications for the understanding of this conserved genome defense system.
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