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pET-28a(+)原核表达不出目的蛋白
大家好！我最近在做蛋白的原核表达，诱导表达的是跨膜蛋白，大小是57.4KDa，用的是pET-28a(+)载体，宿主菌是BL21(DE3)。之前用不同的诱导条件为37℃、28℃，及不同的IPTG量（IPTG终浓度为25μmol、50μmol、100μmol、500μmol、1000μmol），均未诱导出目的蛋白。后来，我尝试将LB培养基更换成TB培养基，SDS电泳检测时，仍没有诱导出目的蛋白。现在我也不知道是什么原因？是跨膜蛋白的表达不能用原核表达吗？还是什么原因？请大家帮个忙？感激不尽！！！
表达载体是否测序正确，序列是否有移码或者终止密码子，序列中是否有稀有密码子？
膜蛋白异源表达可能折叠构象不正确，形成包涵体的几率比较大。检查表达时跑的是全菌蛋白还是可溶蛋白？膜蛋白电泳的表观分子量与理论分子量可能会有较大出入，检查表达时用的是直接从胶上看，还是做了western？ : Originally posted by cicelyzh at
表达载体是否测序正确，序列是否有移码或者终止密码子，序列中是否有稀有密码子？
膜蛋白异源表达可能折叠构象不正确，形成包涵体的几率比较大。检查表达时跑的是全菌蛋白还是可溶蛋白？膜蛋白电泳的表观分子量与理 ... 表达载体序列是正确的，目的序列测序也是正确的，没有移码、终止子。我只是要求表达出目的蛋白，不需要蛋白有活性，就是说，在包涵体里也一样可以用。在检测时，粉碎细胞后，我同时检测了上清和沉淀，都没有检测到目的条带。而且，我在电泳时加的IPTG量设了梯度（共6组，0、25μmol、50μmol、100μmol、500μmol、1000μmol），电泳检测时得到的条带是一样的，应该可以排除表观分子量与理论分子量不符的问题。还有，我是直接从胶上看的，没有做Western。至于序列中有没有稀有密码子，我就不清楚了，应该是没有的吧？我是第一次做原核表达，出现这些问题也不知以原因，能否帮忙分析一下啊？谢谢! : Originally posted by 含羞草liu at
表达载体序列是正确的，目的序列测序也是正确的，没有移码、终止子。我只是要求表达出目的蛋白，不需要蛋白有活性，就是说，在包涵体里也一样可以用。在检测时，粉碎细胞后，我同时检测了上清和沉淀，都没有检测到 ... 是否有稀有密码子可以对比一下大肠杆菌密码子使用偏好。诱导时菌的OD是否控制了？诱导了多长时间？确定IPTG母液没有配错吗？ : Originally posted by cicelyzh at
是否有稀有密码子可以对比一下大肠杆菌密码子使用偏好。诱导时菌的OD是否控制了？诱导了多长时间？确定IPTG母液没有配错吗？... 已经比对了大在肠杆菌的密码子使用偏好，发现8个大肠杆菌的稀有密码子在我的目的序列里都出现了，我已经转化到Rossette感受态里了，不知道结果怎么样,Rossette感受态里只有6个稀有密码子，等诱导再看结果吧！谢谢你哦！ : Originally posted by 含羞草liu at
已经比对了大在肠杆菌的密码子使用偏好，发现8个大肠杆菌的稀有密码子在我的目的序列里都出现了，我已经转化到Rossette感受态里了，不知道结果怎么样,Rossette感受态里只有6个稀有密码子，等诱导再看结果吧！谢谢你 ... 不客气。实在不行只有换密码子了。祝好运。 : Originally posted by cicelyzh at
不客气。实在不行只有换密码子了。祝好运。... 你好！我转化到Rossette的感受态细胞里，加IPTG诱导仍未诱导出目的蛋白。这可能是因为另两个稀有密码子没有对应的tRNA吗？还是什么原因？我用的是pET-28a(+)载体，在目的序列的上游含有6*His Tag。目的蛋白是7次跨膜蛋白。对跨膜蛋白的表达需要注意哪些问题呢？有没有什么方法可以有效的表达跨膜蛋白呢？能否帮个忙，实验真的很急！感激不尽！！！ : Originally posted by 含羞草liu at
你好！我转化到Rossette的感受态细胞里，加IPTG诱导仍未诱导出目的蛋白。这可能是因为另两个稀有密码子没有对应的tRNA吗？还是什么原因？我用的是pET-28a(+)载体，在目的序列的上游含有6*His Tag。目的蛋白是7次跨 ... 你的情况可能需要优化密码子。尤其是做过表达，稀有密码子肯定会很大程度上限制表达量的。表达跨膜蛋白通常会在包涵体里。也就是说无活性形式。表达出活性形式的跨膜蛋白通常比可溶蛋白难，可以尝试带一些可溶标签增加其可溶性，诱导时减慢速度，不过是否能成功还是不好说的。 : Originally posted by cicelyzh at
你的情况可能需要优化密码子。尤其是做过表达，稀有密码子肯定会很大程度上限制表达量的。表达跨膜蛋白通常会在包涵体里。也就是说无活性形式。表达出活性形式的跨膜蛋白通常比可溶蛋白难，可以尝试带一些可溶标签 ... 我只要能表达出蛋白就行，不需要蛋白有活性，就是说，在包涵体里也是可以的。要怎么才能表达出来呢？怎么优化密码子呢？我之前没有表达过跨膜蛋白，所以不太明白，能否帮忙指点，谢谢了！ 我们实验室别人也出现过这种情况，rossete 也试过，也连过别的载体都不行，后来他们弄GST 诱导出来，不过GST好像后期比较麻烦，你再查查吧 IPTG的量不用这么高吧？终浓度为0.1mMol足够了，最多0.5mMol。 : Originally posted by 含羞草liu at
我只要能表达出蛋白就行，不需要蛋白有活性，就是说，在包涵体里也是可以的。要怎么才能表达出来呢？怎么优化密码子呢？我之前没有表达过跨膜蛋白，所以不太明白，能否帮忙指点，谢谢了！... 根据大肠杆菌密码子使用偏好，把稀有密码子替换成使用频率高的密码子。如果你只需要改变少数位点，可以用定点突变来实现。 : Originally posted by cicelyzh at
根据大肠杆菌密码子使用偏好，把稀有密码子替换成使用频率高的密码子。如果你只需要改变少数位点，可以用定点突变来实现。... 你好！我把载体换成pGEX-4T-3载体了（它含有GST标签），转到Rossette里IPTG诱导表达，仍没有表达出目的蛋白。我再次核对了目的序列里的稀有密码子，并对比Rossette提供的稀有密码子，共有10处三联密码子是没有相应tRNA的，这要怎么进行密码子替换呢？ : Originally posted by
我们实验室别人也出现过这种情况，rossete 也试过，也连过别的载体都不行，后来他们弄GST 诱导出来，不过GST好像后期比较麻烦，你再查查吧 你好！我也用含GST标签的载体pGEX-4T-3试过了，还是没有表达出目的蛋白。能否麻烦你帮我问问你们实验室的人具体是怎么诱导了来的？我试验很急，谢谢啊！ : Originally posted by cicelyzh at
你的情况可能需要优化密码子。尤其是做过表达，稀有密码子肯定会很大程度上限制表达量的。表达跨膜蛋白通常会在包涵体里。也就是说无活性形式。表达出活性形式的跨膜蛋白通常比可溶蛋白难，可以尝试带一些可溶标签 ... 请问如何优化密码子？有比较使用的手册或资料么？望赐教 : Originally posted by Allen206 at
请问如何优化密码子？有比较使用的手册或资料么？望赐教... 根据大肠杆菌密码子使用偏好和密码子的简并性，把稀有密码子替换成大肠杆菌常用的密码子。 : Originally posted by cicelyzh at
根据大肠杆菌密码子使用偏好和密码子的简并性，把稀有密码子替换成大肠杆菌常用的密码子。... 您指的是同一个氨基酸对应的不同密码子，把稀有的换成常用的，对应的还是同一个氨基酸，对么？ 可能是你的蛋白基因和你的宿主菌不相容，我们在做野生菌的基因导入工程菌也是这样的，不表达。可能要构建质粒，选择合适的启动子 : Originally posted by Allen206 at
您指的是同一个氨基酸对应的不同密码子，把稀有的换成常用的，对应的还是同一个氨基酸，对么？... 是的。 我也是在做一个gpcr蛋白，也是有七个跨膜区，最近一直没效果？不知道lz做出来没。
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新疆红肉苹果转录因子MSMYB10 基因的克隆, 序列分析及原核表达
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3秒自动关闭窗口什么方法确定插入目的片段后表达载体的阅读框有无发生变化？ - 分子生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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什么方法确定插入目的片段后表达载体的阅读框有无发生变化？
本人新手，用PGEX-6P-1表达一段基因，上游Sal 1酶切位点，下游Not 1酶切位点，请问一般是什么办法来看我插入目的片段后，重组载体的阅读框是否发生变化呢？是有专门的软件分析还是怎么办？一直被这个问题困扰。麻烦给出可以分析的软件或在线预测的网站，菜鸟不胜感激！
测序后对照载体眼睛看就行 先用一个比对软件比对下目的基因，如VECTOR NIT : Originally posted by bolysu at
先用一个比对软件比对下目的基因，如VECTOR NIT 我现在在设计引物，考虑到如果选的这两个酶切位点会引起目的基因读码框移位，我就直接在引物中目的基因前加1~2个碱基来确保读码框正确。所以现在正在纠结不知道该怎么判断读码框是否移位，求助！ 从RBS位点后第一个ATG开始三个三个数就是了 /view/aeec59eef8c7b4d6.html
从图谱上看，这个酶是会造成移码，而且2个酶靠得很近，切得切不开也是个问题，再一个后面那个酶是很贵的，10次将近500块钱 : Originally posted by bolysu at
/view/aeec59eef8c7b4d6.html
从图谱上看，这个酶是会造成移码，而且2个酶靠得很近，切得切不开也是个问题，再一个后面那个酶是很贵的，10次将近500块钱 唉，没办法，其他酶都用不了。我已学会判断方法，感谢您的指导，金币送上~~ : Originally posted by bolysu at
/view/aeec59eef8c7b4d6.html
从图谱上看，这个酶是会造成移码，而且2个酶靠得很近，切得切不开也是个问题，再一个后面那个酶是很贵的，10次将近500块钱 前辈,我不会看,能帮我看看吗?pet-28a,BamHI和HindIII. : Originally posted by well_想太多 at
前辈,我不会看,能帮我看看吗?pet-28a,BamHI和HindIII.... 不会移码，但是你的基因前面带了很长一段多肽，不知道对你的酶会不会有影响 : Originally posted by bolysu at
不会移码，但是你的基因前面带了很长一段多肽，不知道对你的酶会不会有影响... 请问前辈是怎么看的?不需要用到目的基因吗?我的酶切位点前面加了2-3个保护碱基:CG GGATCC CG& &BamHI
& && && && & CCC AAGCTT GGG& &HindIII
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HCV核心区基因片段（C70-140）的原核表达 化学化工毕业论文.doc22页
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学号 1XXXXXXXXXX 毕业设计论文 题目HCV核心区基因片段C70-140的原核表达 作
化学化工学院
摘要 在大肠杆菌中表达HCV核心区基因片段C70-140 构建一个pBVIL-70-140原核表达载体用于丙型肝炎核心抗原 HCV-cAg 和丙型肝炎抗体 HCV-Ab 联合检测PCR 产物经XhoI和XbaI双酶切后连接到经同样酶切的pBVIL原核表达载体中 转化大肠埃希氏菌BL21并以IPTG 诱导蛋白表达SDS-PAGE 鉴定结果表明将目的基因与表达载体pBVIL进行连接得原核表达载体pBVIL-70-140该载体转化大肠埃希氏菌BL21后可诱导表达出分子量约为25 KD的重组蛋白 关键词丙型肝炎病毒核心区基因片段 C70-140 原核表达 Abstract The objective is to express the recombinant HCV core gene fragment
in Escherichia coli and build a pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector for the hepatitis B core antigen
and hepatitis C antibodies
combined detection HCV core fragment was amplified by RT-PCR and the product was digested by XhoI and XbaI then the fragment was inserted into an Escherichia coli prokaryotic expression vector pBVILand used to transform E coli BL21 The target protein was expressed in BL21 and induced by IPTG and the expressed protein was indentified by SDS –PAGE We got the pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector by connecting the purpose gene and expression vector pBVIL the result showed that the pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector can induce the expression of the recombinant protein molecular weight of about 25KD through the transformation of Escherichia coli Key words HCV
Core gene fragment C70-140
Prokaryotic expression 目
中文摘要 Ⅰ
英文摘要 Ⅱ
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　　论文摘要：随着改革开放，...【论文关键词】 建筑工程　事前控制　事中控制　事后控制　质量控制
　　【论文摘...摘要：高校科研经费管理是高校财务管理的一项重要内容。在高校科研经费来源多元化且数...论文关键词：建筑施工　管理职责分配
　　论文摘 要： 随着我国不断深化建筑施工...摘要：随着社会经济的发展，人们对物质生活和精神娱乐的追求进一步提升，对国家行政事...