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实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项|
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你可能喜欢具有抗血小板聚集活性的重组组织型纤溶酶原激活物的双功能变异体的制作方法
专利名称具有抗血小板聚集活性的重组组织型纤溶酶原激活物的双功能变异体的制作方法
技术领域本发明主要涉及重组组织型纤溶酶原激活物和将其用于治疗血栓形成疾病的方法。
背景技术组织型纤溶酶原激活物(tPA)属于丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶家族，并且催化内源的血纤维蛋白溶解级联反应中的限速步骤，该反应将循环酶原纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。纤溶酶反过来通过水解三链连接杆区域中肽键裂解纤维蛋白。五个明显的结构域组成了有活性的人类tPA蛋白。人类tPA的DNA和氨基酸序列已经被Pennica等描述(Nature，，1983)。
tPA被合成为一条大约72kDa的单链多肽并且通过275-276残基处的蛋白水解切割转变成有活性的双链形式。该切割伴随着血纤维蛋白溶解活性的增加。双链形式的多肽由一条源自于具有完全催化活性的C末端(C)的33kDa的轻链和一条源自于没有催化活性的N末端的38kDa的重链组成。该分子N末端部分包含四个明显的结构域，包括一个类纤连蛋白的指形结构域(F)，一个表皮生长因子(EGF)同源区域，以及两个kringle结构(K1和K2)。C末端部分包含了已知的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域并且包括血纤维蛋白特异性丝氨酸蛋白酶活性的活性位点。tPA在血纤维蛋白溶解中的作用及其可能作为治疗血栓形成疾病的侯选治疗剂已经被研究了多年。尽管施用野生型人类tPA已经成为治疗急性心肌梗塞的标准方法，该病比世界上其它任何一种单一疾病的致死都高，但几种因素限制了它作为治疗剂的使用。
首先，tPA的活性在体内受到丝氨酸蛋白酶抑制剂1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的快速抑制。第二，该酶会被循环系统快速地清除，其半衰期非常短。第三，富血小板血栓具有抗tPA以及其他血纤维蛋白溶解剂的溶解作用。为了克服野生型tPA的一些这类限制因素和产生具有更好药理学曲线的tPA变异体，tPA的结构与功能之间关系的研究已经开展了多年。例如，结构域删除的研究显示kringle2(K2)或者F结构域与血纤维蛋白结合，从而通过tPA介导了血纤维蛋白溶酶原的血纤维蛋白依赖性活化。缺失和突变分析也证明了位于前三个结构域即F、EGF和K1的结构元件通过某些肝受体在识别中的作用。此外，已经显示纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)结合位点位于tPA轻链的296-304位残基处。因此，结合位点的突变可使该酶具有抗PAI-1的作用(Madison等，1989，Nature，339，721-724；美国专利号5,550,042；5,486,602)。
PAI-1是tPA和血液中其它纤溶酶原激活物的主要抑制剂。在正常的生理条件下，PAI-1限制了纤溶酶的产生并且用于维持血纤维蛋白的溶解作用的校验。在某些病理条件下，不受控制的纤溶酶产生能导致过多的血纤维蛋白降解并增加出血的风险。在治疗急性心肌梗塞的过程中，PAI-1是通过限制纤溶酶的产生来减少溶栓治疗有效性的关键破坏因子。
近来改进tPA作为溶栓剂的努力主要集中于置换和/或缺失一些被认为与tPA稳定性或它与抑制剂(例如PAI-1)的相互作用有关的模块。这些努力已经使某些以tPA为基础的治疗的发展达到顶峰。例如，TNK-tPA是一种tPA的衍生物，在该蛋白酶结构域的第296-299位氨基酸引入了四个丙氨酸的置换，因此使得该多肽对PAI-1的抑制不敏感(Paoni等，1993.Thromb Haemost.70，307-312；美国专利号5,246,850)。TNK-tPA进一步包含在某些位点去除糖基化的突变以增加它的半衰期。此外，一种N末端截短的tPA变异体，rPA06022，已经显示延长了该多肽的半衰期(Kohnert等，1992，ProteinEngineering 5，93-100)。尽管第二代tPA产品，例如TNK-tPA(TNKaseTM，替奈普酶(Tenecteplase))和rPA06022(Retavase?，瑞替普酶(reteplase))，已经克服了这里提出的一些问题，但这些产品，以及到目前为止所产生的许多其它的tPA变异体，均没有解决一个重要的问题富血小板血栓对溶解的抗性，一种经常发生于急性心肌梗塞(AMI)和其他急性冠状动脉综合症(ACS)的现象。
在富血小板血栓中，通过血纤维蛋白原/血纤维蛋白或者冯威勒布兰特因子(von Willebrand factor)与血小板膜受体——糖蛋白IIb/IIIa的结合，血小板形成聚集，其中糖蛋白IIb/IIIa是血小板中最丰富的细胞表面蛋白，其配体结合功能的阻断已经成为临床上用于预防血小板聚集和血栓症的方法之一。由此，某些天然蛋白，例如针对糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体、肽和一些小分子，已经被鉴定为能通过预防血纤维蛋白原/血纤维蛋白或者冯威勒布兰特因子与糖蛋白IIb/IIIa的结合来抑制血小板聚集。抑制剂中的一类包括源于蛇毒的去整联蛋白，它们属于一个包含(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)RGD基序的同源肽家族。这些肽对由许多不同的激活物来活化的粘着蛋白与血小板糖蛋白IIb/IIIa的结合过程具有很强的抑制作用(Ruoslahti E.和Pierschbacher M.D.，1987，Science，238，491-497)。
血纤维蛋白与血小板糖蛋白IIb/IIIa受体结合，接着是血小板介导的血块凝缩，造成局部区域的高血纤维蛋白浓度，这就限制了血纤维蛋白溶解蛋白例如tPA穿过血块的扩散。通过抑制肽使血纤维蛋白与整联蛋白受体解偶联，能够在模型系统中减少富血小板血纤维蛋白的数量并且加速富血小板血栓的溶解。临床证据进一步证实血纤维蛋白溶解剂当与abciximab(Reopro?)联合使用时能够更有效地恢复急性心肌梗塞中的冠状流动，其中abciximab(Reopro?)是一种能阻断血小板与血纤维蛋白原相互作用的抗糖蛋白IIb/IIIa的治疗性单克隆抗体。
另外，研究揭示血小板活化和随后的微脉管中的积聚与梗塞和脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)的产生有关，有时在对中风病人施用tPA时会导致这两种现象。动物模型的研究表明血小板受体糖蛋白IIb/IIIa抑制剂减少了tPA诱导的血栓栓塞性中风之后的脑出血的发生(Lapchak等，2002，Stroke，33，147-152)。
已经试图产生了整联蛋白特异的tPA。Smith等描述了使用蛋白质环来构建结合整联蛋白受体的tPA变异体，其中一个抗整联蛋白αIIbβ3的抗体的CDR3区被移入tPA的EGF结构域(Smith等，1995，J Biol.Chem.)。Yamada也试图通过在Kringle I结构域、Kringle II和蛋白酶结构域的连接区域或者在蛋白酶结构域插入RGD基序来构建与整联蛋白具有亲和性的tPA变异体(Yamada等，Bioth.m.，306-331)。依照Yamada所述，所有产生的tPA变异体(除了148RGD-tPA)在它的催化活性上或者在它与整联蛋白结合的能力上是有缺陷的。
根据以上所述，在该领域依然存在提供对治疗血栓形成疾病有用的方法和组合物的需要。
发明概述本发明的基础，部分地，在于具有对抑制的敏感性降低和与血小板整联蛋白的亲和性增强的tPA变异体的发展。因此，本发明提供了tPA变异体和将其用于治疗血栓形成疾病的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种组织型纤溶酶原激活物(tPA)，其含有去活化的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)结合位点和血小板整联蛋白的结合位点，其中该tPA具有血纤维蛋白溶解活性和对血小板整联蛋白的亲和性。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的tPA变异体的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于编码和表达本发明的tPA变异体的多核苷酸、载体和宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗血栓形成疾病的方法。/该方法包括施用需要这样治疗的被试者有效量的本发明的tPA变异体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗急性心肌梗塞的方法，该方法包括施用需要这样治疗的被试者有效量的本发明的tPA变异体。
附图简述附图说明
图1显示了纯化的本发明的重组tPA变异体对血纤维蛋白原与糖蛋白IIb/IIIa结合的抑制效果。
图2显示了通过裂解显色肽底物所测纯化的重组tPA变异体的酰胺分解活性。
优选实施方案描述本发明的基础，部分地，在于发现了对tPA的受控修饰提供了具有改善的药物动力学特性的新变异体，例如，减少对其抑制剂的敏感性和增加对血小板整联蛋白的亲和性。从而，本发明提供了tPA变异体、tPA变异体的组合物和将它们用于治疗疾病的方法，例如用于治疗血栓形成疾病。
在描述本方法之前，先要了解本发明并不局限于所述的特定方法，同样地也当然可以对之加以改变。还要了解在这里使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的而并不是为有所限制，因为本发明的范围将只受到附加的权利要求的限制。
除非另外的定义，这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员的一般理解具有相同的含义。尽管任何与这里所描述的相似或等同的方法和材料也能用于实践和测试本发明，优选的方法和材料是现在所描述的。这里所提及的所有出版物都一并作为参考以揭示和描述与这些出版物所引用的方法和/或材料。
必须说明在这里和附加的权利要求中所使用的单数形式的“一”，“和”，以及“这”包括复数形式，除非上下文明确地规定了别的形式。因而，例如，提到“一种变异体”包括了这些变异体的复数形式，提到“这种宿主细胞”包括一种或几种宿主细胞和那些该领域技术人员所知的它们的等同物，等等。
提供这里讨论的这些出版物只是因为它们的公开早于本申请的申请日。这里没有什么可以被解释为承认由于在前的发明本发明无权早于该出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际的出版日不同，这可能需要单独确认。
定义术语“治疗”，“医治”，“疗法”和类似用语在这里可替换使用，意思是获得期望的药理学的和/或生理学的效果。该效果可能是预防疾病，其通过完全地或部分地预防一种疾病或它的症状，和/或可能是治疗性的，其通过部分地或完全地治愈一种疾病和/或该疾病所具有的副作用，例如增强维生素D的效应。在这里使用“治疗”包含治疗脊椎动物的疾病特别是哺乳动物，更特别是人类，包括(a)预防被试者产生疾病，其可能倾向于患病但还没有被诊断出患病；(b)抑制疾病，即停止它的发展；或者(c)减轻疾病，即导致该疾病的消退。
这里使用的术语“被试者”指动物，特别是易患血栓形成疾病或急性心肌梗塞的动物，优选的是人类。
术语“有效量”和“对于……有效的量”或“治疗有效量”或任何语法上等同的术语，指的是当为了治疗疾病施用动物时，足以有效治疗这种疾病的量。
这里所使用的“施用”指的是口头施用，作为栓剂施用，局部接触，静脉内、腹膜内、肌内的、病灶内、鼻内的或皮下施用，或将一种缓慢释放装置如微渗透泵植入被试者。施用可通过任何途径包括非肠道的和跨黏膜的(例如如微渗透泵植入被试者。施用可通过任何途径包括非肠道的和跨黏膜的(例如口头的、鼻的、阴道的、直肠的或渗透皮肤的)。非胃肠道的施用包括，例如静脉内的、肌内的、细动脉内的、皮内的、皮下的、腹膜内的、心室内的和颅内的。其他的递送方式包括但是不局限于使用脂质体制剂、静脉注射、渗透皮肤的药贴等。
术语“分离的”指的是材料实质上或基本上从用于生产该材料的组分中脱离。当应用在本发明中，术语“分离的”指的是材科实质上或基本上从用于制备该材料的通常在混合物中与该材料共存的组分中脱离以制备该材料。“分离的”和“纯的”可替换使用。
术语“氨基酸”指的是天然存在的和人工合成的氨基酸，还有功能上与天然存在的氨基酸相似的氨基酸的类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些遗传密码编码的，以及随后那些被修饰过的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢相结合的碳、羧基基团、氨基基团和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰过的R基团(例如，正亮氨酸)，或者修饰过的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指的是与普通的氨基酸化学结构不同的化学的化合物，但是其与天然存在的氨基酸以相似的方式发挥功能。
依照本发明，本发明的tPA变异体包含去活化的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)结合位点和血小板整联蛋白的结合位点。去活化的PAI结合位点可以是任何减少的或被抑制的PAI结合位点，例如，任何含有和tPA与PAI的相互作用有关的氨基酸的区域和与PAI的结合活性降低的区域。本领域的技术人员通常知道PAI结合位点的核心包括相应于人类tPA序列的296-304位氨基酸的氨基酸区域，特别是，296-302位的氨基酸和304位的氨基酸。
在本发明的某些实施方案中，本发明的去活化的PAI结合位点可以是含有一个或多个氨基酸突变(例如插入、缺失或置换)的PAI结合位点。这些突变可以是一个或多个氨基酸的突变、单一类型的突变或不同类型的联合突变，例如氨基酸的插入、缺失或置换。氨基酸可以插入到有或者没有任何氨基酸缺失的PAI结合位点。另外，氨基酸置换包括以相同的或更多数目的氨基酸来替可以通过阻断一个或多个PAI结合位点中的氨基酸来完成。突变和阻断方法可以单独使用或联合使用来产生对抑制的敏感性降低的tPA变异体。
在一个实施方案中，本发明的去活化的PAI结合位点是具有插入、缺失和/或置换至少两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的PAI结合位点。在另一个实施方案中，本发明的去活化的PAI结合位点是在相应于人类tPA296-302位氨基酸的区域缺失了至少两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的PAI结合位点。在另一个实施方案中，本发明的去活化的PAI结合位点是具有至少两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸缺失并以相同或更多数目的氨基酸置换的PAI结合位点。在另一个实施方案中，本发明的去活化的PAI结合位点是已经整体或部分地被一个能结合血小板整联蛋白的基序所替代的PAI结合位点。在本发明的优选实施方案中，PAI结合位点中的至少两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸被缺失并由血小板整联蛋白的结合位点所替代。
依照本发明，血小板整联蛋白的结合位点包括本发明的修饰的tPA与血小板整联蛋白结合所需要的最小数量的氨基酸。这些氨基酸序列的存在用于抑制或降低血小板膜受体如糖蛋白IIb/IIIa受体的活性，尤其是它的配体结合功能。本发明的血小板整联蛋白结合位点可以包括任何来自于天然存在的多肽、单克隆抗体如单克隆抗体的CDR区、小肽等的氨基酸区域。
在一个实施方案中，本发明的血小板整联蛋白结合位点包括具有相应于在源于蛇毒的去整联蛋白(包含RGD基序(氨基酸Arg-Gly-Asp)的同源肽家族)中发现的氨基酸序列的区域。在另一个实施方案中，本发明的血小板整联蛋白结合位点包括相应于抗血小板膜受体的单克隆抗体的CDR区，例如抗整联蛋白αIIbβ3抗体的CDR3区的氨基酸区域。在另一个实施方案中，本发明的血小板整联蛋白结合位点包括选自Arg-Gly-Asp，Lys-Gly-Asp，Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly，Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly，Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn和Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn的氨基酸序列。
依照本发明，本发明的血小板整联蛋白结合位点可以存在于修饰的tPA的任何区域，只要所产生的修饰的tPA与血小板整联蛋白具有亲和性并仍然保留tPA活性。在本发明的优选实施方案中，tPA变异体应当保留至少20％、30％、留tPA活性。在本发明的优选实施方案中，tPA变异体应当保留至少20％、30％、40％、50％、60％或70％的tPA活性，尤其是有关它催化纤溶酶原转化为纤溶酶。在一个实施方案中，本发明的血小板整联蛋白结合位点存在于tPA的C末端区域，例如，相应于人类tPA的264-527位氨基酸的tPA的SP结构域。在另一个实施方案中，本发明的血小板整联蛋白结合位点存在于基于胰凝乳蛋白酶原编号的tPA的第37个插入环中，该编号可参考Ranatus，等，1997，EMBO J.16，。在另一个实施方案中，本发明的血小板整联蛋白结合位点存在于tPA的PAI结合位点中。在另一个实施方案中，本发明的血小板整联蛋白结合位点，整体或部分替换了tPA的PAI结合位点。
大体上，本发明的血小板整联蛋白结合位点使本发明的tPA对血小板整联蛋白具有亲和性。对血小板整联蛋白的亲和性包括对血小板整联蛋白任何特异的结合活性。这些特异的结合活性可以任何形式或方式呈现，例如，作为以下的一种形式1)任何直接的结合血小板整联蛋白，整联蛋白αIIbβ3，2)任何部分或整体上特异地抑制血小板整联蛋白的配体结合活性，或3)任何与抗血小板整联蛋白的抗体特异竞争的能力。为了增加它与血小板整联蛋白的亲和性，本发明的修饰tPA可以包括一个或多个血小板整联蛋白的结合位点。在具有多个血小板整联蛋白结合位点的tPA中，这些位点可以互相接近或互相远离，例如，在修饰的tPA的N末端或C末端。
依照本发明，本发明的tPA可以包括野生型tPA的部分序列或者基本上全部的序列。在一个实施方案中，本发明的修饰的tPA具有式F-X-C或者F-X-C-X，其中F包含人类tPA的1-295位的氨基酸或人类tPA的176-295位的氨基酸，C包含人类tPA的303-527位的氨基酸，X包含选自Arg-Gly-Asp、Lys-Gly-Asp、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn和Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn的氨基酸序列。
本发明的tPA可以通过当前所知晓的或随后发现的任何适合的方式来制备。在本发明示范性的实施方案中，tPA变异体可以通过重组或化学方式来制备。例如，一个编码本发明的tPA变异体的多核苷酸可以从tPA变异体的氨基酸序列中很容易地获得。这些多核苷酸能够被可操作地与启动子相连或者包含于能在原核或真核表达系统中表达的表达载体中。本领域的技术人员能够识别可用于实现本发明目的原核或真核宿主细胞。另外，本发明的修饰的tPA可以被制成存在于单一载体或者多个载体中的单链多肽或者多链多肽。在本发明示范性的实施方案中，多链变异体可以包含重链(相应于人类tPA的1-275位氨基酸)和轻链(相应于人类tPA的276-527位的氨基酸)，它们的截短的变异体，或者它们的可选择的组合。
依照本发明的另一方面，本发明的修饰的tPA可以以细合物的形式提供，尤其是包括一种或多种其它非活性成分例如不影响修饰的tPA的功能的成分的药物组合物。例如，本发明的组合物可以包括合适的载体或与其他的治疗制剂组合。
在这里所使用的“药学上可接受的载体”包括任何材料，当与tPA变异体结合时保留该肽的活性并且与被试者的免疫系统是不反应的。示范性的载体包括但不局限于大的缓慢代谢的大分子，例如粉末、胶囊体、蛋白、多醣、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒颗粒或者水性载体。在某些实施方案中，水生载体以口服制剂的形式用于本发明的组合物，包括但不局限于增稠材料、湿润剂、水、缓冲剂、研磨抛光材料、乳化剂、表面活性剂、二氧化钛、调味料、，甜味剂、着色剂和它们的混合物。其他载体也可以包括无菌溶液，片剂包括包衣片剂和胶囊。典型的这些载体包含赋形剂例如淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这些载体也可以包括调味料和着色添加剂或其它组分。包含这些载体的组合物通过所公知的常规方法制备。
依照本发明的另一个方面，本发明的修饰的tPA可以用于治疗任何与溶栓系统有关的疾病，尤其是动脉的溶栓系统。通常，修饰的tPA可以用于作为溶栓剂，例如一种改进的tPA溶栓剂，该tPA溶栓剂可治疗任何可用野生型tPA或其他修饰方式的tPA治疗的病情。在一个实施方案中，本发明的修饰的tPA可以用于治疗任何血栓形成疾病。在另一个实施方案中，本发明的修饰的tPA可以用于治疗任何心肌梗塞和其他的血栓栓塞疾病，例如，血栓栓塞性中风。在另一个实施方案中，本发明的修饰的tPA可以用于治疗急性的冠状动脉综合症。
通常，本发明的修饰的tPA可以单独使用或与其他疗法或治疗联合使用，或者以不同的顺序分别施用或者同时施用。依照本发明，有效量的本发明的组合物可以根据病例的具体情况来施用被试者。要考虑的因素通常包括被治疗的总表面积、年龄、体重、病情发展阶段、其他疾病症状、治疗持续期和对初始治疗的反应。例如，静脉内施用的有效剂量范围从0.1mg/kg到2.5mg/kg，或大致50,000IU/kg到1,250,000IU/kg。(IU由体外的血块溶解试验测定以及用WHO标准为对照来检测的国际单位)。
典型的，本发明所使用的制剂或组合物被制备成表面剂或注射剂，或者是液体溶液或者是悬浮液。然而，在注射之前适合溶解于或悬浮于液体媒介的固体形式也可以制备得到。该组合物也可以根据本领域公知的方法制备成肠衣片或胶囊。
本发明的制剂或组合物可以依赖不同的因素通过任何医学上可接受的方式施用，例如被治疗的病情或伤害的位点、类型和严重性。可能的施用途径包括注射，通过非胃肠道途径例如血管内的、静脉内的、硬膜内的或其它的，还有经口的、鼻的、眼的、直肠的、阴道的、局部的、或肺部的，例如通过吸入施用。细合物也可以直接应用于组织表面。持续的释放、依赖于pH的释放或其它特异的化学或环境条件介导的释放施用也明确的包括进本发明，通过这些方式例如包埋注射(depot injection)或可蚀性植入(erodible implant)。
实施例下面的实施例是为了阐明但不以任何可方式、形态或形式明确地或暗示地限制本发明，虽然它们对于那些可使用的是典型的，本领域的技术人员所公知的其它程序、方法或技术可以被选择地使用。
实施例1构建编码含有K2C结构域的单链tPA变异体的载体表达本发明的修饰的tPA的独特特征的各种载体和克隆可以使用传统的重组DNA技术产生。通过举例的方式，我们已经构建了表达单链人类tPA K2C(Kringle2结构域加上催化结构域；SEQ ID NO2)的pHS-tPA。pHS-tPA由获得于Origene Techonlogies(Rockville，MD)的野生型人类tPA的cDNA克隆构建而成。然后使用本领域公知的PCR技术合成K2C结构域。引物对5noS(GGGAATTCCATATGTCGTATCAGGGAAACAGTGACTGCTACTTT)和3tp(CTAGCTAGCTTATCACGATCGCATGTTGTCAC)被用于PCR扩增。基因片段然后被克隆到pHS-25的Nde I和Nhe I位点，pHS-25是一种可诱导的启动子调控的大肠杆菌(E.coli)表达载体，。该质粒包含能在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素(amp)标记。pHS-tPA表达具有SP结构域内的野生型序列的K2C结构域。
实施例2设计和构建编码含有具有可移动盒的K2C结构域的双功能单链tPA变异体文库为了使整联蛋白抑制剂序列能以稳定的和功能性的方式存在于37插入环中，最优化核心结合基序周围的序列是关键。为了达到序列的多样生和筛选的有效性，设计了具有核心RGD周围的随机序列的文库盒(library cassette)。首先，如下的两个限制位点被引入pHS-tPA引物对5noS(GGGAATTCCATATGTCGTATCAGGGAAACAGTGACTGCTACTTT)和H3C(CAAGCTTCCATCTTTGCCGATCGATTCCTGTGCGGGGGCATACTC)被用于扩增tPA K2C的一部分，其中使用上面提到的pHS-tPA作为模板，和引物对ClaH(TCGATCGGCAAAGATGGTAGCTTGCCAGGGGTGGGAGGCGATG)和3tp(CTAGCTAGCTTATCACGATCGCATGTTGTCAC)被用于扩增K2C的第二部分，其中使用质粒pHS-tPA作为模板。上面两种PCR片段经纯化，混合，被用作重组PCR反应的模板，使用引物对5noS和3tp。重组的PCR片段然后经纯化和Nde I和Nhe I消化后，连接到pHS-25，然后用Nde I和Nhe I酶切以产生如SEQ ID NO3所示的pHS-tPAd。
为了随机化核心氨基酸的N末端和C末端，合成了两个寡核苷酸，40mR(AGCTGCCATCTTTNNBNNBARGGGCGATNNBNNBGGTGAT)和38mR(CGATCACCVNNVNNATCGCCCYTVNNVNNAAAGATGGC)，并经退火。经退火的片段被连接到pHS-tPAd并用限制酶Hind III和Cla I酶切。电穿孔使连接产物进入BL21衍生的E.coli菌株BL21d。然后20个克隆被随机选出并经测序，95％的克隆显示出含有插入片段。该文库的典型序列在这里表示为SEQ ID NO4。
在含100μg/ml的Amp的LB琼脂培养基上过夜培养后，这些克隆用IPTG诱导并转移到循环过滤器(circledfilter)中。然后将过滤收集到的克隆按如下方式进行溶解、变性和重折叠。过滤器上溶解的克隆在8M尿素缓冲液(8M尿素，0.1M TRIS.，1mM甘氨酸，1mM EDTA，10mM DTT，1mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSH))中变性，并且在重折叠缓冲液(50mMTris碱，15mML-精氨酸，2mM NaEDTA，0.1％吐温80，0.25mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽，蛋白酶抑制剂(尿素需要稀释到0.4M，和pH用1NHCL逐渐地调整到7.4))中温育48-96小时进行重折叠。含有重折叠克隆的过滤器然后与糖蛋白IIb/IIIa一起温育。
阳性的连接子通过抗β3抗体鉴定，然后二级抗体与HRP连接，用显色底物检测。鉴定了具有糖蛋白IIb/IIIa结合活性的K2C的多个变异体，通过对重组蛋白的表达和纯化进一步分析了典型克隆。四个典型变异体RR-tPA、KR-tPA、RP-tPA和KP-tPA的盒DNA(Hind III-Cla I)序列随后被鉴定，分别如SEQ ID NO5、6、7和8所示。
实施例3表达和纯化重组蛋白含有适当的表达质粒的大肠杆菌培养物BL21d被接种到附加5ml葡萄糖和100μg/ml Amp的LB培养基中，用1mM的IPTG诱导3小时。收集细胞，溶解，离心分离为可溶的和不可溶的细胞组分。这些组分先用SDS-PAGE检测，重组蛋白经测定为不可溶的并且观察到形成包涵体。仔细的移去上清后，重悬沉淀，洗涤几次。重组蛋白溶解于8M尿素缓冲液(8M尿素，0.1M TRIS碱，1mM甘氨酸，1mM EDTA，10mM DTT，1mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSH))。变性蛋白在重折叠缓冲液(50mM Tris碱，15mM L-精氨酸，2mM NaEDTA，0.1％吐温80，0.25mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽，蛋白酶抑制剂)中温育48-96小时进行重折叠。
重折叠蛋白然后在L-赖氨酸-琼脂糖亲和柱中纯化，该亲和柱在柱缓冲液(缓冲液A50mM Tris-HCL，pH 7.4；2mM EDTA；0.1％吐温80)中冲洗和平衡。在柱子上加样后，用8倍柱体积的缓冲液A进行冲洗，接着用8倍体积的含有0.1M NaCl的缓冲液A冲洗。蛋白随后由含0.5M NaCl和0.2M赖氨酸的缓冲液A洗脱。
实施例4使用显色底物检测双功能重组tPA变异体的蛋白酶催化活性tPA的显色试验使用合成的底物H-D-异亮氨酰-L-脯氨酰基-L-精氨酸-对-硝基苯胺-去盐酸盐(S2288，diapharma，OH)。纯化的重组tPA变异体和对照蛋白被加入含有胰岛素抑制剂的微量滴定板的加样孔中。将2mM的S2288水溶液加入含有100mM Tris，100mM NaCl，0.02％叠氮化钠的反应缓冲液中。使用板读出器(Molecular Devices)在405nm检测颜色形成。变异体的浓度用抗tPA的ELISA试验测定。如图2中所示，重组体的相对活性与在催化结构域没有插入和突变的对照tPA进行了比较。
为了检测血纤维蛋白介导的对tPA变异体的激活，使用了合成的纤溶酶显色底物H-D-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-对-硝基苯胺(H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide)(S-2251，diapharma，OH)。在该试验中，纤溶酶消化的血纤维蛋白原的溴化氰片段被加入作为激活物。该反应在微量滴定板上进行，反应缓冲液中含有0.3mM S-μM纤溶酶原、0.2μM溴化氰和纤溶酶消化的血纤维蛋白原和100mM pH7.4的Tris-Cl。tPA变异体的比活性通过比较由使用抗tPA的抗体的ELISA试验测定的活化因子浓度和酶的数量来确定。药物动力学特性，例如tPA变异体的血纤维蛋白结合性、血纤维蛋白溶解作用和血纤维蛋白原溶解作用，可以通过本领域的技术人员使用文献所描述的方法来进一步表征。
实施例5通过纯化的重组双功能tPA变异体抑制血纤维蛋白原结合糖蛋白IIb/IIIa来源于人类血小板的糖蛋白IIb/IIIa和来源于人类血浆的血纤维蛋白原从Calbiochem(CA)获得。浓度为5μg/ml的糖蛋白IIb/IIIa复合物被固定到有20mM Tris-HCl，pH7.4，含imM CaCl2和1mM MgCl2的150mM NaCl的96孔的板中。该板用整联蛋白包被4℃过夜。板子然后通过用50mM Tris-HCl，pH7.4，含20mg/ml牛血清白蛋白的100mM NaCl一起温育来封闭。含有或不含重组tPA变异体蛋白的血纤维蛋白原分别在结合缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，100mM NaCl，含1mg/ml牛血清白蛋白的0.5mM CaCl2)中稀释到合适的浓度，加入到固定整联蛋白的微量滴定孔中，37℃结合2小时。
在重组双功能tPA蛋白或对照蛋白存在的条件下，通过测定被固定的糖蛋白IIb/IIIa结合的血纤维蛋白原的数量的减少来确定本发明的重组双功能tPA变异体血纤维蛋白原结合的抑制作用。如图1所示，双功能重组tPA变异体蛋白，即使在纳摩尔浓度，也能有效地解除血纤维蛋白原与固定的糖蛋白IIb/IIIa的结合。
实施例6通过重组双功能tPA变异体蛋白来抑制血小板的聚集人类凝胶过滤的血小板按如下描述制备(Bennett等，1983，Proc.Natl.Aca.Sci.80，)。富血小板血浆被分离并在含有137mMNaCl、2.7mM KCl、10mM Hepes、5.6mM葡萄糖、12mM NaHCO3和0.3％白蛋白、pH7.4的缓冲液平衡过的琼脂糖柱中层析。血小板被回收并在同样的缓冲液中把浓度调整到2×108/ml。为了研究聚集的抑制，在重组双功能tPA蛋白、抑制剂RGD肽或对照存在的条件下，含有100μg/ml血纤维蛋白原和2mM CaCl2的0.5ml的血小板被加入到血小板凝集计管中，聚集的抑制在加入ADP或凝血酶后测定，通过使用Chronolog凝集计检测透光度的变化。据此获得的结果说明重组双功能tPA变异体有效地抑制了血小板的聚集。
实施例7构建其它纤溶酶原激活物的双功能变异体通过类似的方法，其它纤溶酶原激活物例如尿激酶的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)基序，可以替换这里鉴定的血小板聚集抑制序列。可选择的，最佳的具有血小板聚集抑制活性的序列可以用相似的筛选方法分离，通过用文库盒部分或整体替换PAI序列。
实施例8构建和分离具有凝血酶抑制活性的重组双功能tPA变异蛋白血小板聚集通过许多激活物介导，最有效之一是凝血酶，它能通过凝血酶受体介导的信号传导激活血小板。一种产生双功能tPA变异体的可选择的方法是获得tPA变异体，它也能抑制血小板上凝血酶受体或凝血酶本身。水蛭素是目前市场上已知的最有效的凝血酶抑制剂之一。已知有一些氨基酸序列与该抑制有关。也已知道一种源于凝血酶受体的肽抑制凝血酶的活性。因此，产生本发明的抑制血小板聚集的tPA变异体的一种类似的方法是分离重组双功能tPA变异体，其中在tPA催化结构域的PAI序列已经部分或全部被编码凝血酶抑制肽例如水蛭素的文库盒替代。
实施例9设计和构建含有K2C结构域的双功能单链tPA变异体为了使整联蛋白抑制剂序列以一种稳定的和功能性的方式存在于37插入环中，最优化核心结合元件周围的序列是有必要的。为了该目的，核心RGD周围的序列被设计成含有能形成二硫键的侧翼半胱氨酸。质粒pHS-tPAd，如实施例2所述(SEQ ID NO3)，被用作载体来构建那些克隆。在一个构建体中，两个寡核苷酸CyaRH5(AGCTGCCATCTTTGCCTGCTATGCGCGTGGCGATTGGCCGTGCGAG)和CyaRC3(CGCTCGCACGGCCAATCGCCACGCGCATAGCAGGCAAAGATGGC)，被合成和退火。经退火的片段被连接到质粒pHS-tPAd(SEQ ID NO3)，并且用限制酶Hind III和Cla I酶切。电穿孔使连接产物进入BL21衍生的大肠杆菌菌株，BL21d。产生的构建体pHS-tPA/CR的序列然后被测定，在这里表示为SEQ ID NO9。
在另一个构建体中，两个不同的寡核苷酸NwkR5(AGCTGCCATCTTTGCCTGCAACTGGAAACGTGGCGATTGCGAG)和CdgR3(CGCTCGCAATCGCCACGTTTCCAGTTGCAGGCAAAGATGGC)，被合成和退火。与另一个构建体一样，经退火的片段被连接到质粒pHS-tPAd(SEQ ID NO3)，并且用限制酶Hind III和Cla I酶切。电穿孔使连接产物进入BL21衍生的大肠杆菌菌株，BL21d。产生的构建体pHS-tPA/Nwk的序列被测定并且在这里表示为SEQ ID NO10。重组蛋白随后被表达并如其它实施例所述的那样检测它的药物动力学特性。
为了清楚的理解的目的，尽管已经通过举例和实施例的方式对前述的发明进行了较详细的描述，但对那些本领域的普通技术人员来说，根据本发明的教导，对本发明进行某些变化和改进而不脱离附加权利要求的精神和范围是非常显而易见的。
序列表SEQ IDList 1(hu-tPA，单链，527AA，编号方式根据Pennica等，Nature 301，214-221)MYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYCWCNSGRAQCHSVPVKS
50CSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISY
100RGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRD
150SKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGAS
200CLPWNSMILIGNVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRR
250LTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRS
300PGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQ
350KFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPAD
400LQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRT
450VTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGL
500GCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP*List 2(含K2C的截短的单链tPA，在质粒pHS-tPA表达)1ATGTCGTATC AGGGAAACAG TGACTGCTAC TTTGGGAATG GGTCAGCCTA51
CCGTGGCACG CACAGCCTCA CCGAGTCGGG TGCCTCCTGC CTCCCGTGGA101
ATTCCATGAT CCTGATAGGC AATGTTTACA CAGCACAGAA CCCCAGTGCC151
CAGGCACTGG GCCTGGGCAA ACATAATTAC TGCCGGAATC CTGATGGGGA201
TGCCAAGCCC TGGTGCCACG TGCTGAAGAA CCGCAGGCTG ACGTGGGAGT251
ACTGTGATGT GCCCTCCTGC TCCACCTGCG GCCTGAGACA GTACAGCCAG301
CCTCAGTTTC GCATCAAAGG AGGGCTCTTC GCCGACATCG CCTCCCACCC351
CTGGCAGGCT GCCATCTTTG CCAAGCACAG GAGGTCGCCC GGAGAGCGGT401
TCCTGTGCGG GGGCATACTC ATCAGCTCCT GCTGGATTCT CTCTGCCGCC451
CACTGCTTCC AGGAGAGGTT TCCGCCCCAC CACCTGACGG TGATCTTGGG501
CAGAACATAC CGGGTGGTCC CTGGCGAGGA GGAGCAGAAA TTTGAAGTCG551
AAAAATACAT TGTCCATAAG GAATTCGATG ATGACACTTA CGACAATGAC601
ATTGCGCTGC ATCGGATTCG TCCCGCTGTG CCCAGGAGAG651
CAGCGTGGTC CGCACTGTGT GCCTTCCCCC GGCGGACCTG CAGCTGCCGG701
ACTGGACGGA GTGTGAGCTC TCCGGCTACG GCAAGCATGA GGCCTTGTCT751
CCTTTCTATT CGGAGCGGCT GAAGGAGGCT CATGTCAGAC TGTACCCATC801
CAGCCGCTGC ACATCACAAC ATTTACTTAA CAGAACAGTC ACCGACAACA851
TGCTGTGTGC TGGAGACACT CGGAGCGGCG GGCCCCAGGC AAACTTGCAC901
GACGCCTGCC AGGGCGATTC GGGAGGCCCC CTGGTGTGTC TGAACGATGG951
CCGCATGACT TTGGTGGGCA TCATCAGCTG GGGCCTGGGC TGTGGACAGA1001 AGGATGTCCC GGGTGTGTAC ACCAAGGTTA CCAACTACCT AGACTGGATT1051 CGTGACAACA TGCGACCGTG A
List 3(含K2C截短的单链tpA具有Hind III-Cla I盒以插入文库寡核酸产生变异)1ATGTCGTATC AGGGAAACAG TGACTGCTAC TTTGGGAATG GGTCAGCCTA51
CCGTGGCACG CACAGCCTCA CCGAGTCGGG TGCCTCCTGC CTCCCGTGGA101
ATTCCATGAT CCTGATAGGC AATGTTTACA CAGCACAGAA CCCCAGTGCC151
CAGGCACTGG GCCTGGGCAA ACATAATTAC TGCCGGAATC CTGATGGGGA201
TGCCAAGCCC TGGTGCCACG TGCTGAAGAA CCGCAGGCTG ACGTGGGAGT251
ACTGTGATGT GCCCTCCTGC TCCACCTGCG GCCTGAGACA GTACAGCCAG301
CCTCAGTTTC GCATCAAAGG AGGGCTCTTC GCCGACATCG CCTCCCACCC351
CTGGCAAGCT TCCATCTTTG CCGATCGATT CCTGTGCGGG GGCATACTCA401
TCAGCTCCTG CTGGATTCTC TCTGCCGCCC ACTGCTTCCA GGAGAGGTTT451
CCGCCCCACC ACCTGACGGT GATCTTGGGC AGAACATACC GGGTGGTCCC501
TGGCGAGGAG GAGCAGAAAT TTGAAGTCGA AAAATACATT GTCCATAAGG551
AATTCGATGA TGACACTTAC GACAATGACA TTGCGCTGCT GCAGCTGAAA601
TCGGATTCGT CCCGCTGTGC CCAGGAGAGC AGCGTGGTCC GCACTGTGTG651
CCTTCCCCCG GCGGACCTGC AGCTGCCGGA CTGGACGGAG TGTGAGCTCT701
CCGGCTACGG CAAGCATGAG GCCTTGTCTC CTTTCTATTC GGAGCGGCTG751
AAGGAGGCTC ATGTCAGACT GTACCCATCC AGCCGCTGCA CATCACAACA801
TTTACTTAAC AGAACAGTCA CCGACAACAT GCTGTGTGCT GGAGACACTC851
GGAGCGGCGG GCCCCAGGCA AACTTGCACG ACGCCTGCCA GGGCGATTCG901
GGAGGCCCCC TGGTGTGTCT GAACGATGGC CGCATGACTT TGGTGGGCAT951
CATCAGCTGG GGCCTGGGCT GTGGACAGAA GGATGTCCCG GGTGTGTACA1001 CCAAGGTTAC CAACTACCTA GACTGGATTC GTGACAACAT GCGACCGTGAList 4(含K2C的截短的单链tpA具有编码R/KGD核心序列和随机的邻近氨基酸的序列)1
ATGTCGTATC AGGGAAACAG TGACTGCTAC TTTGGGAATG GGTCAGCCTA51
CCGTGGCACG CACAGCCTCA CCGAGTCGGG TGCCTCCTGC CTCCCGTGGA101 ATTCCATGAT CCTGATAGGC AATGTTTACA CAGCACAGAA CCCCAGTGCC151 CAGGCACTGG GCCTGGGCAA ACATAATTAC TGCCGGAATC CTGATGGGGA201 TGCCAAGCCC TGGTGCCACG TGCTGAAGAA CCGCAGGCTG ACGTGGGAGT251 ACTGTGATGT GCCCTCCTGC TCCACCTGCG GCCTGAGACA GTACAGCCAG301 CCTCAGTTTC GCATCAAAGG AGGGCTCTTC GCCGACATCG CCTCCCACCC351 CTGGCAAGCT GCCATCTTTN NBNNBARGGG CGATNNBNNB NNBGATCGAT401 TCCTGTGCGG GGGCATACTC ATCAGCTCCT GCTGGATTCT CTCTGCCGCC451 CACTGCTTCC AGGAGAGGTT TCCGCCCCAC CACCTGACGG TGATCTTGGG501 CAGAACATAC CGGGTGGTCC CTGGCGAGGA GGAGCAGAAA TTTGAAGTCG551 AAAAATACAT TGTCCATAAG GAATTCGATG ATGACACTTA CGACAATGAC601 ATTGCGCTGC TGCAGCTGAA ATCGGATTCG TCCCGCTGTG CCCAGGAGAG651 CAGCGTGGTC CGCACTGTGT GCCTTCCCCC GGCGGACCTG CAGCTGCCGG701 ACTGGACGGA GTGTGAGCTC TCCGGCTACG GCAAGCATGA GGCCTTGTCT751 CCTTTCTATT CGGAGCGGCT GAAGGAGGCT CATGTCAGAC TGTACCCATC801 CAGCCGCTGC ACATCACAAC ATTTACTTAA CAGAACAGTC ACCGACAACA
TGCTGTGTGC TGGAGACACT CGGAGCGGCG GGCCCCAGGC AAACTTGCAC901
GACGCCTGCC AGGGCGATTC GGGAGGCCCC CTGGTGTGTC TGAACGATGG951
CCGCATGACT TTGGTGGGCA TCATCAGCTG GGGCCTGGGC TGTGGACAGA1001 AGGATGTCCC GGGTGTGTAC ACCAAGGTTA CCAACTACCT AGACTGGATT1051 CGTGACAACA TGCGACCGTG AID
序列List 5
AGCTGCCATCTTTGCCGGCAGGGGCGATTGGCGCAATGATList 6
AGCTGCCATCTTTGCCGGCAAGGGCGATTGGCGCAATGATList 7
AGCTGCCATCTTTGCCGGCAGGGGCGATTGGCCGGGCGATList 8
AGCTGCCATCTTTGCCGGCAAGGGCGATTGGCCGGGCGAT
1.一种具有血纤维蛋白溶解活性的组织纤溶酶原激活物(tPA)，其包含去活化的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)结合位点和血小板整联蛋白结合位点，其中所述的血小板整联蛋白结合位点对血小板整联蛋白具有亲和性。
2.权利要求1的tPA，其中去活化的PAI结合位点包含在tPA的PAI结合位点内的至少三个氨基酸的缺失。
3.权利要求1的tPA，其中去活化的PAI结合位点包含在tPA的PAI结合位点内的至少三个氨基酸的置换。
4.权利要求1的tPA，其中血小板整联蛋白结合位点在tPA的丝氨酸蛋白酶结构域内。
5.权利要求1的tPA，其中血小板整联蛋白结合位点位于tPA的PAI结合位点内。
6.权利要求1的tPA，其中tPA的PAI结合位点内的至少三个氨基酸已经被血小板整联蛋白结合位点的一部分所替换。
7.权利要求1的tPA，其中血小板整联蛋白结合位点包含选自如下的氨基酸序列Arg-Gly-Asp、Lys-Gly-Asp、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn和Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn。
8.具有式F-X-C的权利要求1的tPA，其中F包含人类tPA的1到295位的氨基酸，C包含人类tPA的303到527位的氨基酸，X包含选自如下的氨基酸序列Arg-Gly-Asp、Lys-Gly-Asp、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn和Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn。
9.权利要求8的tPA，其中F包含人类tPA的176到295位的氨基酸。
10.具有式F-X-C-X的权利要求1的tPA，其中F包含人类tPA的1到295位的氨基酸，C包含人类tPA的303到527位的氨基酸，X包含选自如下的氨基酸序列Arg-Gly-Asp、Lys-Gly-Asp、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Gly、Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn和Gly-Lys-Gly-Asp-Trp-Arg-Asn。
11.权利要求10的tPA，其中F包含人类tPA的176到295位的氨基酸。
12.一种含有权利要求1的tPA和药学上可接受的载体的药物组合物。
13.一种编码权利要求1的tPA的分离的多核苷酸。
14.一种含有权利要求13的多核苷酸的载体。
15.一种含有权利要求13的多核苷酸的宿主细胞。
16.一种治疗血栓形成疾病的方法，包括向需要该治疗的受治疗者施用有效量的权利要求1的tPA。
17.一种治疗急性心肌梗塞的方法，包括向需要该治疗的受治疗者施用有效量的权利要求1的tPA。
本发明提供了改进的tPA变异体，与野生型tPA比较，其具有显著降低的对抑制的敏感性和增强的对血小板整联蛋白的亲和性。本发明也提供了含有tPA变异体的组合物和产生tPA变异体的多核苷酸、载体和宿主细胞，以及使用这些tPA变异体来治疗疾病例如血栓形成疾病的方法。
文档编号C12N15/58GK
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者李圣锋 申请人:胡玛伯解决方案公司