皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展 -
Powered by Discuz! Archiver
皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
http://www.cmechina.net/images/kc_pen.gif
皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
http://www.cmechina.net/content//images/intro.jpg
& & 大多数真菌对人类有益，但随着临床免疫受损宿主的不断增多，发现越来越多的真菌可以引起机会性真菌感染。机会性真菌感染的发病率和病死率呈急剧上升趋势，这种现状已日益受到医学界的关注。目前真菌病的临床诊断一直存在困难，导致患者治疗失败甚或失去生命。面对这种现状，如何提高真菌病的诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题。
本课程共有5组考核你还没有参加本课程的考核 国家一类，5分
http://www.cmechina.net/images/fold.gif
医学真菌和真菌病总论
作者：李若瑜
单位：北京大学第一医院皮肤科
http://www.cmechina.net/images/fold.gif
浅部真菌感染诊断治疗进展
作者：王筱慧
单位：上海第二军医大学附属长海医院护理部
http://www.cmechina.net/images/fold.gif
常见深部真菌感染
作者：于秀荣
单位：上海第二军医大学附属长海医院护理部
http://www.cmechina.net/images/fold.gif
分子生物学方法在真菌感染诊断中的应用
作者：宫克
单位：上海第二军医大学附属长海医院护理部
http://www.cmechina.net/images/fold.gif
抗真菌药物治疗新进展
作者：张玲娟
单位：上海第二军医大学附属长海医院护理部
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
医学真菌和真菌病总论
北京大学第一医院 李若瑜
一、医学真菌概述
http://www.cmechina.net/content//01/images/index_travel.gif
& & 通过了解真菌的基本特征，从而可有助于真菌病的准确诊断，以及认识抗真菌药的作用机制。
http://www.cmechina.net/content//01/images/01.jpg
& &1、真菌的基本特性
& & 真菌是广泛分布于自然界的一大类真核生物，具有真正的细胞核和细胞器。它不含叶绿素，通过细胞壁吸收营养物质，分泌胞外酶降解不被吸收的多聚物为简单化合物而吸收，属于异养型。通过有性或无性繁殖方式产生孢子延续种族。真菌菌体的基本结构为丝状的菌丝体和/或孢子，其细胞壁含有甲壳质和β-（1-3）-葡聚糖，细胞内含有各种细胞器。
& & 真菌属于真核生物，形态多种多样，大小变化很大。真菌形态学特性在真菌鉴定方面依然发挥主要作用。真菌菌体的基本结构为单一的丝状或管状结构，称为菌丝，多数菌丝分枝延伸、交织成团形成菌丝体，这类真菌成为丝状真菌或霉菌。但另一类真菌属于单细胞性，称为酵母菌，通过芽殖和裂殖的方法进行繁殖，产生芽孢。霉菌和酵母菌这两大类真菌在形态学上有很大不同。
& & 真菌菌丝或芽孢经大量生长繁殖后形成真菌集团叫菌落。在不同成分的培养基上生长所形成的菌落不同。一般在相同的培养基、培养温度和时间等固定条件下，真菌菌落的形状、大小、颜色和纹饰等特性是划分基本类型的依据。真菌菌落主要分为酵母型菌落和丝状型菌落两大类。
是人类重要的致病性真菌。真菌的孢子发生、菌丝顶端生长、产生不同形态的孢子、各种色素、大小、形态、分隔等特性，均可作为真菌鉴定的参考依据。
http://www.cmechina.net/content//01/images/02.jpg
& & 真菌属于真核细胞，具有真正的细胞核，核膜上具有核孔，核中有核小体和线性染色体。胞浆中有微丝构成的细胞骨架，大部由肌动蛋白组成的，还有含微管蛋白的微管。胞浆中还含有各种细胞器，如线粒体、空泡、泡囊、粗面内质网、核糖体等。高尔基氏体不常见。真菌细胞膜含有大量的固醇，与人类细胞膜的主要成分为胆固醇不同，真菌主要是麦角固醇，是抗真菌药物作用的靶位。真菌细胞壁十分坚固，位于细胞膜外，作为真菌与周围环境的分界，具有十分重要的作用。其作用包括：维持细胞的外形、保护细胞免受渗透压的影响、调节营养物吸收和代谢产物分泌、组成真菌的抗原成分等。
& & 真菌细胞壁在生长繁殖以及与其它生物之间的相互作用中发挥着重要作用，近年来对其化学成分的研究十分活跃。研究表明真菌细胞壁主要成分是多糖，所有真菌细胞壁均具有纤维状和无定形两类组分。纤维状组分由晶状不溶于水的物质组成，主要包括几丁质和葡聚糖。几丁质主要是由β-（1,4）键连接的N-乙酰糖胺聚合物形成的微纤丝。葡聚糖主要包括β-（1,3）和β-（1,6）葡聚糖两种。无定形组分主要由多糖组成，大多数可溶，包括α-葡聚糖和甘露糖蛋白等，常混杂在纤维网中，可使细胞壁具有通透性。近年来随着对真菌细胞壁的了解不断加深，细胞壁的组分分析已成为真菌分类的重要依据；检测真菌细胞壁组分的试验已成为诊断深部真菌感染的重要手段；同时，抑制真菌细胞壁成分如几丁质和葡聚糖合成的抗真菌药物已成为抗真菌治疗的一个重要方向。
& & 真菌的基因组范围在1.7x107-9.3x107之间，其DNA含量界于原核和高等动植物之间。目前已测出很多真菌的基因序列，包括核糖体基因、线粒体基因和编码蛋白质的基因。特别是核糖体基因对于真菌的系统分类和进化研究都均有重要意义。随着微生物基因组计划的进展，已完成了包括白念珠菌及其它致病性念珠菌、新生隐球菌、粗球孢子菌、烟曲霉、构巢曲霉、组织胞浆菌和卡氏肺孢子菌等十几种致病真菌在内的全基因组测序工作，这些序列资料为深入研究致病真菌的生物学特性奠定了牢固基础。
& & 2、真菌的繁殖
& & 真菌的繁殖方式包括有性生殖和无性生殖。有性生殖需要经过核的融合及减数分裂，产生有性期或称为完全阶段。无性生殖则不需减数分裂仅经过有丝分裂，称为无性期或不全阶段。如果一种真菌具有有性和无性两种阶段，它可以具有两个名称。真菌的繁殖特点是其鉴定的重要依据。
http://www.cmechina.net/content//01/images/03.jpg
& & 酵母无性繁殖主要包括芽殖和裂殖两个类型。菌丝无性繁殖包括产生孢子囊孢子、关节孢子、厚膜孢子和分生孢子等几种类型。许多真菌繁殖可有两种以上的繁殖方式。无性生殖的过程主要包括体细胞断裂；裂殖成子细胞；体细胞或孢子产生小芽，每个小芽发育为新个体；产生有丝分裂孢子，孢子产生芽管，芽管产生菌丝。
& & 菌丝繁殖包括产生孢子囊孢子和分生孢子，分生孢子包括菌丝型孢子和芽殖型孢子两类。菌丝型孢子包括关节孢子、厚膜孢子；芽殖型孢子主要包括外生芽殖型和内生芽殖型。
& & 真菌的有性繁殖有主要存在于接合菌门——产生接合孢子；子囊菌门——产生子囊孢子；担子菌门——产生担孢子。
二、真菌病概论
http://www.cmechina.net/content//01/images/index_travel.gif
& & 本节中将对浅部真菌病分成浅表真菌病与皮肤真菌病逐一介绍。皮肤真菌病是在世界范围内最主要的真菌性疾病。
& & 真菌的种类繁多，估计自然界中有150万种以上，但已被人类发现和描述过的真菌只有约10万种左右。大多数真菌对人类有益，其中对人类具有致病性的致病性真菌不过300余种，真菌所引起的人类、动物的疾病, 称为真菌病，同时还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。
& & 真菌感染性疾病的分类主要根据真菌侵犯人体的部位分为四类：浅表真菌病、皮肤真菌病、皮下组织真菌病和系统性真菌病；前二者合称为浅部真菌病，后二者又称为深部真菌病。
& & 1、浅表真菌病
& & 感染仅仅局限于皮肤角质层的最外层，极少甚至完全没有组织反应，感染毛发时也只累及毛发表面，很少损伤毛发。浅表真菌病主要包括以下几类：
& & （1）花斑癣
http://www.cmechina.net/content//01/images/04.jpg
& & 俗称“汗斑”，发生在皮肤角质层，为轻微的，常常无症状的慢性真菌感染。该病呈全球分布，温带地区常见于夏秋季，我国发病南方高于北方。其病原菌马拉色菌是构成人体皮肤正常菌群的微生物之一。该菌具有亲脂性，皮损亦多位于皮脂腺丰富的部位。近年来利用分子生物学技术并结合菌种形态学和生理生化特性的研究，将马拉色菌属分为：厚皮马拉色菌、合轴马拉色菌、糠秕马拉色菌、斯洛菲马拉色菌、钝形马拉色菌、球形马拉色菌和限制马拉色菌等7种。
& & （2）掌黑癣
& & 是由暗色真菌引起的浅部感染，好发于手指和手掌，亦可见于颈部、胸部和足底，表现为棕色或黑色的斑。其病原菌为：1、威尼克外瓶霉，主要分布在欧洲和美洲，我国已见报告；2、曼逊枝孢霉，主要分布在亚洲和非洲，我国华南地区已有报告。
& & （3）毛结节病
& & 系毛干的真菌感染，依病原菌不同常分为两种：1、黑毛结节病，由何德毛结节菌引起，在南美和太平洋岛屿等多雨地区广泛存在，亚洲主要见于爪哇和东南亚；2、白毛结节病，由白吉利毛孢子菌引起，主要分布于南美、中欧、日本等地，我国也不少见。
& & 2、皮肤真菌病
http://www.cmechina.net/content//01/images/05.jpg
& & 感染累及皮肤角质层和皮肤附属器，如毛发、甲板等，能广泛破坏这些组织的结构并伴有不同程度的宿主免疫反应；这类真菌感染中最常见的是皮肤癣菌病，其它真菌引起的感染还包括皮肤念珠菌病等。
& & 皮肤癣菌病：根据不同的发病部位可以分为足癣、手癣、体癣、股癣、甲癣以及头癣等各类癣病；在世界范围内广泛发生，是最主要的真菌性疾病。其病原菌为皮肤癣菌，包括毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属三属；共40余种，能够引起人和动物感染的约20种，常见的致病菌有红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌和许兰毛癣菌等。
& & 3、皮下组织真菌病
http://www.cmechina.net/content//01/images/index_travel.gif
& & 本节中将熟悉一些皮下组织真菌病与系统性真菌病的病原体，以及相应的流行病学状况。
& & 真菌感染皮肤、皮下组织，包括肌肉和结缔组织。
& & （1）孢子丝菌病
& & 是由双相真菌孢子丝菌引起的皮肤、皮下组织及附近淋巴系统的亚急性和慢性感染，可以播散至骨骼和内脏。世界各地均可发病，我国南北均有一定地区流行，但以东北地区发病较高。其感染多因破损皮肤接触受污染的芦苇、土壤等而引起，是仅次于念珠菌病和曲霉病的深部真菌病；近年来在免疫受损的患者常发生侵袭性感染，甚至引起播散性孢子丝菌病。
& & （2）着色芽生菌病
& & 是由一组暗色真菌引起的主要侵犯皮肤和皮下组织的真菌感染，主要致病菌为卡氏枝孢霉、裴氏着色霉、紧密着色霉、疣状瓶霉以及播水喙枝孢。本病遍及全球各大洲，在热带、亚热带地区发病率高。我国山东章邱等地发病率高达0.023%，致病菌主要为卡氏枝孢霉，而我国南方则为裴氏着色霉。
& & （3）皮下组织暗色丝孢霉病
http://www.cmechina.net/content//01/images/07.jpg
& & 暗色丝孢霉病是由一大组暗色真菌引起的皮肤、皮下组织和系统性真菌感染。常见的病原菌有外瓶霉、链格孢、弯孢、枝孢霉、瓶霉等，目前离蠕孢和明脐菌也常见到；这些真菌在组织内形成酵母样细胞或菌丝，菌壁暗色，菌丝长短不一，或扭曲或肿胀。该病在世界各地均有散发病例报告，近年来我国已报告了一些散发病例。有皮肤及皮下组织暗色丝孢霉病和系统性暗色丝孢霉病两种；前者常在免疫力低下的患者外伤后，在皮肤、皮下组织或肌肉内出现孤立的小囊肿，逐渐发展成脓肿，部分患者皮损播散，形成疣状结节，肉芽肿性损害；若进一步经血行播散至骨骼、脑、肺、肝、脾、肾等处，则发展成为系统性暗色丝孢霉病，预后不良。
& & （4）透明丝孢霉病
& & 与暗色丝孢霉病相对应，透明丝孢霉病是指组织内的真菌在普通HE染色时表现为透明、有分隔、分枝或不分枝，偶然可以呈念珠样，但细胞壁不呈暗色。致病菌种类很多，如枝顶孢、镰刀菌、帚霉、青霉、拟青霉和曲霉等。但过去已用致病菌命名的，如曲霉病、镰刀菌病等则仍使用原名称，如尚未确定菌种又符合上述定义者，可诊断为此病，这一名称尚未得到广泛接受。
& & （5）足菌肿
& & 是由真菌、放线菌或细菌引起的局限性皮肤或皮下组织的慢性感染，感染部位肿胀、瘘管形成并排出带有颜色的颗粒。世界各地均有发病，但以中美、南美、非洲和印度等地为高。能够引起足菌种的放线菌有奴卡菌属、马杜拉放线菌属和链霉属的一些菌种，我国已见病例；而致病性真菌则主要为波氏假性阿利什霉，可经血液传播引起系统性感染。近年来，有报告红色毛癣菌、疣状癣菌、铁锈色小孢子菌、帚霉和镰刀菌引起足菌种者。
& & 4、系统性真菌病
& & 又称深部真菌病。除侵犯皮肤和皮下组织外，还累及组织和器官，甚至引起播散性感染。近年来，由于人体免疫功能的低下，由条件致病性真菌引起的系统性真菌病日益增多，新的致病菌不断出现，病情也日趋严重。常见有以下数种：
& & （1）念珠菌病
& & 是由念珠菌属引起的皮肤、粘膜和内脏的急性、亚急性和慢性炎症；病原菌有白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌。均为条件致病菌，其中白念珠菌最常见，毒力也最强。
& & （2）曲霉病
http://www.cmechina.net/content//01/images/08.jpg
& & 是除念珠菌病以外的第二位的系统性真菌病；其致病菌主要有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉和杂色曲霉等。曲霉感染遍布全世界，近年来发病率增多。
（3）隐球菌病
& & 由隐球菌感染人体而引起的急性、亚急性和慢性疾病。原发感染常常在肺部，以后可以播散至皮肤、粘膜和内脏。致病菌有新生隐球菌及其变种。可以从牛奶制品、腐烂的植物、水果等处分离出来，但传染源主要是鸽子的排泄物。
& & （4）接合菌病
& & 又称藻状菌病，是指由毛霉目和虫霉目的真菌引起的感染，其中单纯由毛霉目的真菌引起的感染称为毛霉病。近年来，已报告的接合菌病不断增多，如少根根霉、多变根毛霉、冻土毛霉、固孢蛙粪霉等，在我国均有报告。有些病情凶险，危及患者生命。
& & （5）马内非青霉病
& & 是由双相性真菌马内菲青霉引起的感染。该菌系东南亚部分地区最常见的条件致病菌之一，我国广西、广东等地均有报道。感染多见于艾滋病相关病人。临床症状包括发热、体重减轻、和虚弱，伴多个丘疹形成，部分皮损可坏死，也可有贫血、肝脾肿大、广泛淋巴结炎等，严重时危及生命。
& & 其它深部真菌病还有组织胞浆菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、芽生菌病等，病原菌分别为荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌和皮炎芽生菌，这类真菌本身具有致病性，属于真正的病原真菌。主要分布于北美、南美和北非等地，具有一定的地区流行性，多存在于当地的土壤中；近年来在非流行区的HIV感染人群中常常可以见到上述疾病，病情多与患者的CD4细胞计数相关，诊断和治疗均比较特殊，应当引起注意。
& & 此外，卡氏肺孢子虫目前已证实属于真菌，改称卡氏肺孢子菌，是艾滋病和免疫低下者的常见感染。一些放线菌和藻类引起的感染也纳入真菌病当中，包括放线菌病、诺卡菌病和无绿藻病等，在我国均有报告，但是病例数较少，除了这类疾病本身发病率较低以外，可能限于菌种鉴定的水平，与人们不能确定致病菌种有关。
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
浅部真菌感染诊断治疗进展
北京大学第一医院皮肤性病科 王爱平
http://www.cmechina.net/content//02/images/01.jpg
& & 一、浅部真菌感染的诊断
& & 浅表真菌病是皮肤科常见病和多发病，根据临床表现、直接镜检、真菌培养、Wood’s灯检查和组织病理可以明确诊断。直接镜检很重要，取材处先用酒精消毒，然后刮取皮损边缘鳞屑、甲深层组织碎屑，或拔取断发，或挤压毛囊。浮载液一般采用10%-20%KOH液，也可加入5%Parker墨水，也可加入氯唑黑E(chlorazole black E)，可增加阳性率。培养使用SDA(Sabouraud Dextrose Agar)斜面或平皿培养，培养基中加入0.05%氯霉素，加或不加0.05%放线菌酮。根据形态学、生理生化特征，以及其他培养基和各种试验来鉴定菌种。真菌菌种鉴定有助于了解疾病的性质、指导用药，以及判断预后、积累流行病学资料。组织病理检查对深部真菌更重要，甲真菌病理检查也在研究之中。常规HE染色只有曲霉、接合菌等染色好，其他如念珠菌染色不良，须特殊染色，如PAS、GMS、Gradly等。
二、头癣及体股癣与花斑癣的治疗
http://www.cmechina.net/content//02/images/index_travel.gif
& & 对于真菌感染的诊断，无非是临床表现结合常规的检查。应当注意，头癣与花斑癣、体股癣等相应的用药及治疗方案。
& & 头癣的治疗仍采用综合疗法。灰黄霉素为首选药物，儿童15-20mg/kg,d(微粒体15-25mg/kg,d)，成人0.6-0.8g/d，分3-4次口服，同时进高脂餐，疗程3-4周或更长。特比萘芬可用于2岁以上儿童。体重&40kg者，口服250mg/d；体重在20-40kg者，口服125mg/d；体重
http://www.cmechina.net/content//02/images/index_travel.gif
& & 对于甲真菌病的治疗，应认识到外用药物仅是系统用药的辅助手段；结合其他的一些方法，采用联合治疗的措施，才能有更好的效果。
三、甲真菌病的治疗
& &最早用于甲真菌病治疗的系统性口服药物是灰黄霉素 。它对趾甲真菌病的治愈率仅为15%-30%，而且只对皮肤癣菌甲感染有效，副反应较大，疗程长。之后口服酮康唑治疗，其治愈率与灰黄霉素相似，但抗菌谱较广泛，对皮肤癣菌和酵母菌感染均有效，但副反应较大，尤其是肝坏死，目前已不再用于甲真菌病的治疗。新型系统性广谱抗真菌药物特比萘芬、伊曲康唑和氟康唑的出现，大大改变了甲真菌病的治疗前景，治愈率可以达到70%以上，副反应的发生率和严重性显著下降，疗程亦明显缩短。目前为临床广泛应用，主要用于甲损害严重、广泛、局部用药效果不佳者。
http://www.cmechina.net/content//02/images/03.jpg
& & 特比萘芬采用连续疗法，250mg/d，指甲真菌病疗程6周，趾甲真菌病为12周。或250mg/d连服1周，以后隔日口服250mg，总量同前。伊曲康唑采用冲击疗法，每月第1周服药，每日服400mg（分两次），指甲真菌病口服2-3个冲击，趾甲真菌病为3-4个冲击。注意应在餐后服药以促进药物吸收。一直以来氟康唑治疗甲真菌病剂量和疗程未固定，可以采用间歇冲击疗法治疗，150-450mg/周，疗程对指甲真菌病4-6个月；对趾甲6-10个月。
& & 单独应用外用抗真菌药物治疗甲真菌病，其系统不良反应轻微，但一般只用于感染部位表浅、单个甲感染面积小于30%以及无甲母质受累的较轻感染。因此，外用抗真菌药物更多的是作为甲真菌病系统治疗的辅助用药。外用药物主要包括：外用抗真菌制剂、防腐剂、消毒剂、角质剥脱剂和染料等。但由于甲的特殊结构，使得大多数药物难于渗透入甲板，无法发挥其抑菌或杀菌活性。在临床上更多的是作为系统治疗的辅助用药。到目前为止。单独应用治疗甲真菌病的外用药物有8%环吡酮甲涂剂、5%阿莫罗芬甲涂剂和28%噻康唑溶液。另外1%硝酸硫康唑溶液、1%硝酸益康唑溶液和联苯苄唑甲药盒在甲真菌病的治疗上也取得了一定的效果。8%环吡酮甲涂剂：用药时将患甲尽量剪短，尽量锉薄，在指甲表面均匀涂一层甲涂剂，下次涂药前，用酒精棉把上次的药物擦去，再重复上述过程。第一个月，隔日1次；第二个月，每周2次；第三个月到治疗结束，每周1次。指甲真菌病连用6个月，趾甲真菌病为9-12个月。5%阿莫罗芬甲涂剂：每周外用1-2次，疗程同前。28%噻康唑溶液：每日外用2次，疗程同上。
http://www.cmechina.net/content//02/images/04.jpg
& & 外科拔甲复发率高且容易损伤甲母质，目前已不单独应用。化学拔甲是指在甲上外用角质剥脱性药物剥除甲板的过程。临床常用的角质剥脱剂是尿素软膏，浓度从10%-40%，一般浓度越高，剥脱效果越好；应用同时含有尿素和水杨酸的软膏也可剥除甲板；常常采用封包疗法。此法对于甲床部位和甲母质的真菌感染治疗效果不佳，因此将抗真菌药物与尿素软膏混合应用取得了较好的临床疗效。目前有1%联苯苄唑和40%尿素软膏混合制剂、2%布替萘芬和20%尿素软膏混合制剂和2%托萘酯和20%尿素软膏混合制剂。
& & 口服药物通过甲母质、甲床到达甲板，外用药物通过甲板到达甲床。因此浅表白甲型（SWO）、远端侧位型（DLSO）和甲板内型（EO）可单独外用药治疗，近端甲下型（PSO）和全破坏型（TDO）则以系统用药为主，辅以外用疗法。但临床上存在着一些难于治疗的类型，如严重甲分离型、侧缘型、皮肤癣菌瘤、纵纹形成、甲半月受累和甲板严重增厚的甲真菌病，此时采用联合疗法治疗将是十分必要的。可采用内科疗法合并外科疗法、系统治疗合并局部治疗、系统治疗合并系统治疗。
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
常见深部真菌感染
北京大学第一医院 皮肤性病科 余 进
& & 深部真菌感染的病原菌可大致分为两类，一类是真正的致病真菌，可以感染健康人，这类感染比较罕见；另一类是条件致病真菌，包括念珠菌、曲霉、隐球菌和接合菌等，常常感染免疫受损患者，引起深部真菌病。条件致病真菌感染在临床中比较常见，尤其是近年来免疫受损患者的增加，使得其发生率逐年上升。
一、深部念珠菌感染
http://www.cmechina.net/content//03/images/index_travel.gif
& & 条件致病菌感染感染患病者多有潜在的疾病或免疫力受损的诱因，防治先应从根本上着手，积极治疗原发病，提高机体免疫力和应用抗真菌药物。
& & 深部念珠菌感染是由念珠菌属的真菌（白念珠菌为主）引起内脏器官的急性或慢性感染，是临床最常见的深部真菌感染类型。念珠菌属在正常情况下广泛分布于自然界和人体口腔、胃肠道、阴道黏膜及皮肤上，在免疫受损情况下，如大量使用广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂以及患AIDS和肿瘤等，很容易发生深部念珠菌感染。
& & 深部念珠菌感染种类很多，根据累及脏器不同可分为消化道念珠菌病、支气管、肺念珠菌病、心血管系统念珠菌病、念珠菌性脑膜炎、泌尿系念珠菌病、子宫内念珠菌病、骨骼肌肉系统念珠菌病、眼念珠菌感染。另外，念珠菌还可引起播散性感染，最常见的是念珠菌血症，以及急性和慢性播散性念珠菌病。
http://www.cmechina.net/content//03/images/01.jpg
& & 消化道念珠菌病主要为念珠菌性食管炎及肠炎。食管炎在AIDS或癌症患者放化疗后常见。肠炎儿童较成人发病率高。肠炎导致的肠黏膜受损可以使感染播散入血。支气管、肺念珠菌病系从口腔直接蔓延或经血行播散而来，多为继发感染。除肺部症状外，胸片可见大小不等、形状不一的均匀阴影，很少波及肺尖。在病程中阴影常有变化，不同时期阴影可消退或增加。念珠菌性脑膜炎常由呼吸道和消化道病灶播散而来，1/3患者发病前有鹅口疮史。症状与一般细菌性脑膜炎类似。心血管系统念珠菌病可表现为心内膜炎、心肌炎、心包炎和其他循环系统感染。心内膜炎常并发于心瓣膜病，也可见于心脏手术，尤其是人工瓣膜置换术，心导管检查及长期静脉保留导管者和静脉毒瘾者。特异性的诊断包括大的赘生物、大血管栓塞和内眼炎。
& & 泌尿系念珠菌病一般通过两条途径感染：
& & ●上行性感染，如持续保留导尿管或不洁器械检查等；
& & ● 血行播散。
& & 约80%的播散性念珠菌病会发生肾念珠菌病，常导致脓肿形成，继则坏死。子宫内念珠菌病一般认为是病原菌经母亲生殖道上行感染所致。表现为脐带表面散在的多发的黄白色小病灶，某些情况下，感染累及胎儿。骨骼肌肉系统念珠菌病包括骨髓炎、关节炎和肌炎，常常是血行感染播散的结果。眼念珠菌感染包括角膜炎和内眼炎，念珠菌性角膜炎最常见的症状包括疼痛、眼红、畏光和视力模糊，分泌物不常见。念珠菌性内眼炎可为眼外伤的并发症，但更多继发于病原菌的血行播散。
& & 念珠菌血症为一次或多次血培养阳性但无器官受累的证据，最常见于血管导管留置的患者，常表现为发热、寒战或低血压。急性播散性念珠菌病是一种来势凶猛，危及生命的感染。常表现为持续性发热，广谱抗生素治疗无效，主要表现为皮损和内眼炎。还可累及其它多脏器。慢性播散性念珠菌病是一种隐匿性疾病，又称肝脾念珠菌病，常发生于白血病患者化疗治疗缓解后。
& & 深部念珠菌感染的实验室检查有真菌学检查、血清学方法和组织病理学检查。真菌学检查标本直接镜检可见成群芽孢和假菌丝。在念珠菌正常分布区，真菌培养结果阳性需慎重对待，应该结合临床表现，并进行多次培养。血培养阳性有助于诊断播散性念珠菌病。用改进的解离离心法可提高阳性率。β葡聚糖检测、念珠菌烯醇化酶检测以及念珠菌代谢产物的检测可早期诊断深部念珠菌病。组织病理学检查有确诊意义。
& & 常选用药物有氟康唑、伊曲康唑、伏力康唑和两性霉素B等。
二、隐球菌感染
& & 隐球菌病是由新生隐球菌引起的条件致病性真菌感染。隐球菌广泛分布于自然界中，在鸽子的排泄物中含量最高。隐球菌可通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体，主要引起中枢神经系统、肺和皮肤的病变，严重时可危及生命。近年来免疫力降低的病人逐年增多，本病发病率也呈上升趋势，也是艾滋病人死亡的主要原因之一。
& & 根据受累部位不同可分为：肺隐球菌病、中枢神经系统隐球菌病和其它系统的隐球菌感染。由于肺常常是隐球菌的入侵门户，故肺部感染可能是隐球菌病的最早表现。但症状较轻微，可类似于上呼吸道感染或支气管肺炎。中枢神经系统感染是隐球菌感染中最常见的类型，可分为脑膜炎型、脑膜脑炎型、肉芽肿型和囊肿型等，类似于结核性或病毒性脑炎及颅内占位病变的表现。另外，隐球菌感染还可累及皮肤黏膜、骨、关节、肝、眼、肌肉、心脏、睾丸、前列腺等器官，严重者可发生隐球菌菌血症播散至全身各器官甚至引起死亡。
& & 实验室检查包括墨汁染色、乳胶凝集试验、真菌培养和组织病理检查。墨汁染色检查脑脊液或其它病灶分泌物可见圆形或椭圆形带荚膜的厚壁酵母细胞和无芽胞无菌丝的发芽真菌。乳胶凝集试验可检测脑脊液或血液中隐球菌荚膜抗原，具有良好的敏感性和特异性。真菌培养和组织病理检查可以帮助确诊。
& & 隐球菌病均应系统性用药治疗，疗程较长，一般需3个月以上，AIDS患者甚至需要终生用药。另外应注意寻找发病诱因，及时纠正全身免疫低下的状况，治疗原发病。常选用药物包括两性霉素B、氟康唑和5－氟胞嘧啶。目前两性霉素B仍然为该病的首选药物。新型两性霉素B脂质复合物，以降低不良反应。氟康唑具有很强的穿透血脑屏障作用，且毒副作用较小，目前已成为中枢神经系统隐球菌病的首选替代药物和维持用药。5－氟胞嘧啶常与两性霉素B联合用药。
三、深部曲霉感染
http://www.cmechina.net/content//03/images/02.jpg
& & 曲霉感染临床上主要包括过敏性曲霉病、菌落定植（曲霉瘤）及侵袭性曲霉病。曲霉病好发部位为肺、可致肺组织的广泛破坏。侵袭性损害可达中枢神经系统、皮肤等部位，有时也可发生于鼻部和眼部，严重者可危及生命。
& & 肺部曲霉感染常见的有肺曲霉瘤、慢性坏死性肺曲霉病和急性侵袭性肺曲霉病。
& & 肺曲霉瘤见于肺部原有扩张的支气管和因肺结核、结节病、尘肺等形成的空洞内，多位于肺尖，曲霉在这些空腔或空洞内形成紧密的菌丝团块。患者一般无症状，但可有慢性咳嗽、不适和消瘦等，咯血为最主要的并发症。约10%曲霉球会自行消失。胸片为均匀不透明区，上部及周围有透光的环形或半月形示有空气，称新月征。CT扫描对肺曲霉球有很高的诊断价值，能显示不同发育阶段的曲霉球。典型图像为新月形的空气环包绕一团致密影。
& & 慢性坏死性肺曲霉病常见于中老年患者，并伴有基础性肺部病变，如非活动性肺结核、支气管扩张、结节病或尘肺。还可有其他疾患，如酗酒或糖尿病，可导致轻度的免疫功能受损，或长期接受小剂量的糖皮质激素治疗。临床表现类似于肺曲霉瘤，有时会合并肺曲霉瘤。
& & 急性侵袭性肺曲霉病常发生于免疫受损个体，可危及生命。高危人群包括中性粒细胞缺乏患者、肿瘤、器官移植、AIDS病及儿童慢性肉芽肿病。最多见的临床表现是持续性发热，广谱抗生素治疗无效。胸膜炎、胸痛和咳嗽常见，但咯血不常见。胸部CT扫描有早期诊断价值，其特征的影像为有空洞的小结节样损害并向外周扩大。通常可见到一独特的低透光带(晕轮征)围绕着结节损害。在空洞损害内可见特征性的新月形气影。经皮肺组织活检供微生物学和组织病理学检查可以帮助诊断。
& & 实验室检查包括真菌学检查，组织病理检查，血清学检查以及早期CT扫描。真菌镜检痰及损害分泌物涂片可见分隔的粗大菌丝。真菌培养应该连续反复进行。组织病理检查有确诊意义。针对曲霉半乳甘露聚糖的血清学检查用于侵袭性曲霉感染的早期诊断，特异性好。影像学检查可辅助诊断。对曲霉DNA的PCR检测具有较高的灵敏性和特异性，是一种很有前途的早期诊断方法。
& & 对于侵袭性曲霉感染，两性霉素B仍为最有效药物。可与5－氟胞嘧啶合用。还可采用伊曲康唑，伏力康唑、卡泊芬净等。对曲霉瘤最有效的措施是手术摘除。
& & 目前，念珠菌、隐球菌和曲霉仍是临床上最常见的条件致病真菌，可以占到全部条件致病真菌感染的90%以上。但是，由于免疫受损患者人数的增多，新的条件致病真菌种类不断出现，在掌握常见深部真菌感染特点的基础上，也不能忽略其它少见机会真菌致病的情况。
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
分子生物学方法在真菌感染诊断中的应用
北京大学第一医院 李东明 李若瑜 王端礼
& & 真菌感染的诊断以往主要以形态学为依据，即通过培养或者直接镜检阳性为指标。近年来，随着免疫学、生物化学及分子生物学技术的发展，各种检测手段不断被应用于真菌病诊断及菌种鉴定中；分子生物学技术的应用更使得从分子水平上诊断真菌感染成为可能，并可使感染菌种的确立与快速诊断一步完成。
& & 利用分子生物学技术从分子水平上诊断真菌感染具有以下特点：⑴特异性好、敏感性高；⑵快速、便捷，并能迅速鉴定至种，为选择合适的治疗方式提供依据。
一、多聚酶链式反应（PCR）
http://www.cmechina.net/content//04/images/01.jpg
http://www.cmechina.net/content//04/images/index_travel.gif
& & PCR方法的应用，使得侵袭性真菌感染的早期诊断成为可能，为这些病人的治疗提供了理论依据。
& & PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促方法，可用于扩增位于两段已知序列之间的DNA，其原理不必赘述。而改进的PCR技术如巢式PCR（nested PCR）、多重PCR（multiplex PCR）、荧光PCR技术等则又在较大程度上增加了该技术的敏感性与特异性。近年来，PCR方法已渗透至临床检测的各个领域，并逐渐应用于真菌病的诊断中。
& & 确定真菌感染可用常规PCR，引物设计自真菌的保守序列；若判定感染真菌的种类则需应用属种等的特异性引物。前者多取自核糖体蛋白基因（rDNA）及其转录间隔区（ITS），比较成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9、ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等；后者则根据属种间高变区或者特异基因设计而成，直接鉴定至种或群，这样既满足了临床菌种鉴定的需要，还可用于流行病学调查。
& & 早在数年前就有学者将PCR方法用于菌种的鉴定
http://www.cmechina.net/content//04/images/02.jpg
，研究最多的为念珠菌属和曲霉属，如Jaeger 在18S RNA 基因部位设计了三条种特异性引物，应用巢式PCR对眼睛分泌物进行了检测，在3例培养阳性的标本中均为阳性，然而，在1例培养阴性的标本中，PCR检测为阳性，为早期用药提供了时机。该方法可以检测到50 to 100 fg的水平，其敏感性远较传统的真菌培养方法敏感。
& & Aspergillus flavus, A. fumigatus, 和 A.terreus是侵袭性曲霉病的三种主要致病菌，其侵袭力、病死率及对抗真菌药物的敏感性均存在较大差异，从种的水平上进行鉴别较为困难。美国作者Henry应用特异引物对曲霉的这三种主要致病菌种进行了鉴定，在对11份临床标本进行的双盲试验中，PCR方法与形态学方法取得了较好的一致性。Zhao等应用巢氏PCR技术将曲霉的主要致病菌种烟曲霉进行了扩增，并对其特异性及敏感性进行了试验，取得了较大的成功；李等对暗色丝孢霉病的主要致病菌种皮炎外瓶霉进行了研究，种特异引物对这一亲神经性真菌进行了成功地扩增。另外，在临床实践中，经常可以发现有些镜检阳性的感染经多次培养仍不能获得阳性结果，应用PCR等分子生物学方法不仅可以协助诊断，还可获得流行病学资料。
二、分子杂交（molecular nucleic acid hybridization）
http://www.cmechina.net/content//04/images/index_travel.gif
& & 本节中您将看到分子杂交技术的原理、常用的一些方法以及这些方法各自应用的特点。
& & 1．原理
& & 分子杂交技术是近年来用于真菌检测的方法之一。其基本原理是根据两条同源单链核酸在一定的条件下（适宜的温度和离子浓度）发生按碱基配对形成双链的原理，通过将标记的核酸作为探针（probe），与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到标本中核酸中相应的基因。杂交的双方是待测核酸序列及探针（或者为抗原及抗体）。在临床真菌检验中，待测核酸序列可以为真菌基因组DNA和细胞总RNA，将核酸从细胞中分离纯化后或者经PCR获得的基因片段可以在体外与探针杂交（膜上印迹杂交），也可以直接在细胞内进行（细胞原位杂交）。用于检测的已知核酸片段叫做探针，为了便于示踪，必须将探针用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。
& & 2. 种类
& & ⑴ Southern blot
& & DNA分子经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，将所得的DNA片段按分子量大小分离，放入碱性溶液使其变性，再将变性后单链DNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用标记的核酸探针与膜上的核酸片段进行杂交，最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示探针的位置。主要用于真菌病的诊断和菌种的分型、还可用于监测耐药菌株、流行病学分型等。近年来，这方面的研究逐渐增多，如Gabal等曾用黄曲霉特异性探针从混有各种曲霉（Aspergillus spp.）、青霉（Pencillium spp.）、酵母（yeasts）、细菌、病毒的呼吸道分泌物中成功地检测到了黄曲霉；再如Muller等在对一HIV阳性家庭成员所患的念珠菌进行研究时发现，从母女三人分离的三株白念珠菌基因型完全相同。有作者曾用Ca3探针对院内感染真菌进行了研究，发现90%以上的病人分离菌株和医务人员分离株具有相同的基因型。
http://www.cmechina.net/content//04/images/03.jpg
& & ⑵ Northern blot
& & Northern blot是经典的RNA分析法（用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析），提取细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移至纤维膜上与探针杂交。主要观测各种基因如致病基因、耐药基因等转录产物量及其变化。Lopez-Ribot等在应用Northern blot对口咽部念珠菌病患者进行研究时发现，分离自同一病人的菌株对羊毛甾醇去甲基化酶的表达量有所不同，因而推断真菌在感染过程中可以通过不同的机制发展成为耐药菌。
& & ⑶ Western blot
& & 这是一种将蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，原位转印至膜，再进行免疫测定的技术。常用于检测组织间真菌蛋白代谢产物差异、抗原决定簇、血清中的抗体等。在系统性真菌感染的早期，Western blot要较一般的免疫沉淀、补体结合等方法敏感得多。有作者在对早期隐性组织胞浆菌感染进行检查时发现，前者的阳性率可提高到90%以上，而后者只有45%。Kopecek在研究须癣毛癣菌时应用Western blot方法对不同温度及CO2分压时菌丝中蛋白含量进行了测定，发现不同条件时蛋白分子表达有较大差异，认为在须癣毛癣菌，部分热休克蛋白可能参与了致病作用。
http://www.cmechina.net/content//04/images/04.jpg
& &⑷ 原位杂交（in sito nucleic acid hybridization）
& & 应用标记的已知核酸作为探针对细胞或组织切片中的核酸进行杂交并检测的技术。由于该方法特异性高，并可以准确定位，近年来，已较多地应用于各种真菌病的活体组织检查中。特别是当应用种特异性引物时，可以将病原菌一步鉴定至种。目前，越来越多的特异性探针正在逐渐问世，给临床真菌检测带来了极大的方便。美国学者Zimmerman在研究侵袭性肺曲霉病时发现，应用rRNA探针，从细胞学角度检测可在1h内出结果，而培养方法则至少要1周。在4例原位杂交阳性的临床标本中，三份在1周后曲霉培养阳性；北京大学真菌和真菌病中心在对念珠菌病研究时，也显示该方法较其他病理染色方法要敏感得多。目前，该中心正在致力于曲霉、暗色真菌等的研究，有望在不远的将来，能将该项技术应用于临床检验中。
三、随机扩增多态性分析DNA（RAPD）
& & 1．原理
& & 应用随机合成的单个寡核苷酸（8－12bp，多为10bp）作为引物，经PCR将模板DNA进行扩增，采用低退火温度使引物与模板DNA在可能有一或两个碱基错配的情况下结合而形成扩增产物。扩增循环次数要求较多，一般为35－45个。特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型。
& & 2．应用
& & 应用RAPD方法对致病菌种进行分型及流行病学研究的较多，几乎囊括了所有的致病菌种，如外瓶霉、皮肤癣菌、念珠菌、曲霉等。研究中发现，致病菌种的分型与分离部位、致病性以及自然栖息地等因素具有一定的关联性。在一肾移植医院的侵袭性肺曲霉病（invasive aspergillosis, IA）暴发流行期间，Aufaure-Brown等应用RAPD方法对分离出的烟曲霉进行了检测，结果表明这两个患者由不同的菌株所感染，而且这两个分离株与该医院环境中所分离到的11个菌株均不相同；在另一IA暴发流行调查中，发现三例患者在各自的感染的一个月内分离出的烟曲霉菌株分别用三种方法显示具有相同的分型，因此这些患者很可能由同一个菌株所感染，然而当时从医院环境中分离出的菌株却与分离自患者的菌株不同，尽管广泛采样仍未发现相同的菌株。
四、限制性片段长度多态性分析（RFLP）
http://www.cmechina.net/content//04/images/index_travel.gif
& & RFLP的方法对于鉴别真菌的类型具有较好的特异性及敏感性。而SSCP则可从基因突变的情况来判断致病或耐药株。
& & 1．原理
& & RFLP是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA进行切割，然后进行凝胶电泳，依据片段大小不同将其分离开。由于不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，从而产生的DNA片断长度呈现多态现象。传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳
http://www.cmechina.net/content//04/images/05.jpg
分离后再结合Southern 印迹杂交，应用该方法可以构建DNA 指纹图，这种方法特异性及敏感性均较高，但相对来说，操作较为烦琐。目前常用的是AP-RFLP（amplicon-RFLP）。对于真菌来说，根据多态性结果便可鉴别出不同的属、种或型。
& & 2．应用
& & RFLP主要用于真菌的分类分型研究，也可用此对临床分离菌株进行鉴定，这方面的研究已有许多报到。DNA指纹图可以快速筛选致病株，曾有学者比较了5株引起医源性感染的白念珠菌菌株的EcoRⅠ指纹图谱，并以大量散发菌株作为对照，通过与其它方法比较发现，DNA指纹图多态性最高。北京大学皮肤科用该方法对暗色真菌外瓶霉进行了研究，将四种内切酶结果综合分析，可以得到种特异性图谱，给外瓶霉菌种鉴定提供了便捷的方法。国外学者已将该方法用于流行病学分析，如Girardin等曾对一组侵袭性肺曲霉（IA）病进行过研究，发现从所有IA患者分离的菌株均具有相同的基因型，并且还证实了其中一例IA患者的感染来源于病房，给院内感染问题敲响了警钟。
五、单链构象多态性分析（SSCP）
& & 1．原理
& & 单链构象多态性分析是指将PCR扩增得到的DNA片断进行变性，成为单链DNA，在一定的条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA进行分离。由于单链DNA的空间构象与分子内的碱基组成密切相关，一个碱基的差异即可形成不同的构象，不同构象的DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速率不同，形成的带型即不相同，故能反映出单链DNA片段的多态性。
& & 2．应用
& & SSCP技术常用于检测单个基因的突变，近年来已被应用于医学真菌的检测鉴定，该方法对于判定致病株与非致病株、耐药株与非耐药株，以及相近属种的鉴定等均具有一定的意义。该方法灵敏度较高，应用较为广泛。如在对致病真菌进行检测时，扩增自核糖体基因的197bp片段可以将曲霉鉴定到属的水平，并可一次性对烟曲霉和黄曲霉进行鉴别。
六、电泳核型（EK）分析
& & 1．原理
& & 电泳核型是指细胞中的染色体在一定电场作用下在固体包埋物中的排列情况，反映了染色体的大小、数目和形状的差异。它是通过脉冲电场凝胶电泳（PFGE）完成的，能分辨50kb至 10Mb范围内的DNA分子，基本满足酵母菌和丝状真菌的要求。对病原体而言，EK分析特别适用于低等真核微生物或原虫，它无需用RE消化和探针杂交，就可方便地从EK的差异区别不同的菌种。
& & 2．应用
& & 电泳核型技术已用于临床菌株鉴定，如刘等对23株新生隐球菌标准株和临床分离株的电泳核型，发现新生隐球菌染色体数目新型变种为10或12条，格特变种及上海变种为11条，大小在 0.4～2.1Mb之间。作者同时发现新生隐球菌的EK与其血清型有较好的相关性，同一血清型往往有相似的EK带型。Magee等分析了5株白念珠菌及5种其它念珠菌的核型，发现5株白念珠菌的染色体带型均彼此不同，并分离出9～10条染色体带，同时确定类星形念珠菌的染色体数为9，光滑念珠菌为10，而季也蒙念珠菌仅为6。EK分析带型清晰易辨、分辨力较强，电泳条件稳定时结果重复性好。但EK受电泳条件影响较大，影响不同实验室间的可比性，而且相同大小两条不同染色体往往因迁移率相近呈现为同一条带，影响分辨力。此外它需要昂贵的仪器，DNA的制备及PFGE过程也均较费时。
七、DNA序列分析（DNA sequencing）
http://www.cmechina.net/content//04/images/index_travel.gif
& & DNA序列分析对于了解真菌的基因状况具有十分重要的意义；可用于设计探针及特异引物等，从可更有效地对真菌疾病进行诊断。
& & 1. 原理
& & 将待测DNA片段转变成一系列的放射性核素标记的单链寡核苷酸，并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同，成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中，寡核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中，从放射自显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中，就可以直接读出DNA的序列。
& & 2. 应用
http://www.cmechina.net/content//04/images/06.jpg
& & 在医学真菌中，DNA序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义。该方法可用于设计探针、特异引物等对真菌病进行诊断。序列的确定是对致病真菌的分类鉴别的重要手段。目前应用最多的为核糖体内转录间隔序列、几丁质合成霉等。
八、基因芯片技术
& & DNA芯片技术是用免疫荧光标记的待测样品与与有规律的固定在芯片片基上的大量探针按碱基配对原则进行杂交，通过激光共聚焦荧光系统对芯片进行扫描，使用计算机进行荧光信号强度的比较和检测的技术。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。将不同属种真菌的特异性DNA标记后制成DNA芯片，将致病真菌DNA与DNA芯片杂交就可得到属种特异性图谱，通过这种图谱的比较和分析，就可得出致病菌的DNA信息，进而可对其进行鉴定。
& & 分子生物学技术的发展已经渗透到真菌研究的各个领域，不但使真菌病早期诊断成为可能，而且可在确立真菌感染的同时迅速判断出致病菌的种类，指导治疗，提示预后。
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
抗真菌药物治疗新进展
北京大学第一医院皮肤科 刘 伟 李若瑜
http://www.cmechina.net/content//05/images/01.jpg
& & 一．多烯类
http://www.cmechina.net/content//05/images/index_travel.gif
& & 多烯类抗真菌药仍是目前治疗真菌感染最常用的药物。本节中应注意二性霉素B与其脂质剂型在疗效等方面的比较。
& & 多烯类抗真菌药物通过直接结合于真菌细胞膜上的麦角固醇，造成细胞膜对单价和二价阳离子的通透性增加，而最终导致细胞死亡。常用药物有脱氧胆酸二性霉素B、脂质型二性霉素B等。
& & 1．脱氧胆酸二性霉素B
& & 传统的脱氧胆酸二性霉素B，商品名Fungizone，是来源于结节链球菌的多烯类抗真菌药物，体外药物敏感性试验表明，该药抗菌谱广。对多种致病性酵母如念珠菌属、新生隐球菌、糠秕马拉色菌等，多种霉菌如曲霉属、外瓶霉、多种接合菌等，以及双相真菌如组织胞浆菌、马尔尼菲青霉、申克氏孢子丝菌等，都有良好的体外抑制作用。40多年来，二性霉素B广泛应用于念珠菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病、曲霉病、球孢子菌病、副球孢子菌病以及其它一些透明丝孢霉病和暗色丝孢霉病的治疗。即便当前，它仍然是治疗免疫抑制患者系统性真菌感染最好的抗真菌药物。然而，由于传统的脱氧胆酸二性霉素B有严重的副作用如肾毒性和急性输入毒性，而使得临床应用受到限制。人们为了降低其副作用，对传统的二性霉素B进行了化学结构上的改造，其标志便是脂质型二性霉素B的问世。
& & 2．脂质型二性霉素B
& & 发展脂质型二性霉素B主要是基于这样一种概念，即脂质结构使得整合于其中的该药被网状内皮系统大量摄取，进而弥散到肝脏、脾脏、淋巴结，与此同时肾脏和骨髓中的药物水平明显降低，因此，在发挥其高效抗真菌作用的同时又降低了对机体的副作用。目前在美国和西欧的临床上应用的脂质型二性霉素B，主要有三种类型：脂质体二性霉素B（L-AMB），二性霉素B脂质复合体（ABLC）、二性霉素B胶体散（ABCD）；它们和脱氧胆酸二性霉素B在分子结构、分子大小以及一些药物动力学上的比较见
http://www.cmechina.net/content//05/images/02.jpg
& & 在临床疗效方面，已经有作者对脂质型二性霉素B和传统二性霉素B进行了比较研究。对比L-AMB和AMB的随机研究表明，前者对于侵袭性真菌感染的疗效较后者更好，而且L-AMB明显降低了肾毒性的发生，血肌酐升高的水平较低，很少有患者放弃治疗。在另一项多中心临床研究中，702名接受化疗的白血病、淋巴瘤、其它癌症或者是进行骨髓及外周血干细胞移植的患者，给予经验性抗细菌治疗至少5天但仍然有发热和白细胞数低下时，L-AMB治疗组（剂量为3.0mg/kg/d）发生真菌感染者（11名患者，3.2%）较AMB治疗组（剂量为0.6mg/kg/d）（发生真菌感染者27名，7.8%）明显为低。而且，与AMB治疗组相比，L-AMB治疗组发生输入相关性发热、寒战、低血压、高血压、缺氧等反应者很少。White等人还报告的一项比较ABCD（4.0mg/kg/d）和AMB（0.8mg/kg/d）经验性治疗中性白细胞数低下的发热患者的随机双盲研究结果表明，196名受试者，经ABCD治疗者50%有效，经AMB治疗者43%有效，然而ABCD组中肾功能不良的发生显著要低。
& & 这些研究说明，脂质型二性霉素B与传统二性霉素B的临床疗效相似，但是毒副作用明显要少；不过应当注意的是，由于费用太昂贵，建议脂质型二性霉素B只用于对传统二性霉素B效果不佳或者耐受性不好的患者。Walsh等人进行的药物经济学分析表明，从开始抗真菌治疗到结帐时为止，接受L-AMB治疗的患者费用明显增高，因此L-AMB的选择应当从患者的治疗费用和能否发展为肾功能不全的风险两方面进行考虑。
& & 3．脂质体制霉菌素
& & 动物模型研究表明，对于不能耐受传统二性霉素B或者传统二性霉素B疗效不佳的中性白细胞数低下的小鼠曲霉病，和一些非中性白细胞低下的侵袭性曲霉病和念珠菌病患者，脂质体制霉菌素都有疗效。但是，用脂质体制霉菌素治疗中性白细胞数低下发热的癌症患者的临床试验，尚未见到发表；可能脂质体制霉菌素，可以作为二线药物治疗其它抗真菌药物不能耐受或无效的难治性曲霉病或者念珠菌病。
http://www.cmechina.net/content//05/images/index_travel.gif
& & 唑类抗真菌药是另一广泛应用于临床的药物。本节中应注意常用的三种药物氟康唑、伊曲康唑、Voriconazole的抗菌谱及相应的副作用。
& & 唑类药物通过抑制真菌细胞色素P450去甲基酶而引起羊毛固醇的积聚以及麦角固醇的缺乏，从而导致细胞膜功能障碍而发挥抗真菌作用。这类药物在目前的临床应用十分广泛，常见者有氟康唑、伊曲康唑、Voriconazole等，见
& & 1．氟康唑
& & 氟康唑商品名Diflucan，是低分子量、水溶性唑类抗真菌剂；既可以口服也可以静脉注射。对大多数念珠菌和隐球菌有良好的抑制作用，对克柔念珠菌和光滑念珠菌天然耐药，对曲霉和其它霉菌无抑制活性；口服吸收良好，生物利用度超过90%；而且其吸收不受食物和胃内pH值的影响，1-2小时达到血浆峰值。血清蛋白结合少，绝大多数以游离药物的形式出现于循环中，并且以原型从尿中排出，因此肾脏功能不全的患者应当调整剂量。
& & 对于中性白细胞低下和不明原因发热的免疫受损患者，氟康唑和二性霉素B经验性治疗的疗效相似，但是二性霉素B治疗者更多见肾赃功能受损；对于无严重免疫抑制的稳定性念珠病血症，氟康唑较二性霉素B毒性为小，疗效相似，但是对于非白念珠菌性念珠菌病血症，氟康唑较二性霉素B效果为差。
& & 近年来，由各种致病性丝状真菌引起的感染日见增多，侵袭性曲霉病更成为免疫受损患者中仅次于念珠菌病的第二位的致死性感染。因此，改造传统唑类药物，发展更加广谱的对各种致病性丝状真菌有良好抑制作用的新型唑类药物，成为另外一种重要趋势；伊曲康唑，Voriconazole等药物的出现，正体现出这一特点。
& & 2．伊曲康唑
http://www.cmechina.net/content//05/images/04.gif
& &伊曲康唑，商品名Sporanox，是不溶于水的三唑类抗真菌药物；剂型有口服胶囊，羟丙基倍他环糊精口服液（伊曲康唑在这种寡糖载体中的溶解性增加）以及近来批准用于临床（右旋糖苷溶液）的伊曲康唑静脉注射液。
& & 口服伊曲康唑（胶囊和口服溶液）1.5-4.0小时，可达到血浆峰值；伊曲康唑高度结合血浆蛋白，经过肝脏广泛代谢后，经尿液和胆汁排出体外；肾功能不全和血液透析不影响伊曲康唑的代谢，因此不必调整剂量；预防性应用时，应当监控血浆药物水平，保证血浆浓度250-500ng/ml。该药与西沙必利、息斯敏、特非那丁合用时，可以导致严重的心律不齐；与甲基强的松龙、环孢菌素合用时，有潜在的毒性；这些药物间相互作用主要与肝脏CYP3A4酶受抑制有关。长期应用伊曲康唑还可能有心肌病变。
& & 最近欧洲一项开放多中心研究的结果表明，对于侵袭性曲霉病的治疗，静脉输入伊曲康唑后接着口服是安全、可靠而且有效的，因此，伊曲康唑可以作为治疗曲霉病的二线药物。对于血液和骨髓抑制的受者，伊曲康唑已经代替氟康唑，预防治疗侵袭性真菌感染。对于抗生素治疗无效的中性白细胞低下的发热的癌症患者，随机静脉给予伊曲康唑与二性霉素B后，再口服伊曲康唑溶液，有效率分别为47%和38%，而且伊曲康唑治疗者由于毒性反应轻，副作用也少。
& & 3．Voriconazole
& & Voriconazole（UK109496）是从氟康唑衍生而来的新型抗真菌药物，目前已经批准用于临床。其抗菌谱广，体外试验表明它对于念珠菌（包括氟康唑耐药的克柔念珠菌和光滑念珠菌）、新生隐球菌、和白吉利毛孢子菌都有良好的抑制活性；对一些霉菌如曲霉、尖端塞多孢子菌、镰刀菌、皮炎芽生菌和荚膜组织胞浆菌都都有抑制作用；但对于接合菌无抑制活性。
& & 口服Voriconazole后2小时内达到血浆峰值，组织分布广泛，甚至可以分布至中枢神经系统（CNS）；平均清除半衰期为6小时，其生物利用度可以达到90%；Voriconazole可以抑制CYP2C19和CYP2C9、CYP3A4等细胞色素P-450-脱甲基酶复合体异构酶。Voriconazole在肝脏进行广泛的代谢，80%-90%药物将以无活性的代谢产物从尿中排出。I期临床试验中，有可逆性视觉紊乱、光敏性红斑，都与剂量有关；有
三．Echinocandins
http://www.cmechina.net/content//05/images/index_travel.gif
& & Echinocandins类抗真菌药其机制不同于前面所述两类；是什么样的作用机制使其毒副作用大大降低了呢？
& & 尽管人们为了降低副作用，拓宽抗菌谱，提高抗真菌能力，而对传统的多烯类和唑类药物进行了改造，发展了一些临床有效的药物如脂质型二性霉素B和新型唑类药物，但是由于这些药物毕竟作用于真菌细胞膜，因而难免引起机体的毒副作用。众所周知，真菌与哺乳动物之间的一个很重要的区别就是有细胞壁，因此，发展以真菌细胞壁为作用靶位点的药物，毫无疑问可以降低对机体的毒副作用；由于这类药物的作用机制独特，毒副作用明显要小，因此，建立在这一指导思想之上的抗真菌药物的研究，具有十分重要的地位，也是目前以至于将来一定时期都在努力的方向。
& & 1970年代人们进行新型抗生素的筛选时，从数种真菌中得到的一族新型抗真菌药物，即棘白菌素(echinocandins)；由于最初发现Echinocandins对卡氏肺孢子虫（Pneumocystis carinii）有抑制作用
http://www.cmechina.net/content//05/images/03.jpg
而被称作Pneumocandins。这类药物作用于真菌细胞壁，通过非竞争性抑制1，3-β-D-葡聚糖合成酶，导致真菌细胞生长过程中细胞壁葡聚糖缺乏，渗透压失常而最终产生真菌细胞溶解。在酵母细胞中还见到细胞膜麦角固醇含量减少，稀醇化酶向生长中的细胞壁整合受抑。这类药物对大多数念珠菌具有快速的杀真菌作用，包括一些对唑类耐药的菌株，对于大多数曲霉有抑真菌作用，对于镰刀菌、接合菌以及新生隐球菌无抑制作用。2001年，美国批准了第一个Echinocandin，即卡泊芬净(caspofungin)的临床应用。目前所有Echinocandins都是经静脉给药，因为半衰期长（10-12小时），每天可以一次；动物模型研究表明，对于曲霉病，Echinocandins与二性霉素B和唑类药物有协同治疗作用。体外试验还提示，Caspofungin与二性霉素B联合应用时对于镰刀菌也有抑制作用。
& & 1．Caspofungin
& & Caspofungin，商品名Cancidas，是第一个被批准用于治疗由于不能耐受其它抗真菌药物，或者其它抗真菌药物疗效不佳的侵袭性曲霉病的Echinocandins类抗真菌药物。Caspofungin对于念珠菌、曲霉等有良好的抑制活性，对于一些双相真菌如组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用，但是对于新生隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等无抑制活性；与其它Echinocandins类抗真菌药物相似，该药有良好的药代动力学特性，如静脉给药等。
& & 一项对比Caspofungin和二性霉素B治疗内镜确诊的念珠菌性食管炎的随机双盲研究表明，50mg/天和70mg/天Caspofungin的治疗成功率为74%和89%，而0.5mg/kg/天二性霉素B的治疗成功率为63%。近来一些研究还提示，在治疗念珠菌病时，Caspofungin的疗效与二性霉素B相似，而毒性更低，尽管目
http://www.cmechina.net/content//05/images/05.jpg
前被批准用于难治性曲霉病的治疗。
& & 2．Micafungin
& & Micafungin是通过对Coleophoma empedri的天然产物进行改造，化学合成得到的新型Echinocandins类抗真菌药物。它对念珠菌如白念珠菌、光滑念珠菌、热代念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌有较好的抑制活性，对于曲霉也有良好的体外抑制活性；与其它Echinocandins类抗真菌药物相似，对于新生隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等无抑制活性。目前该药正在骨髓抑制患者中进行III期临床试验；50-100mg/天的剂量证明临床有效，但是最佳的剂量仍然在探索中。
& & 脂质型二性霉素B，新型唑类药物如Voriconazole，以及作用于真菌细胞壁的药物如Echinocandins类的问世，反映了抗真菌药物研究中朝高效、广谱、低毒的方向发展的一个特点，无疑为各种类型真菌感染的药物治疗提供了新型的有力的手段；传统的抗真菌药物如脱氧胆酸二性霉素B和氟康唑等相比，这些药物临床疗效好，毒副作用低，对于系统性真菌感染的防治具有重大意义。然而，由于价格非常昂贵，而且病原真菌的种类十分庞杂，真菌感染的发生机制又往往涉及到机体免疫系统的受损，因此进行各种真菌感染的药物治疗时，应当注意从病原真菌的种类和药物的特性，以及患者的全身状况和经济状况等诸方面，综合考虑，正确选择合理的抗真菌药物，探索并制定出高效、低毒和经济的诊疗方案，如不同作用机制药物之间的联合用药等。
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
请问:有没有真菌皮肤表面采样的SOP ?急用,先谢了:loveliness:
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
患者女性,因为脚部片状红斑,在其它诊所治疗,给予外用激素和强刺激性药物后产生突发皮疹范围扩大.来诊时考虑真菌,用抗真菌治疗,效果显著
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
患者女性,因为脚部片状红斑,在其它诊所治疗,给予外用激素和强刺激性药物后产生突发皮疹范围扩大.来诊时考虑真菌,用抗真菌治疗,效果显著
Re:皮肤真菌病的分子诊断及治疗进展
zhb886,你好：根据照片分析，患者确实是皮肤癣菌感染所致的皮疹，由于患者使用刺激性药物致使局部呈原发性接触性皮炎样改变。你直接使用抗真菌药治疗，原则上是正确的，但如果患者接触性皮炎有渗出等急性炎症时，治疗时最好先处理接触性皮炎，待接触性皮炎好转后再治疗原发基础疾病。可避免加重接触性皮炎的症状，否则患者可能要产生误解。
查看完整版本: