dna提取方法过程中的关键步骤及注意事项有...

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2011-08-26 20:04 标签： dna提取方法
DNA提取及PCR的注意事项_百度文库
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DNA提取及PCR的注意事项
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rna提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些
注意各种试剂中存在的RNA酶，注意你唾沫星子皮肤上存在的RNA酶注意枪头管子里的RNA酶，吹干点。 重要的事情说三遍，但别吹太过了。 剩下就是最后一步吸干点
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1.加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次。2.加入溶液3后，复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。3.在用苯酚、氯仿抽提时应用TE缓冲液将原溶液的体积扩大，一般是200～ 300 微升，以减少DNA的损失。以上是本人在提取质粒时的一些体会，希望能对同行有所帮助！
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1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。 
2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。 
3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。 
4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。 
5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。 
6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。 
7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。 

高中： 
原理： 
1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。 
2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。 
3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。 
方法步骤： 
1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。 5 min 
2．溶解DNA： 
3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢 
4．过滤：取黏稠物 
5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3 min 
6．过滤：取滤液。 
7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5 min 
8．DNA的鉴定：沸水浴5min 

大学 
DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。 
利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 
加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。 
将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。 
另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。 

2.细胞的破碎 
细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 

3.DNA提取的几种方法 
(1).浓盐法 
A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 
B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. 
C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. （2）.阴离子去污剂法; 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA 
（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 
（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

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