1.1倍长乙型肝炎病毒基因组在Huh7细胞中的高效复制和表达--《解放军医学杂志》2010年06期
1.1倍长乙型肝炎病毒基因组在Huh7细胞中的高效复制和表达
【摘要】：目的构建乙型肝炎病毒(HBV)1.1倍基因组长度的重组载体,研究其在人肝癌细胞系Huh7中的复制与表达。方法以慢性乙型肝炎患者C基因型HBV DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出HBV基因组的两条DNA片段,酶切后与载体连接成含HBV1.1倍基因组长度的重组载体。经PCR、酶切及测序鉴定后,将重组载体经FuGENEHD转染入Huh7细胞,用ELISA检测转染细胞培养上清液的HBsAg和HBeAg表达,用荧光定量PCR和Southern杂交检测HBV DNA的复制水平及复制中间体。结果经鉴定证实成功构建1.1倍基因组长度C基因型HBV重组载体,体外转染Huh7细胞48h后,培养上清液中检出HBsAg和HBeAg表达;转染72h后,荧光定量PCR检出较高的HBV DNA复制水平(107～109拷贝/ml);Southern杂交检出病毒复制中间体。结论构建的1.1倍长重组载体可以介导高水平的HBV病毒复制和基因表达,为进一步体外瞬时转染HBV表型耐药分析奠定基础。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R512.62【正文快照】：
目前,在抗乙型肝炎病毒(HBV)感染治疗中广泛使用的核苷(酸)类似物具有不良反应小,抑制HBV复制迅速等优点[1]。但其对HBV的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)没有直接作用,HBV感染者需要长期用药治疗,易导致HBV产生耐药变异[2-4]。HBV的体外耐药表型分
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内容来自淘豆网转载请标明出处.病毒DNA或RNA能在细胞内存活多久我知道它们能在细胞内复制,但如果不复制的情况下它们能存在多长时间不失去其活性,也就是不失去复制的能力?有没有这方面的研究呢?我这条假设是在病毒DNA不受外界干扰，只是单纯地被释放到细胞中，然后没有免疫系统来消灭它，它也不复制或不能复制，完全停止活动的前提下。
首先,如果病毒DNA不复制,不表达的话,被感染的细胞表面就不会表达病毒抗原,也就不会有免疫反应了.这样没有活性的也不叫做病毒了,所以没有人研究.你的这个问题,可以用其他的实验来回答.在生物实验中,常常实验病毒以外的方法来输送外源性的DNA到细胞内,比如质粒.转入的质粒有一部分会通过重组整合到细胞的基因组.至于没有整合的那部分DNA,细胞分裂几代后,就被稀释了.RNA病毒（比如爱滋病病毒）都是通过反转录酶反转录为DNA,然后再整合到基因组的.然后就一直存在体内了.
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只要DNA、RNA离开体液就失去生命力了。
扫描下载二维码乙型肝炎的复制方式
　　由于乙肝复制有逆转录过程，故病毒的DNA可整合于靶细胞的染色体中，已知整合区约有50％以上为负链的5'-末端区。
　　5．在病毒DNA多聚酶的逆转录酶活性作用下，自DR区开始，以前基因组RNA为模板，逆转录出全长的HBVDNA负链。在负链DNA合成过程中，前基因组被RNA酶降解而消失。
　　1．乙肝吸附并进入肝细胞后，脱去衣壳，病毒的DNA进入肝细胞核内。
　　乙型肝炎的复制方式如下：
　　4．病毒的前基因组、蛋白引物及DNA多聚酶共同进入组装好的病毒内衣壳中。
　　6．病毒以新合成的负链DNA为模板，也自DR区开始复制互补的正链DNA。
　　2．在DNA多聚酶的催化下，以负链DNA为模板，延长修补正链DNA裂隙区，使形成完整的环状双链DNA。
　　7．复制中的正链DNA（长短不等）与完整的负链DNA结合并包装于内衣壳中，再包上外衣壳成为病毒体，从细胞质释放至细胞外。
　　3．双链DNA继而形成超螺旋环状DNA，在细胞RNA多聚酶的作用下，以负链DNA为模板，转录形成长度分别为2.1kb和3.5kb的RNA。前者作为mRNA转译出外衣壳蛋白；后者除转译出内衣壳蛋白外，还作为HBVDNA复制的模板，故亦称其为前基因组。
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RNA干扰抑制HepG2-N10细胞系中乙肝病毒基因表达及复制的研究
目的RNA干扰现象(RNAinterference，RNAi)指的是双链RNA可引发同源mRNA降解。它已被成功应用于下调内源性基因表达，并应用于抑制哺乳动物体内各种病原体的复制。在本研究中，我们评估了以U6启动子作为启动序列(pSilencer2．0-U6)载体介导的小RNA干扰片段在培养细胞株中抑制HBV复制的效应。
方法将针对HBV基因组不同区域的核苷酸序列插入至pSilencer载体中，并将重组后的pSilencer质粒载体转染入HepG2-N10细胞株中。HepG2-N10是一个可稳定表达HBsAg及HBeAg的细胞株(其表达HBV血清型为adw2亚型)。以ELISA法检测病毒抗原，以RT-PCR检测病毒mRNA，并以荧光定量PCR法检测分泌入培养基的cccDNA。
结果质粒载体介导的RNAi能明显抑制培养基中HBsAg及HBeAg的表达(P~0．05)。并且RT-PCR法检测显示病毒mRNA也被降解了，从而减少了蛋白表达及病毒逆转录复制的模板(P~0．05)。荧光定量PCR法检测显示分泌入培养基的cccDNA明显下降(P<0．05)。
结论RNAi能抑制HBV基因表达及病毒复制，RNAi可能对HBV感染具有潜在的治疗作用。
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