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TTC法测根系活力
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番茄、辣椒育苗基质配方测试指标及方法
1、基质测试指标
&&& 试验材料性质：测定椰糠、进口草炭、国产草炭、珍珠岩、蛭石和发酵物等pH和EC值；进口草炭、国产草炭和发酵物测定速效氮磷钾含量。
&&& 基质测定指标：分别按照上述不同基质配方采集13个基质样品；采集方法：基质充分混匀后在基质堆上按照上中下不同层次分多点随机取样，多点等量混合即为一个混合样品，风干后过1mm筛，测定pH、EC值及速效氮磷钾含量。
&&& 在生长期间，每5天随机取基质样一次，测定pH和EC值。
2、植株测试指标
&&& 待第一片真叶展平时，各处理每个重复随机抽样10株，挂牌标记，每隔5d测定叶面积、株高、茎粗、真叶片数等；同时每隔10d随机采集植株完整样品，测定根长、根冠比、根系活力、叶绿素含量、植株各器官干质量、鲜质量、壮苗指数及G值等。
3、测试方法
&&&pH和EC值的测定：取10 g基质用100 ml去离子水浸泡24 h，浸提液用电导仪测定EC值，用pH计测定pH值。
&&& 基质中速效氮磷钾的测定：碱解氮（碱解扩散法）：用0.1N氢氧化钠水解样品，硼酸吸收，再用标准酸滴定；速效磷的测定：0.5N NaHCO3法；速效钾的测定：1N Na2SO4浸提―四苯硼钠比色法。
&&& 叶面积：用相关法测定。
&&& 株高：用直尺测定，以穴孔表面到生长点的高度为准。
&&& 茎粗：用游标卡尺测定，以第一节位下偏上部为准。
&&& 鲜质量：用1/1000天平称量。
&&& 干质量：先在通风干燥箱105℃下杀青30min，然后在80℃下烘至恒重，再在1/1000天平称量。
&&& 壮苗指数=（茎粗/株高+根干质量/地上部干质量）×全株干质量。
&&& G值（干物质平均积累量）=全株干质量/播种天数，根冠比=根干质量/地上部干质量。
&&& 叶绿素含量：用丙酮乙醇混合浸提法测定。称取剪碎的叶片0.1000g，放入加有10ml丙酮：乙醇=1：1提取液的试管，在黑暗处浸提24-36h，期间摇匀2-3次。比色前倒出该浸提液，再加5ml丙酮：乙醇=1：1提取液对未提取干净的样品做二次浸提，混合前后两次浸提液，比色。叶绿素含量的计算公式：
&Ca=12.21D663－2.81D646&Cb=20.13D646－5.03D663&式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；D663和D646分别为叶绿体色素提取液在波长663nm和646nm下的光密度。
&&& 根系活力：用TTC法测定。取一定量根系样品，放入小烧杯中，加0.4%TTC溶液和1/15磷酸缓冲液各5ml，37℃黑暗保温1.5h，然后加lmol/L的硫酸2ml终止反应。取出材料，用滤纸吸干后，加入乙酸乙酷研磨，取红色浸提液，用乙酸乙酯定容至10ml，测OD450值。
附表：附表1 /样品测试项目及采样测试方法
基质样品&取样时间&样品数量&测试指标&测试方法&混合基质&装盘前&每个处理取一个混合样品，共13个&pH、EC值、速效氮磷钾&详见方案&穴盘基质&播后5d/次&每处理取5个重复，取8次，共520个&pH、EC值&附表2 植物样品测试项目及采样测试方法
测试指标&采样时间&取样/测量数量&测定方法&株高&5d/次&每处理重复测量5-10株&直尺测量（详见方案）&茎粗&5d/次&每处理重复测量5-10株&卡尺测量（详见方案）&叶片数&5d/次&每处理重复测量5-10株&计数法（详见方案）&叶面积&5d/次&每处理重复测量5-10株&相关法（详见方案）&根长&5d/次&每处理重复取样10株测定&测量法（详见方案）&地上部质量（鲜重、干重）&5d/次&每处理重复取鲜样10株测定&1/10000称量（详见方案）&根质量（鲜重、干重）&5d/次&每处理重复取鲜样10株测定&1/10000称量（详见方案）&整株生物量（鲜重、干重）&5d/次&每处理重复取鲜样10株测定&1/10000称量（详见方案）&叶绿素（a、b）&10d/次&每处理重复取鲜样10株测定&丙酮乙醇混合浸提法（详见方案）&根系活力&10d/次&每处理重复取鲜样10株测定&TTC法（详见方案）
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Road,Jinan,Shandong,China
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氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定植物根系活力
氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定植物根系活力
一、实验目的
掌握TTC 法测定植物根系活力的原理和方法。植物根系与植株整个生命活动紧密相关，
其作用主要有：对地上部的支持和固定；物质的贮藏；对水分和盐类的吸收；合成氨基酸、激素等物质。因此根系的活力是植物生长的重要生理指标之一，它直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。
二、实验原理
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80 mV 的色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲腙（TTCH或TTF），比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC 被广泛地用作酶促反应实验的氢受体。根系中脱氢酶的活性强弱与根的活力成正相关。所以TTC 还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。
三、设备与试剂
分光光度计，电子天平，温箱，研钵，漏斗，试管架，药勺，石英砂，50 mL三角瓶，100 mL 量筒，10 mL移液管，10 mL 刻度试管，10 mL容量瓶，10 mL、1 000 mL 烧杯。
①乙酸乙酯（分析纯）或丙酮，保险粉（连二亚硫酸钠，Na2S2O4）。
②1％ TTC 溶液：准确称取TTC 1.0 g，溶于少量水中，定容到100 mL。用时稀释至需要的浓度。
③0.1mol/L，pH7 磷酸缓冲液
贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4&H2O或31.21gNaH2PO4&2H2O配成1000ml）；
贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4&7H2O或71.64gNa2HPO4&12H2O 配成1000ml）；
取A液39ml+B液61ml，用水稀释至200ml）
④1 mol&L－1硫酸：用量筒取比重1.84 的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1 000 mL。
四、实验步骤
（一）制作标准曲线
& &取0.4％ TTC 溶液0.2 mL 放入10 mL 量瓶中，加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的三苯基甲腙。再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200 &g&mL-1的标准比色系列，以空白作参比，在485 nm波长下测定吸光度，
绘制标准曲线。
（二）样品处理
①称取根尖样品大约0.5g，放入称量皿中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol&L-1硫酸2ml，以停止反应。
②与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上。&
③把根取出，吸干水分后放入20ml试管中加10ml甲醇（以提出甲月替）盖上筛子放于避光处静置几个小时至根为白色为准
④用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。
六、实验结果
按下列公式计算TTC的还原量（以鲜重计），求出根活力大小。
& & & & & &四氮唑还原强度（mg/(g.h)）＝四氮唑还原量（mg）/根重（g）&时间（h）
时间为保温培养时间
七、注意事项
& &TTC 溶液贮于棕色瓶中，避光贮存并放入冰箱中贮存，最好现配现用。
0.4mol/L琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6个结晶水）10.81g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。
1. 定性测定
（1）配置反应液 &把1%TTC溶液，0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。
（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。
2. 定量测定
（1）TTC标准曲线的制作&
吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25&g、50&g、100&g、150&g、200&g的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。
（2）称取根样品0.5g，放入小培养皿（空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同），加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。
（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量
验三 作物根系脱氢酶活性测定（TTC法）&
幼根或嫩壮根，呼吸作用较强，其脱氢酶的活性也较强；而老根或黑根，呼吸作用较弱，其脱氢酶的活性则亦弱，故可通过测定作物根系脱氢酶的活性了解根系的活力，并作为诊断作物生命活动和影响作物吸收养分的障碍因素的指标。
由于脱氢酶在中性反应条件下，可将无色的三苯基氯化四氮唑（即TTC）还原为红色的三苯基甲月替（TPF）。其酶促反应如下：&
反应生成物三苯基甲月替 不会自动氧化，可在空气中用乙酸乙酯提取，提取液可于485 nm波长处进行比色测定，然后查标准曲线，即可求出每克鲜根所生成的三苯基甲月替量，从而判断根系的活力。
称取鲜根1-2 g，置于试管中，注入0.4% TTC溶液和0.1 mol/L磷酸缓冲液等量混合液10 mL，使根全部浸入此溶液中，置于37℃恒温箱内，反应3小时后，加入1 mol/L 硫酸2 mL，以停止酶的作用，然后取出根，擦干水分，放入研钵中，再往研钵中加入3-5 mL乙酸乙酯和少量石英砂进行研磨，使红色的三苯基甲月替溶解出来，并小心地转入50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯继续提取三苯基甲月替至干净（无色）为止，最后加入乙酸乙酯至刻度混匀，用1 cm比色杯在波长485 nm处进行比色测定，查标准曲线，即可求出每克鲜根所生成的三苯基甲?量。
1．三苯基氯化四氮唑0.4%。
2．0.1 mol/L磷酸盐缓冲液&
由0.1 mol/L磷酸二氢钾、0.1 mol/L氢氧化钠及蒸馏水按50:29.54:20.46的容积比混合而成，也可用0.1 mol/L磷酸二氢钾和0.05 mol/L硼砂溶液按6.32:3.77的容积混合而成，此缓冲溶液的pH应为7.0。
3．1 mol/L硫酸。
4．乙酸乙酯。
5．连二亚硫酸钠（Na2S2O4）新鲜干燥粉末。
6．标准曲线的绘制
吸取0.4% TTC溶液，稀释至100 mg/L，然后用吸管分别吸取0.0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和2.00 mL于8支大试管中，准确地加入乙酸乙酯溶液10 mL，混匀，加入极少量的连二亚硫酸钠粉末，充分振荡，使TTC还原为红色三苯基甲月替并溶于乙酸乙酯中，以上溶液中三苯基甲月替含量分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0和20.0 mg/L。用1 cm比色杯于485 nm波长处，分别测定光密度，并绘制标准曲线。
五、注意事项
1．由于脱氢酶还原三苯基氮唑的反应适于中性反应，故测定时需在中性缓冲液(pH=7)，并在暗处进行。
2．如用乙酸乙酯提出的三苯基甲月替量少或提取溶液的红色较浅，可改用25 mL的容量瓶。
nm波长处，分别测定光密度，并绘制标准曲线。
五、注意事项
1．由于脱氢酶还原三苯基氮唑的反应适于中性反应，故测定时需在中性缓冲液(pH=7)，并在暗处进行。
2．如用乙酸乙酯提出的三苯基甲月替量少或提取溶液的红色较浅，可改用25 mL的容量瓶。根系活力的测定_中华文本库
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文本预览：
根系活力的测定[TTC法]
制作人：刘新 单 位：生命科学学院 植物生理学教研室
一、实验目的
理解植物根系活力的内涵 掌握根系活力测定的原理与方法
合成氨基酸和植物激素 （ABA、CTK、GA等）
H2O 无机盐
根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量 测定根系活力，为植物营养研究提供依据。
二、实验原理
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还 原物质，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不 溶于水的三苯基甲腙 （TTF）。
生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化
琥珀酸 延胡索酸 苹果酸
（无色，溶于水）
丙二酸 碘乙酸
（红色，不溶于水）
三、实验材料
水培或砂培小麦、玉米等植物根系。
四、实验步骤—制作TTC标准曲线
TTC含量（μg）
0.25mL 0.50mL
25 50 100 150 200
1.00mL 1.50mL
乙酸乙酯作 参比，测定 485nm 下光 密度值，绘 制标准曲线
2.00mL 吸取0.25mL TTC 加少许 乙酸乙 加入10mL容量瓶 Na2S2O4 酯定容
四、实验步骤—测定根系活力
0.5g根尖样品 0.4％TTC和磷酸缓冲液的等量混合液10ml 根充分浸没于溶液中 37℃下暗保温1～3h 加入1mol/L硫酸2ml 取出根吸 干水分 查标准曲线，求 四氮唑还原量 空白试验作参比测 485nm下吸光度
与此同时 做一空白 实验，先 加硫酸， 再加根样
与3～4ml乙酸乙酯和少量 石英砂在研钵内磨碎 红色提取液移入试管且 用乙酸乙酯定容到10ml
五、实验结果
四氮唑还原强度 ＝ （mg/g(根鲜重)/h）
四氮唑还原量（mg） [根重（g）×时间(h)]
六、思考题
1.植物的根与地上部分有何关系? 2.反应中加入硫酸、琥珀酸或延胡羧酸、 苹果酸各起何作用？ 3.测定根系活力时最好选择根的哪个部位？ 为什么？ 4.为什么要以杀死根系作为空白对照？
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