TaqMan MGB 探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测人粒细胞无形体Msp2基因方法的建立
<meta name="keywords" content="Anaplasma phagocytophilum; real-time PCR; TaqMan MGB haemaphysalis hystricis" />
Establishment of real-time PCR assay to detect Anaplasma phagocytophilum Msp2 gene with TaqMan MGB probe
FU Xiu-ping, WANG Jing-quan, HE Jin-rong, ZHANG Jing-shan
Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Objective To establish a highly specific and sensitive real-time PCR assay to detect Anaplasma phagocytophilum. Methods A pair of primers and a Taq Man MGB probe were designed according to the Msp2 outer membrane gene sequence. By using real-time PCR assay, Anaplasma phagocytophilum was detected in ticks samples collected from Hubei and Hebei provinces. Results A linear relationship between threshold cycle(Ct)of the quantitative real-time PCR and the DNA copy number could be demonstrated(r=0.99). The standard curve showed that 35 copies target genes per reaction can be detected by this assay. The lowest detection limit of this assay was 2 CFU per μl. The assay showed high species specificity and good reproducibility. A total of 426 tick samples were detected by this assay, including 253 haemaphysalis hystricis in 49 groups, 7 samples were positive. Conclusion The results suggested that the real-time PCR assay with TaqMan MGB is highly specific and sensitive for the detection of Anaplasma phagocytophilum and may be used in the diagnosis of this infection.
Keywords: &&
Anaplasma phagocytophilum&&
TaqMan MGB 探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测人粒细胞无形体Msp2基因方法的建立
付秀萍, 王景泉, 贺金荣, 张景山
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 102206
目的 建立敏感、特异、实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative, FQ-PCR)方法, 用于人粒细胞无形体病的检测。 方法 根据无形体特异外膜蛋白 Msp2基因为靶基因设计引物以及TaqMan MGB探针, 建立FQ-PCR方法,并对湖北省随州和河北省张家口地区的蜱标本进行了检测。 结果 本研究建立的TaqMan MGB探针具有良好的特异性,建立的FQ-PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20 μl PCR反应管中只要有35个拷贝的目的基因即可被检测到,即最低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性。共检测蜱标本426只,其中豪猪血蜱253只,共49组,阳性7份。 结论 本研究建立的FQ-PCR方法具有很高的特异性和敏感性, 可用于人粒细胞无形体感染的快速检测。进一步证实了豪猪血蜱可能是粒细胞无形体的媒介宿主。
关键词: &&
收稿日期：
基金项目：国家基础研究项目- 973 计划( No.)
通讯作者：付秀萍,Tel:010-,Email:
　　人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)是一类重要的新发人兽共患自然疫源性疾病，由嗜吞噬细胞无形体侵染人末梢血中性粒细胞引起，主要通过蜱叮咬传播。临床表现主要为发热，白细胞、血小板减少以及多器官功能损害等。该病临床症状与某些病毒性疾病相似，容易发生误诊，严重者可导致死亡，因此建立快速、准确的诊断方法十分重要。
　　目前无形体的实验室诊断主要有血清学检验和分子生物学检测。血清学检测主要为间接免疫荧光(IFA)法，需要急性期和恢复期双份血清。分子生物学检测推荐采用16S rRNA基因巢式PCR检测[Ref 1]。近年来，实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)以其高特异性、高敏感性、且重现性好的优点应用与于病原微生物的早期诊断中。有研究发现普通TaqMan探针及TaqMan MGB探针2种方法在人粒细胞无形体检测上均具有良好的特异性和重复性, TaqMan MGB探针灵敏性要高于普通TaqMan探针。本研究以无形体特异外膜蛋白 Msp2基因为靶基因设计引物以及TaqMan MGB探针, 建立FQ-PCR方法，对该方法进行评价，并利用建立的方法对湖北省随州和河北省张家口地区的蜱标本进行了检测。
1&材料与方法
1.1&立克次体DNA　　恙虫病东方体Kawasaki株，查菲埃立克体基因组DNA为本室保存。人粒细胞无形体，恙虫病东方体(Gilliam、Karp、Kato株和Boryon株)，贝氏柯克斯体，普氏立克次体基因组DNA 为美国得克萨斯大学惠赠。
1.2&其他细菌DNA　　肺炎链球菌(31004), 嗜肺军团菌(12 型),炭疽(A16R), 鼠疫菌(EV76)为中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所其他科室提供。
1.3&主要仪器设备与试剂　　Stratagene Mx荧光定量real-time PCR仪，台式高速离心机Eppendorf centrifuge 5415D，核酸浓度测定仪NanoDrop-1000 Spectrophotometer， QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)。小量质粒提取试剂、核酸纯化试剂盒、pMD18-T Vector、JM109感受态细胞、荧光定量real-time PCR 反应试剂Premix Ex TaqTM均购自大连宝生物工程有限公司。基因测序由北京擎科公司完成。
1.4&引物及TaqMan探针合成　　以Msp2基因序列为靶基因，进行引物和探针设计[Ref 1]。引物和探针由上海基康生物公司合成。上游引物：ApMSP2f ATG
ATT，下游引物：ApMSP2r TTG
T A，TaqMan探针：F TGG
1.5&标准品的制备　　以ApMSP2f和ApMSP2r为引物，扩增HGA MSP基因片段，产物长度为77 bp。以胶回收试剂盒纯化PCR产物，将该片段与T载体连接, 导入 JM109 感受态细胞，构建重组质粒,将该质粒作为标准DNA模板。
1.6&质粒拷贝数浓度换算　　测定质粒浓度为5.3 ng/μl，根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度。拷贝数浓度(拷贝/ml)=(质量/分子量)×6.02×1023，质粒的分子量=660×(2692＋77)＝1 827 540， 其中660是每个碱基的平均分子量，2692为T载体的碱基数。通过计算得出拷贝数的浓度为1.74×1019拷贝/ml。
　　将标准品10×倍比稀释后，使浓度达到1.74×106～1.74×10-1进行FQ-PCR，同时做2个平行样品，选择双孔均有扩增曲线且Ct值一致的最小DNA浓度为最低检测限度。
1.7&引物浓度和探针浓度优化　　固定探针浓度在100 nmol/L，上下游引物反应浓度分别采用100、300、600和900 nmol/L，检测阳性对照DNA，根据Ct和扩增曲线的荧光信号强度选择最优引物浓度。采用优化的引物浓度，探针终浓度分别采用100、200、300 nmol/L，检测阳性对照DNA，根据扩增反应的循环Ct值和扩增曲线的荧光信号强度选择最优探针浓度。相同的扩增体系均设两孔进行平行检测。
1.8&反应体系及反应条件　　反应体系：Premix(TaKaRa)Ex TaqTM(2×)10 μl；PCR Forward Primer(3 μmol/L)2 μl；PCR Reverse Primer(3 μmol/L)2 μl；Taqman Probe(2 μmol/L)2 μl；DNA模板 2 μl；去离子水1.6 μl，总体系20 μl。
反应条件采用两步法PCR扩增标准程序：第一步，预变性，95 ℃ 10 s，1个循环；第二步，PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。
1.9&蜱标本的检测　　将湖北省随州地区和河北省张家口地区送检的蜱标本进行实验室分类鉴定后，将蜱用生理盐水清洗3次，放入0.5 ml离心管中，吸血蜱3只一组，普通蜱5~10只一组进行研磨，用QIAmp DNA Mini Kit试剂盒提取DNA。以健康蜱代替标本进行同样操作作为PCR阴性对照，以无菌水代替标本进行同样操作作为PCR空白对照。利用建立的FQ-PCR方法和16S rRNA基因巢式PCR[Ref 1]进行检测。
2.1&最优引物探针浓度　　优化引物浓度时，采用不同的上下游引物浓度，扩增HGA全基因组 DNA。结果显示，不同上下游引物扩增Ct值有轻微的变化，相比较，当上下游引物浓度分别为300和300 nmol/L时，扩增Ct值较小且荧光信号较强，故选择此浓度(图1)。当探针浓度为200 nmol/L时，扩增Ct值较小，故选择200 nmol/L为最佳探针浓度。
图1&不同引物浓度下real-time PCR扩增曲线
Figure 1&Curves of RT-PCR with different concentrations of primers
2.2&敏感性分析　　在DNA浓度为1.74×10-1~1.74×106/μl时，对应的Ct值显示检测下限为1.74×101拷贝/ μl。按每个PCR反应的DNA模板量为2 μl换算，每个反应管中的拷贝数为34.8个，即每个PCR反应管中只要有35个拷贝的目的基因即可被检测到，最低检出浓度为2拷贝/μl。FQ-PCR结果显示， 10×倍比稀释的标准品三次平行重复结果比较一致，见图2；且不同批次倍比稀释标准品重复结果也较一致。由质粒浓度对数值及其对应Ct值绘制的标准曲线的r绝对值为0.99，由直线斜率推出的扩增效率(E)约为0.90(E=10-1/斜率，斜率=3.56)(图2)。
图2&标准品的扩增曲线Figure 2&Curves of amplification of the standard
图3&质粒浓度对数值及其对应Ct值绘制的标准曲线
Figure 3&Standard curves according to
plasmid concentration logarithm and its Ct value
2.3&引物及探针特异性分析　　分别检测了人粒细胞无形体，恙虫病东方体 Gilliam株，Karp株，Kato株，Boryon株和Kawasaki株，查菲埃立克体，贝氏柯克斯体，普氏立克次体，肺炎链球菌, 嗜肺军团菌,炭疽, 鼠疫菌的DNA模板，结果显示人粒细胞无形体样品检测到很强的荧光信号，其余非粒细胞无形体样品检测结果均未见荧光信号(检测拷贝数为0), 表明该方法具有特异性，见图4。
图4&不同DNA样品的扩增曲线
Figure 4&Curves of different DNA samples
2.4&蜱标本检测　　共检测蜱426只，其中湖北省随州地区豪猪血蜱253只，共49组，阳性7份。河北省张家口地区长角血蜱44份，无阳性。而利用16S rRNA基因巢式PCR检测相同的标本，豪猪血蜱阳性4份，长角血蜱无阳性结果。
　　人粒细胞无形体病是由嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilm)所引起的一种自然疫源性疾病，分布遍及全世界。2006年我国安徽省首次发现无形体病感染[Ref 3]。该病临床症状与某些病毒性疾病相似，容易发生误诊，严重者可导致死亡，因此建立快速、准确的诊断方法十分重要。
　　本研究以无形体特异外膜蛋白 Msp2基因为靶基因设计引物以及TaqMan MGB探针,建立检测无形体病的FQ-PCR 方法。分析结果显示该方法具有无形体病的种属特异性, 其检测的灵敏度可达到每个PCR反应管中只要有35个拷贝的目的基因即可被检测到，显示出很高的敏感性。倍比稀释的标准品三次平行样品结果比较一致，且不同批次倍比稀释标准品重复结果也较一致，说明该方法具有良好的重现性。由质粒浓度对数值及其对应Ct值绘制的标准曲线的r绝对值为0.99，扩增效率(E)约为0.90，可以认为系统误差较小，实验操作准确，结果可信。
　　人粒细胞无形体病主要通过蜱叮咬传播，在我国，已经从黑龙江、内蒙古大兴安岭以及新疆等地区的全沟硬蜱及森林革蜱中检出粒细胞无形体的基因片段[Ref 4-6]。另外从福建省的越南血蜱以及湖北省随州地区的豪猪血蜱中也检测到粒细胞无形体的基因片段[Ref 7-8]。本研究以新建立的实时荧光定量PCR方法检测湖北省随州地区豪猪血蜱共49组，阳性7份。16S rRNA基因巢式PCR检测，阳性4份。进一步证实了人粒细胞无形体可能存在于豪猪血蜱中，豪猪血蜱可能是粒细胞无形体的媒介宿主。实时荧光定量PCR方法检出灵敏性较高，而16S rRNA基因巢式PCR检测可以进行进一步的测序以及序列比对等工作，提供更多的序列信息。故在实际应用中这两种方法可以互为补充。
[1] Wen B, Jian R, Zhang Y, et al. Simultaneous detection of Anaplasm marginale and a new Ehrlichia species closely related to Ehrlichia chaffeensis by sequence analyses of 16S ribosomal DNA in Boophilus microplus ticks from Tibet[J]. J Clin Microbiol,):.[2] Wang SW,Zhang LJ, Wang YY, et al.Establishment and comparison of real-time PCR assays to detect Anaplasma msp-2 gene with general TaqMan probs and TaqMan MGB probe [J]. Disease Surveillance,):12-14.(in Chinese) 王誓闻,张丽娟,王园园,等.普通TaqMan探针及RaqMan MGB探针real-time PCR检测无形体msp-2基因方法的建立与比较[J].疾病监测,):12-14.[3] Zhang LJ, Liu Y, Ni DX, et al. Nosocomial transmission of human granulocytic anaplasmosis in China [J]. JAMA,):.[4] Cao WC, Zhao QM, Zhang PH,et al. Prevalence of anaplasma phagocytophilaand borrelia burgdorferiinIxodes persulcatus ticks from northeastern China[J]. Am J Trop Med Hyg, ):547-550.[5] Gao DQ,Cao WC,Zhang XT,et al. Ampltfying methods and application of the 16S rRNA genes of two kinds of human ehrlichia species[J]. Acta Parasitology et Medica Entomologica Sinica,):175-180.(in Chinese) 高东旗,曹务春,张习坦,等.野外采集标本中人埃立克体16S rRNA基因扩增方法及应用[J].寄生虫与医学昆虫学报,):175-180.[6] Munderloh UG, Jauron SD, Fingerle V,et al. Invasion and intracellular development of the human granulocytic ehrlichiosis agent in tick cell culture[J]. J Clin Microbiol, ):.[7] Zhao QM,Wu XM,Zhang PH,et al. Study on the coinfection of three tick-borne infectious diseases in China using polymerase chain reaction method[J]. Chinese Journal of Epidemiology,):9-13.(in Chinese) 赵秋敏,吴晓明,张泮河,等.三种蜱媒传染病在媒介蜱和鼠类中复合感染的研究 [J].中华流行病学杂志,):9-13.[8] Jin XZ,Guo F,Liu XH,et al. Detection of ehrlichia in ticks in Suizhou city of Hubei province,China[J]. Chinese Journal of Epidemiology,):.(in Chinese) 金晓舟,郭芳,刘晓辉,等.湖北省随州市蜱携带埃立克体的核酸检测[J].中华流行病学杂志,):.
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实时荧光定量PCR——TaqMan探针法
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
TaqMan技术引物设计原则
o 序列选取应在基因的保守区段； o 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对， 避免引物自身形成环状发卡结构； o 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序 列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 o Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%； o 引物之间的TM相差避免超过2℃； o 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3 个以上连续相同的碱基； o 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； o Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； o 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 2
TaqMan探针设计原则
o 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针； o 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性； o 探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构； o Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃）， 以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在 40%－70%； o 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而 且即使是被切割下来还会存在淬灭作用； o 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会 降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； o 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实 一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 3
Taqman MGB 探针设计
o 探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报
告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
o Tm值应为65-67℃。 o o 尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。 尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4 个或4个以上的G重复出现。 o 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检 测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 4
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3秒自动关闭窗口TaqMan-MGB探针双重荧光定量PCR方法绝对定量MDV-Ⅰ和HVT--《安徽农业大学》2009年硕士论文
TaqMan-MGB探针双重荧光定量PCR方法绝对定量MDV-Ⅰ和HVT
【摘要】：
马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起鸡的一种恶性淋巴肿瘤性疾病,具有高度接触传染性。由于该癌症病的隐蔽性极强,又没有治疗手段,其主要预防措施是1日龄内接种疫苗。但疫苗仅阻止发病而非感染,因此对MDV的感染或污染进行特异性的诊断和监测十分重要。TaqMan-MGB实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术具有快速、灵敏、特异、特别是可以定量测定病毒拷贝数的优点为检测MDV提供了很好的方法。
本试验根据GenBank上的Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1) UL36基因和火鸡疱疹病毒(HVT)Bcl-2基因序列,用Primer Express 3.0软件分别设计了MDV-1和MDV-3的特异性引物和TaqMan-MGB探针,根据距阵优势法分别对引物和探针的浓度进行了优化,并在不同退火温度和不同循环数下进行了优化反应,确立了最佳反应体系和反应条件,通过双重实时荧光定量PCR的不交叉反应,最终建立了MDV-1和MDV-3的TaqMan-MGB探针双重实时荧光定量PCR方法。该方法特异性强,对新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒及鸡胚成纤维细胞提取的DNA均未扩增出荧光定量曲线;将放置不同时间的质粒(1d、30d)分别进行FQ-PCR的检测,发现不同检测时间、不同反应管之间的域值(CT)的变化很小,组内组间变异系数均小于5%,表明本试验建立的方法具有很好的稳定性;将浓度分别为5.45××1010拷贝数/mL的pBJ-U和pHV-B质粒DNA标准样品分别用去离子水做10的系列倍比稀释,进行常规PCR、FQ-PCR检测,结果表明FQ-PCR的检测灵敏度高出普通PCR 100倍。pBJ-U和pHV-B质粒DNA标准样品分别稀释至10-10时FQ-PCR可灵敏地检测5.45、5.38个拷贝数的病毒,而在pBJ-U和pHV-B质粒DNA稀释到10-8时,常规PCR产物的电泳结果已经不清晰。
通过对实验鸡和临床发病鸡的检测,得出本试验建立的双重荧光定量PCR方法可以灵敏地定量检测到MDV-1。在临床发病鸡检测的不同组织样品中,MDV-1含量为103.5~6拷贝数/mL,羽囊中病毒含量最高,达105~6拷贝数/mL;通过对实验免疫攻毒鸡羽囊样品的检测,发现HVT疫苗在一定程度上抑制了MDV-1在体内的复制,使羽囊排毒高峰延迟了两周,与攻毒对照组相比其高峰值下降101~2拷贝数/mL;MDV-3在HVT免疫攻毒组的羽囊中的病毒含量要高于免疫对照组,并且MDV-3在羽囊中的整体复制水平都不高。
总之,该方法将为MDV强毒污染监测、临床鉴别诊断、MD发病机理以及疫苗免疫机理的研究提供一种良好的技术手段。
【关键词】：
【学位授予单位】：安徽农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：S852.659.1【目录】：
ABSTRACT6-14
文献综述14-25
1 马立克氏病的研究进展14-19
1.1 MD 病原学14-15
1.2 MD 的发病机理15-17
1.3 MDV 的基因组学和蛋白组学17-18
1.4 MDV 的毒力演化18-19
2 马立克氏病疫苗的研究进展19-21
2.1 疫苗类型19
2.2 MD 疫苗的免疫机理19-20
2.3 MD 疫苗抗肿瘤作用的可能机理20
2.4 马立克氏病疫苗免疫失败的主要原因20-21
3 实时荧光定量PCR 技术(FQ-PCR)的研究进展21-24
3.1 原理21-22
3.2 荧光定量方法的类型22-23
3.3 实时荧光定量PCR 技术的应用23-24
4 结语24-25
试验部分25-54
1 引言25-26
2 材料与方法26-38
2.1 材料26-28
2.1.1 毒株、菌种与质粒26
2.1.2 主要试剂26
2.1.3 主要仪器26
2.1.4 鸡胚和实验动物26
2.1.5 临床病料26-27
2.1.6 试剂配制27-28
2.2 方法28-38
2.2.1 MDV-1 UL36 基因和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与序列测定28-32
2.2.2 MDV 双重荧光定量PCR 标准品的建立32-36
2.2.3 临床发病鸡AGP、PCR 及FQ-PCR 的检测36
2.2.4 实验免疫攻毒鸡羽囊病毒的检测36-38
3 结果与分析38-51
3.1 MDV-1 UL36 基因和MDV-3 Bcl-2 蛋白基因的克隆与测序结果38-41
3.1.1 UL36 基因和Bcl-2 蛋白基因的PCR 扩增38
3.1.2 重组质粒的鉴定38-40
3.1.3 DNA 测序结果与原始序列的比较40-41
3.2 MDV 双重荧光定量PCR 标准品的建立41-47
3.2.1 pBJ-U 和pHV-B 阳性质粒OD 值的测定结果41
3.2.2 pBJ-U 和pHV-B 阳性质粒DNA 拷贝数的计算结果41
3.2.3 荧光PCR 引物扩增目的片段的验证41-42
3.2.4 双重定量PCR 不交叉反应的试验结果42-43
3.2.5 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的稳定性试验结果43-44
3.2.6 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的敏感性试验结果44-46
3.2.7 MDV 双重FQ-PCR 检测方法的特异性试验结果46-47
3.3 临床发病鸡的AGP、PCR 和FQ-PCR 检测结果47-48
3.3.1 羽囊AGP 检测结果47
3.3.2 临床发病鸡的PCR 和FQ-PCR 检测结果47-48
3.4 实验免疫攻毒鸡的AGP 和FQ-PCR 的检测48-51
3.4.1 羽囊的AGP 检测结果48
3.4.2 荧光定量PCR 检测结果48-51
4 讨论51-54
4.1 MDV 双重荧光定量PCR 方法的建立51-52
4.2 临床发病鸡不同组织样品的检测52
4.3 FQ-PCR 对实验免疫攻毒鸡羽囊样品的检测52-54
参考文献55-60
作者简介61
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式
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