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I密级论文编号硕士学位论文喹烯酮残留标示物的测方法研究及半抗原设计与合成I要我国自主研制的喹噁啉类新兽药喹烯酮，具有毒性小、活性高的优点，属高效、安全的饲料添加剂，但因作为兽药使用，仍需考虑其通过食物链作用对人体产生的不良影响，故也需建立该化合物在动物可食用组织中残留的快速、灵敏的检测方法。本论文通过抗原和抗体的制备及半抗原的改造，进行了在动物可食用组织中喹烯酮残留的速检测的方法学研究。本论文研究首先以邻硝基苯胺为起始原料，经四步反应获得了高纯度的残留标示物3啉。并利用其分子结构中已有的羧基为偶联位点，以碳二亚胺法和蛋白进行偶联，完成了两种偶联物的制备（经紫外光谱法鉴定偶联成功。以两种偶联物为不同免疫原、采用不同的免疫时间间隔免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体，抗体效价测定和特异性鉴定的实验结果表明两种免疫原均能产生高效价的抗体，免疫间隔延长有利于效价提高，且以载体有利于避免针对蛋白载体的抗体产生。但间接竞争性对抗体的灵敏度测定结果表明，较高，不能满足残留检测的要求。本论文认为导致测灵敏度较低的原因，是残留标示物和蛋白偶联后的特征结构发生改变，诱导产生的抗体不能够对游离好的识别，因此，本论文设计了能够最大化保留构特征的系列半抗原结构，并对其合成路线进行了筛选和优化，最终以对甲基邻硝基苯胺为起始原料，经氧化环化、溴代、水解、合、还原、水解六步反应制备含羟甲基结构的生物73喹噁啉为制备对游离残留标示物高亲和力的抗体，高灵敏度的留检测方法的建立奠定基础。关键词喹烯酮，抗体，半抗原，化学合成isaofisasaasanbeantoofinbeInweaoftoasinInweasitofinbybyasbybySAasofoftooftoweinbyinweasasV目录第一章绪论....................................................................................................1药残留研究的意义及现状...................................................................................1噁啉类药物物的残留毒性及残留检测进展.......................................................2噁啉类药物的残留毒性................................................................................................2噁啉类药物的残留检测进展........................................................................................3疫分析在残留检测中的应用...............................................................................4分子药物半抗原设计与合成研究进展...............................................................4抗原的设计原则...........................................................................................................5接臂的引入...................................................................................................................5性基团的引入................................................................................................................................6用异质半抗原...............................................................................................................7研究内容与目的.....................................................................................................9第二章测方法的初步研究.........................................................11验仪器与材料.....................................................................................................11品与试剂.....................................................................................................................11要仪器.........................................................................................................................11验动物.........................................................................................................................11验方法.................................................................................................................12原制备.........................................................................................................................12体制备及质量评价......................................................................................................14测灵敏度的测定.............................................................................................15验结果.................................................................................................................16原的鉴定.....................................................................................................................16体制备及质量评价.....................................................................................................18测灵敏度的测定.............................................................................................19析讨论.................................................................................................................20原制备.........................................................................................................................20体制备.........................................................................................................................21测灵敏度的测定.............................................................................................21第三章半抗原的设计与合成......................................................................23抗原设计.............................................................................................................23抗原结构设计.............................................................................................................23抗原合成路线选择.....................................................................................................24抗原合成.............................................................................................................25验仪器与材料.............................................................................................................25验方法.........................................................................................................................26果与讨论.....................................................................................................................28V第四章全文结论..........................................................................................31参考文献..........................................................................................................32附录原始图谱索引........................................................................................35附图一3喹噁啉1,4电喷雾电离质谱....................................36附图二3喹噁啉电喷雾电离质谱质谱....................................................37附图三3喹噁啉电喷雾电离质谱质谱............................................................38附图四3喹噁啉核磁共振氢谱........................................................................39附图五5核磁共振氢谱..................................................................................40附图六5核磁共振氢谱..............................................................................41附图七73喹噁啉1,4红外图谱............................42附图八73喹噁啉1,4电喷雾电离质谱质谱........43附图九73喹噁啉1,4核磁共振氢谱....................44附图十73喹噁啉红外图谱...................................................45附图十一73喹噁啉电喷雾电离质谱质谱...............................46附图十二73喹噁啉红外图谱..........................................................47附图十三73喹噁啉电喷雾电离质谱质谱.......................................48附图十四73喹噁啉核磁共振氢谱..................................................49致谢..................................................................................................................50作者简介..........................................................................................................51国农业科学院硕士学位论文第一章绪论1第一章绪论药残留研究的意义及现状由于兽药（包括药物添加剂）在畜牧业中的应用日益广泛，药物在动物体内的滞留或蓄积而引起食品中药物残留问题已相当普遍。兽药残留指给动物使用药物后蓄积或贮存在细胞、组织或器官内的药物原型、代谢产物和药物杂质。在畜牧业生产中广泛使用的亚治疗剂量药物、非法使用禁用兽药及其它化合物、不遵守休药期的规定、违背有关标签的规定是导致兽药残留超标的主要原因（张宏伟,2004）。兽药残留在国内外已成为一个影响广泛且颇具争议的问题，其与公众的健康息息相关。对残留的监测与控制已经是目前国内外兽药研究、开发、使用和管理中的重要内容。尤其我国加入来，长期制约我国畜禽产品出口的关税壁垒已被打破，而所谓绿色贸易壁垒将成为制约我国畜禽产品出口的主要因素，因此加强对食品中药物残留的监控对提高我国的公共卫生水平、食品安全以及畜禽产品的国际竞争力均具有重要意义。兽药残留分析技术是复杂混合物中的痕量分析技术,其特殊性和复杂性在于痕量、动态的待测物存在于复杂的生物样品中，分析手段需要与兽药的理化性质、体内过程、存在状态以及药理毒理相结合。残留分析既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏的痕量检测技术，分析质量控制和分析策略如筛选性分析、确证性分析也有特殊要求（et1983）。兽药的残留分析最初仅限于化学分析法、比色法和微生物法,化学分析法和比色法缺乏专一性和敏感性,而微生物法虽然普遍适用于抗菌药物的残留测定,但不易筛选到特别敏感的菌株,方法常受到其它抗菌药物的影响。薄层色谱出现使分析方法有所改进,但仍需要复杂的样品前处理,且灵敏度不高。20世纪60年代后的气相色谱70、80年代后的高效液相色谱及S、S等联用技术的飞速发展大大地提高了分析的灵敏度和分辨率,尤其通过联用技术可提供待测残留组分的结构信息或对未知残留组分进行结构鉴定，而大大拓宽了残留分析范围。虽然仪器分析方法具有无与伦比的灵敏度和分辨率，但其设备昂贵、对实验人员要求较高、分析费时、复杂烦琐的样品前处理过程和难以进行同时大量样品的筛选的缺点，对药物残留的及时监控无疑是不适的。而九十年代免疫检测技术借其特异性高、简单、灵敏、快速的特点而在兽药残留检测领域得以飞速发展，一系列免疫检测试剂盒的生产与应用加快了兽药残留分析的标准化（蔡勤仁，2002）。美国化学会将免疫分析与气相色谱、液相色谱同列为残留检测的三大支柱技术。美国环境保护署美国农业部食品安全检验司美国化学会制定了农药残留免疫检验商品试剂盒评定和认可的建议准测（et995;陈新建，1998）明确了测定结果的法律效应。现在及将来相当长时期内，色谱法、光谱法及其联用技术仍是兽药残留分析技术的主流，并围绕高分辨分离和高灵敏两大精髓发展，以期能简化分析过程，提高分析效能，特别是多残留分析能力和分析过程自动化智能化。与此同时，以酶联免疫吸附检测法（代表的免疫分析方法也将会凭借其特异性强、灵敏性高、样品通量大、检测迅速、检测费用低廉等优势在兽中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论2药残留监控和快速残留筛选过程中发挥更大的作用。噁啉类药物物的残留毒性及残留检测进展噁啉类药物的残留毒性喹噁啉类化合物（一类通过1,4目前我国使用量最大的饲料添加剂之一。主要包括喹乙醇（卡巴氧（、乙酰甲喹（、喹烯酮（等，它们均具有提高饲料效率、促进动物生长和广谱抗菌的作用。抗菌活性是促生长作用的基础，而且它们的抗菌机理相同，都是通过抑制细菌成（曹随忠，2001）。其中喹乙醇和卡巴氧是该类药物的代表药物，因具有良好的广谱抗菌效果和促生长作用，而被广泛应用于养殖业中。喹烯酮是我国研制开发的一类新兽药，喹烯酮与喹乙醇等相比具有高效、安全、添加量少等优点,并可明显提高畜禽繁殖率及幼仔畜禽的存活率。图1噁啉类药物结构式实际生产中，因超剂量使用或饲喂时间过长等原因，通常会引起喹噁啉类药物在动物可食用组织中有一定的残留，有时甚至会导致残留量超标。验、体外诱变哺乳动物细胞实验、哺乳动物体内诱变实验均证明喹乙醇和卡巴氧对啮齿类动物表现出基因毒性和致癌性（et2002;et981;1984），使用穿梭质粒/哺乳动物细胞检测系统在喹乙醇诱变分子机制研究中发现，喹乙醇引起质粒靶基因核苷酸序列改变主要表现为点突变和连续缺失（郝利华，2006），此外还有过喹乙醇引发饲养场工人发生过敏和光敏感性皮炎的报道（.et002）。喹烯酮具有同样的防病和促生长作用，但毒性和致癌性却明显低于喹3C2O333HCOOC醇乙酰甲喹喹烯酮卡巴氧中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论3乙醇和卡巴氧（王玉春，1995王玉春，1993严相林，1998）。噁啉类药物的残留检测进展由于喹噁啉类药物其良好的抗菌促生长效果，该类药物在许多国家仍然被作为饲料添加剂而广泛使用，为防止食品中残留的药物通过环境或食物链对人体健康造成影响，各个国家和组织对该类药物休药期的时间、残留标示物的选择和最高残留限量都有严格的规定。有研究结果表明，喹噁啉类具有喹噁啉类动物体内易发生初级代谢，生成脱氧化合物，进而发生次级代谢，生成喹噁啉巴氧）和3喹噁啉乙醇）（et990），世界卫生组织和世界粮农组织已经确定喹乙醇和卡巴氧的残留标示物分别为3喹噁啉和喹噁啉990）。喹烯酮毒理学研究表明该化合物毒性较小，属高效、安全的饲料添加剂，但该药物作为兽药使用，仍需考虑其通过食物链作用对人体产生不良影响，故也需要建立其食用动物组织残留量监测方法并进一步确定其残留限量，喹烯酮具有同喹乙醇类似的结构母核，可能在动物体内发生类似的代谢反应，生成相同的代谢产物，因此有研究者将3喹噁啉为主要检测对象（黄玲莉，2005），并在饲喂过喹烯酮的动物组织中检测到其存在，尤其在停药后，肝脏中仍然能检测到3喹噁啉存在，因此，有研究者认为3喹噁啉以对该药物的残留进行监控。欧盟委员会认为喹乙醇的休药期不能确定,其对人体健康存在可能的不良作用,于日正式禁止喹乙醇用作促生长添加剂（998）。我国目前批准使用的喹噁啉类的药物有喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮，其中对喹乙醇的休药期规定为35天，其残留限量根据农业部2002年颁布的动物性食品中兽药最高残留限量的要求，对喹乙醇的残留检测以其代谢产物3喹噁啉规定在猪肌肉中的最高残留限量为4μg/肝脏中的最高残留限量为50μg/农业部畜牧兽医局，2002）。目前，针对喹噁啉类药物残留检测方法多为，并且研究的热点主要集中在喹乙醇和卡巴氧这两种药物上。由于喹乙醇和卡巴氧的残留标示物的标准品不易获得，我国对喹乙醇的残留检测曾多为其原型药物，1993年制定的中华人民共和国出口肉中喹乙醇和卡巴氧残留检测的行业标准（商务部，1993）,标准规定了出口肉中喹乙醇和卡巴氧残留量检验的抽样、制样和液相色谱测定方法。标准适用于出口鸡肉、猪肉、羊肉、兔肉中喹乙醇和卡巴氧原型药物残留量的检验，该方法的最低检测限为50μg/20添加浓度下，回收率在80％间。使用S联用方法对猪肝脏中喹乙醇的残留标示物3喹恶啉最低检测限（低定量限（篇文献同时也报道了对同属喹噁啉类药物的卡巴氧的残留检测方法，对卡巴氧的残留标示物喹噁啉et2005）。黄玲莉等使用对喹烯酮在鸡和猪的可食用组织中3喹恶啉残留检测方法进行了建立，最低检测限为25μg/低定量限为50μg/玲莉，2005）。迄今为止，国内外尚无使用免疫分析方法法对喹噁啉类药物在动物组织中的残留进行检测的中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论4报道，仅方法对饲料中喹乙醇原型药物的含量进行过检测，使用该方法检测饲料中喹乙醇的最低检测限为低定量限为48mg/加浓度范围内回收率在91间，并且交叉反应率试验表明针对喹乙醇的多克隆抗体对结构类似的同类药物卡巴氧具有叉反应率（et2005）。虽然报道的方法完全可以满足饲料中喹乙醇含量检测的要求，但仅从检测灵敏度上看，对于残留检测的要求还有数个数量级差距。因此，对喹噁啉化合物这一类使用量巨大，列入欧盟重点监控的违禁药物，有必要建立对其残留进行快速、灵敏、高通量检测的测方法。疫分析在残留检测中的应用免疫分析技术以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，抗原抗体的初级结合反应遵守质量作用定律，可用程来描述，所以，也有学者认为免疫分析不属于生物测定的范畴，而是使用生物材料作为试剂的理化分析技术。于1959年创立的放射性免疫分析方法公认为有机痕量分析的重大突破，因此获得了1977年诺贝尔生物医学奖（陈新建，1998）。随后相继发展起来的酶免疫分析法蔡勤仁,2002）、荧光免疫分析法et1997）和化学发光免疫分析法韩鹤友,2005）等免疫学分析方法，凭借其高灵敏性、高特异性、样品通量大、检测迅速、成本低廉的特点，在食品中兽药农药残留分析、环境污染物检测等领域得到广泛的应用。免疫反应涉及抗原抗体分子间的立体化学、电荷、氢键和偶极间的综合作用，因而具有高度的选择性，免疫分析法中应用最为广泛的是酶联免疫吸附检测（将免疫反应的高选择性和酶促反应的级联放大作用相结合，具有极高的选择性和灵敏度，在诸如药物残留分析等复杂基质中痕量组分的检测发挥着越来越大的作用。现在几乎所有重要的兽药都已经建立或正试图建立酶联免疫法的残留测定方法，如βet2005）、喹诺酮类（et2001）、磺胺类（刘智宏,1997）、阿维菌素类（李俊锁，1997）等药物的速检测方法均以研制成功。分子药物半抗原设计与合成研究进展抗体作为各种免疫分析的核心试剂，对免疫分析的灵敏度、特异性等起着至关重要的作用，因此高亲和力抗体的制备是免疫分析方法建立的关键环节。大多数兽药、毒素、环境污染物分子质量小于1000u，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原，目前制备小分子半抗原的抗体的常规方法为选择具有毒理学意义的代谢产物或原型药物作为待测物，设计合成保留待测物分子结构特征并带有活性基团的半抗原，通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备针对半抗原的特异性抗体。但对于分子质量较小的半抗原，尤其分子质量小于300u的半抗原，有时难以获得针对药物中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论5小分子的高亲和力抗体，有多篇文献对小分子半抗原不利于诱导抗体产生的因素进行过研究和综述（et1994;et1991;et1994;et2000;et1994），曾对分子质量在111到1202u的半抗原诱导产生抗体的亲和系数过研究，结果表明分子质量在334到374u的半抗原诱导产生的抗体仍能具有较高的亲和系数，但对于分子质量低于300u的半抗原，获得高亲和力抗体的可能性将显著下降，从而导致以竞争性酶联免疫吸附测定（代表的竞争性免疫分析方法灵敏度的下降（et1994）。针对由于抗体对小分子半抗原亲和力较低而导致检测灵敏度下降这一问题，国内外研究工作者做了大量的探索和研究，许多新型检测模式和级联放大系统近年来不断被孕育而生，使免疫分析所能达到的灵敏度显著提高（杨唐斌，2005），但同时也对检测条件和所需检测设备提出了更高的要求。因此，许多研究者的注意力已转移到通过半抗原设计与合成来切实提高抗体对待测物的亲和力上来。如提出的利用位阻效应的半抗原设计理念颇具指导意义，通过在人工免疫原的半抗原中合理引入不同程度的空间位阻，诱导产生的多克隆抗体可以对一系列同系物中不同大小的分子选择性的识别（et1998）。下文对近年来有关半抗原设计与合成的研究进展作一简要综述。抗原的设计原则半抗原设计的目的为使半抗原刺激机体产生特异性免疫应答，并获得对待测物分子具有高亲和力的抗体。认为在半抗原的设计中须遵循以下原则（1）免疫原中的半抗原应在分子结构、立体化学和电子分布上与待测物分子尽可能的相似（2）半抗原结构中的连接臂应不易于诱导产生臂抗体，最好使用一定长度的碳链（3）半抗原分子应具有便于与蛋白载体偶联的活性基团（如），且活性基团的存在对待测物分子的电子分布应没有影响（4）半抗原与蛋白偶联后仍应保留待测物分子的基本结构（et1998）。因此，半抗原设计的关键在于尽可能的保留原待测物特征结构，并在适当的位置引入合适的连接臂和与蛋白载体偶联活性基团（周思祥，2005）。接臂的引入为突出待测物分子的特征结构,半抗原设计时常在特征结构和载体蛋白之间引入一定长度的连接分子,即连接臂。引入连接臂是半抗原抗体制备时较为常用的方案，如在小分子半抗原33抗体制备时发现，当使用较短的连接臂或不使用连接臂时不能诱导产生针对半抗原的抗体，而具有较长连接臂的半抗原却能诱导产生针对半抗原的抗体（et2000）。人们对这种现象的解释是当连接臂较短或没有连接臂时，半抗原有可能被载体蛋白的三维结构掩盖，而当连接臂足够长时，有利于小分子半抗原充分暴露于载体蛋白的表面，便于抗原提呈细胞（其的识别。通常认为连接臂的长度最适在3－6个碳原子之间，连接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而连接臂太长又会因疏水作用而造成烷基链的折叠，导致半抗原分子仍然被载体蛋白所掩盖，也不利于抗原提呈细胞的识别（et1989）。但是有研究结果对连接臂有利于诱导抗体产生这一观点提出了质疑，如发现氨基甲酸酯类中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论6农药残杀威（半抗原连接臂长度在2－5个碳原子时，获得的抗体效价没有显著性差异（et2001）。同样在有机磷农药倍硫磷（免疫分析检测方法建立过程中，发现使用连接臂长度在2－6个C原子时制备的抗体效价无显著性差异，而且具有不同长度连接臂的免疫原制备的多克隆抗体和具有不同长度连接臂的包被原两两组合建立的间接竞争测模式之间检测灵敏度也没有显著差别（et2003）。然而发现制备免疫原和包被原时使用不同结构的连接臂、采用不同的偶联方法或改变连接臂的引入位置可以大大提高测的灵敏度（et2003）。我国研究工作者也在连接臂的引入方面做了大量探索，沈建忠等在对马度霉素的酶联免疫检测方法建立过程中，在制备免疫原时以半抗原的羧基为活性位点与载体蛋白的氨基偶联，而包被原的制备则使用引入带有氨基连接臂半抗原与载体蛋白的羧基偶联，通过改变半抗原与免疫原和包被原的键合方式，使检测灵敏度提高两到三倍（沈建忠，1999）。因此，对于一个待测物进行半抗原设计时，应对连接臂的长度、结构以及引入位置进行全面的考察和比较。性基团的引入活性基团的引入有两种方式第一种是利用待测物上已有的活性基团（H、卤素等），通过双功能试剂（如H2H2珀酸酐、戊二醛等）引入连接臂和活性基团，使之与载体蛋白偶联，具体实施方法许多专著皆有详尽介绍（杨利国，1998李俊锁，2002）。这种方案的优点是比较容易实施，但是对于一些待测物，若这些活性基团是其特征结构，或偶联后改变了分子的电子分布，则会影响抗体对待测物的识别第二种方式是直接合成待测物的带有结构的衍生物，这种方案有利于保护待测物的特征结构和分子的电子分布不受影响，但合成上有时比较困难，往往需要多步反应才能实现。如孙峰等在异丙隆（抗体制备时，以水解反应获得者与对异丙基苯异氰酸酯缩合，生成异丙隆的羧基衍生物作为半抗原（孙峰，2005）。朱国念等在克百威（抗体制备时，以呋喃酚为起始原料，经光气酰氯化、再与4备了带有羧基的半抗原（朱国念，2002）（见图1NCH25COO异丙隆b异丙隆半抗原OCH23COO3CH3OH33CH3c克百威d克百威半抗原图1丙隆、克百威及其半抗原结构式国农业科学院硕士学位论文第一章绪论7用异质半抗原使用异质半抗原是一种间接提高抗体对待测物亲和力的方法，免疫原和包被原或酶标记物有不同的半抗原结构的检测模式比使用相同半抗原的检测模式往往具有更高的灵敏度。严格的讲，上述的在免疫原和包被原或酶标记物中使用不同结构连接臂的方法也应属于异质半抗原的范畴。提出了利用位阻效应的半抗原设计理念，发现在人工免疫原的半抗原中合理引入不同程度的空间位阻，相应地所诱导产生的多克隆抗体可以对一系列同系物中不同大小的分子选择性的识别。在对北美的地区使用的三嗪类除草剂构见图1行间接竞争性测方法的建立时，发现使用与基侧链结构相同的半抗原（结构见图1免疫原半抗原时，制备的抗体对其它两种在该地区同时使用的三嗪类除草剂构见图1c）也有较强的亲和力，测结果表明有较高的交叉反应率，其中抗体对交叉反应率甚至高于当使用具有较小烷基侧链结构的半抗原（结构见图1免疫原半抗原时，制备的抗体对三种除草剂因化合物自身的空间位阻而又不同的亲和力，因而可以实现对选择性识别，对另外两种化合物的交叉反应率在10％以下（et1998）。2CHNNHC3l
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