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【求助】BSA在酶切体系中起什么作用？
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这个帖子发布于7年零62天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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在这里BSA起促进酶切效率的作用.酶切体系中,某些酶的效率可能会很低,加入BSA后,BSA可以保护其他位点不与酶反应,使得酶只与目的位点作用,提高酶切的效率.通常在双酶切体系中一种酶效率高而另一种酶效率低的话就会用到BSA,你可以在TAKALA等提供酶的公司里面查到一些酶切缓冲液的表里就会说明要用到,然后再看看酶说明书里面需要加的量就知道了.
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谢了，楼上的
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在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。在内切酶的 缓冲液的作用有两个一是 BSA是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附 。二、BSA 能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。PS：在ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA，其作用与NBS差不多，也起到稳定的作用。做western blot的时候 做封闭液，还有就是在稀释抗体的时候，PBST加BSA，效果很好的！
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生物谷里面有说,目的是保护酶的活性；机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度，防止内切酶失活.
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影响酶切的几个主要因素
影响酶切的几个主要因素：
1. 质粒DNA的质量
1）质粒DNA的质量是决定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆时，如果反复优化酶切条件后，都不能实现完全酶切，最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题。
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。
2.限制性内切酶的活性
1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小心。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。
3.限制性内切酶的用量
1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。/enzyme/login.php
这才是专家，惭愧，惭愧:o:o 得看用什么牌子酶了，现在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多，也用不了那么多倍。质粒别降解了就行，至于两条带还是三条带，做个克隆无所谓。现在用盒子提的质粒，纯度都还不错。还有是任何生物反应不可能达到完全，酶切反应不能实现完全酶切的，无论你怎么优化。金无足赤。 : Originally posted by 十口心思 at
得看用什么牌子酶了，现在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多，也用不了那么多倍。质粒别降解了就行，至于两条带还是三条带，做个克隆无所谓。现在用盒子提的 ... 做一个克隆是可以无所谓，一周不行，可以两周，甚至三周时间去做。但如果要做很多个克隆呢，或者想建一个高质量的库呢。
当然，这些只是交流，仅供参考 如果是你自己总结的经验，可以交流下。如果你用TAKARA酶以及建库就要另当别论了，我之前建库，挑了几百个克隆进行测序和酶切验证，都连进去了，认为是百分之百。后来几次扩库后，便出现空载体。说明还是没切干净，只不过几率比较低，大概再万分之一，你挑几十个克隆验证根本看出来。不过不影响库质量。用得水也挺有关系，当时我试了很多水，发现用我们自己蒸馏出的三蒸水似乎要好于Miniipore18兆欧的水。 fermentas那个网站也有，你看你的酶的说明书，其实你加入的都是远远过量的 : Originally posted by 馋猫 at
fermentas那个网站也有，你看你的酶的说明书，其实你加入的都是远远过量的 个人感觉吧，
TAKARA我感觉是最水的，不过也是最便宜 其实没那么多的讲究，加多了用的是NEB的HF也不用考虑星号活性的问题，挺好的，做个酶切实验别太纠结，如果有空载用CIP或者热敏磷酸酶就解决了，Takara的就算了，不在考虑范围内。 已经开始收费了呀 还是可以免费试用的，依然很方便 楼主给的那个test进不去。 现在好像要收费了，你可以申请免费试用 酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系、酶切反应温度、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基&&，同尾酶、同裂酶& &
1. 酶切不开或不完全
1.1 质粒问题 纯度差或残留酶切抑制物最为常见 。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，
1.2 酶的问题：确认内切酶有效&&。
【题外话：用内切酶注意】
a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。此外，有时由于操作不小心，冰盒上凝结的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出现过两次，汗....）
d. 吸取酶时的tips。我们常用来取酶的tips都是最小的那种，适合2ul和10ul的枪，但tips通常有两种，一种是最常用的短的tips，用它取酶时，tips挨着酶液后，枪几乎是要插入管子，有时会在枪身上沾上酶液。因此，可能会产生污染。那么我们必要非常注意动作，要么就换用另一种长的 tips，专门去酶液用。
1.3 buffer问题。有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分，有时酶切的buffer没有完全融化时，buffer的浓度是不均一的。新的buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会变低。通常，这种影响不大，但如果是使用一些对离子浓度敏感的内切酶时就会出现问题。
1.4 双酶切的buffer选择：确认使用的是正确的buffer和反应温度[具体可以参考各厂家提供的酶切buffer以及双酶切buffer的资料，其中，NEB的可以参见
http://www./cn/tech/re/double_digests.htm
var cpro_id = 'u1216994';
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酶切的影响因素
最近酶切总是出现各种状况，明明rpc监测有目的条带&&可是酶切之后什么也没有，我想把pcr产物多加点&&但是也不知道会是什么结果，求酶切的影响因素。比如各种离子的影响。我用的是takara家的酶
说的太模糊了，让大家不好回答的。 按说明书的体系加不会有问题啊，宝生物的酶还是挺好用的
不知道你是PCR完直接酶切的还是低温保存一段时间后酶切的？有一次将-20度保存的产物酶切，吸取的时候没混匀，酶切下来没东西~~~ 4度保存了一段时间&&说明说的体系啊&&我的pcr产物没法定量
var cpro_id = 'u1216994';
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如果片段连入表达载体,酶切鉴定目的带特别淡时,表达蛋白时会受影响吗?
提问者采纳
首先肯定酶切鉴定目的条带很淡不会影响后续的蛋白表达。表达载体的构建是否成功，酶切鉴定只是第一步鉴定结果，目的条带的深浅有很多影响因素，例如酶切时质粒浓度，插入片段的长短，是否酶切完全等。最重要的是，要将获得的构建质粒送过去测序，如果测序结果正确，这就表明表达质粒构建成功。只要表达质粒构建成功就可以用于后续的蛋白表达。只要质粒测序正确，目的条带酶切时的条带深浅是与蛋白表达的是否成功没有任何联系.
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