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钾离子通道调节剂高通量筛选技术平台的建立及先导化合物筛选
KCNQ离子通道基因突变与许多遗传疾病有关，目前发现共有KCNQ1-5五个亚型。其中KCNQ1与KCNE1共同编码组成心肌上的延迟整流钾离子通道，该通道的突变可以引起遗传性QT间期延长综合症，并可致耳聋。KCNQ2和 KCNQ3通道共表达产生的电流已经被证实是颈上交感神经节记录到的M电流分子基础。KCNQ2/3基因突变或M通道功能失调与良性家族性新生儿惊厥症、阿尔兹海默病和癫痫等疾病的发生密切相关。KCNQ2/3通道的开放剂瑞替加滨降低神经元兴奋性，可用于治疗与过度神经元兴奋相关的疾病，如惊厥、癫痫和神经性疼痛等。KCNQ4钾离子通道由于其基因突变导致人类耳聋耳鸣等疾病，已成为耳聋耳鸣防治药物的潜在靶点。因此，对KCNQ钾通道和Kir2.3钾通道靶点的调节剂研究有重要的潜在应用价值。　　
人们对钾离子通道的调节剂广泛需求促进了其高通量筛选技术的广泛发展，其低消耗，快速，灵敏，准确和高通量等特点更为适合我国的新药研发技术领域的需求。　　
一、钾离子通道调节剂高通量筛选技术平台的建立和优化　　
目的：在建立KCNQ2/3、KCNQ4和Kir2.3钾离子通道稳定表达细胞系的基础上，建立和优化原子吸收Rb+流出测定高通量筛选技术，并完成近150多种化合物的筛选。　　
方法：(1)建立稳定表达Kir2.3通道蛋白的HEK293细胞株：用Lipofectin 2000转染试剂将Kir2.3通道基因转染到HEK293细胞，经G418筛选，用全细胞膜片钳技术检测Kir2.3通道蛋白在HEK293细胞中的功能。(2)建立和优化原子吸收Rb+流出测定高通量筛选技术：配制浓度梯度铷标准溶液和设置10个相同浓度铷标准溶液，测定ICR8000系统的准确度和灵敏度；配制KCl浓度梯度去极化缓冲液，观察其对Rb+外流的影响，寻求最佳胞外钾浓度；将稳定表达KCNQ2/3、KCNQ4和Kir2.3通道细胞接种于96孔培养板，给予含有待测化合物的去极化外液，观察其对Rb+外流的影响从而完成钾通道调节剂的筛选。　　
结果：(1)G418筛选培养14天形成阳性克隆。经全细胞膜片钳技术鉴定，该细胞系表达的Kir2.3通道电流具有内向整流特性。在高钾外液条件下翻转电位0mV，与等浓度高钾条件下由Nerst方程所得的钾平衡电位相符，并且Ba2+能够有效地抑制Kir2.3的电流。(2)①采用RbCl标准品，配制浓度梯度铷标准溶液，通过原子吸收测定仪ICR8000系统测量标准溶液吸收度，实验结果表明ICR8000系统灵敏度很高，达到ppm单位级；标准曲线相关系数R值可达0.999；重复测定10个标准溶液浓度标准差SD为3.66[％]，变异系数CV为3.46[％]，均小于5[％]。②含20 mM KCl去极化缓冲液可以刚刚引起Rb+小量外流，是最佳胞外钾浓度。③通过高通量筛选技术测得，对照药Retigabine可以明显增加细胞内Rb+外流，且EC50值在0.05-0.15 mM，与文献报导相符合(3)通过采用上述原子吸收Rb+流出测定的高通量筛选技术，我们已初步完成对近150种化合物的筛选。其中系列Ⅰ代表化合物QO-26、QO-28、QO-58和QO-60具有激活KCNQ2/3通道的作用，EC50值分别为2.27±1.02 mM、1.46±0.36 mM、0.06±0.01 mM和0.15±0.02 mM。系列Ⅱ代表化合物KG-1和KG-25 EC50值分别为3.8±0.36 mM和2.29±0.67 mM。系列Ⅲ代表化合物JM3和JM4 EC50值分别为1.67±0.89 mM和2.41±0.78 mM。(4)KCNQ4钾通道靶点的筛选方法与KCNQ2/3通道靶点的筛选方法相同。其中代表化合物QO-26和QO-28 EC50值分别为23.92±0.43mM和21.73±9.72 mM。(5)BaCl2明显抑制表达Kir2.3通道的细胞内铷离子的流出至未给药对照组的71.6[％]，与文献相符。100 mM QO-28和300 mM QO-28分别使表达Kir2.3通道的细胞的铷离子流出量减少至对照组的51.7[％]和增加至对照组的131.7[％]；30 mM QO-58和100 mM QO-58分别使铷离子流出量减少至对照组的75.5[％]和增加至对照组的131.9[％]。　　
结论：(1)成功建立起稳定表达Kir2.3钾通道HEK293细胞株。(2)成功建立以KCNQ2/3通道为靶点的高通量筛选平台，并完成近150种化合物的筛选，筛选出能够开放KCNQ2/3通道作用的三个系列具有创新性结构的，近38个化合物具有开放KCNQ2/3通道的作用，其中26个化合物是首次合成。(3)成功建立以KCNQ4通道为靶点的高通量筛选平台，完成对近100种化合物的筛选，筛选出14个具有开放KCNQ4通道作用的化合物，与开放KCNQ2/3通道的化合物相同。(4)成功建立以Kir2.3通道为靶点的高通量筛选平台，并发现QO-28和QO-58对Kir2.3通道作用为低浓度抑制高浓度开放。　　
二、利用膜片钳技术对高通量筛选所得钾通道开放剂的深入研究目的：进一步验证我们建立的高通量筛选方法是否成功，并选取代表化合物对其作用特征进行较为深入研究。　　
方法：利用电生理膜片钳技术，观察由高通量筛选所得钾通道开放剂对KCNQ2/3和KCNQ4通道电流的影响，并深入观察代表化合物QO-28和QO-58作用特征。　　
结果：(1)100 mM浓度的QO-26、100 mM浓度的QO-28、10 mM浓度的QO-58和10 mM浓度的QO-60号化合物都可以明显增大-40 mV电压下KCNQ2/3通道电流，激活通道电流幅度与10 mM RTG 相近。(2)10 mM浓度的QO-58、QO-60、KG-1和KG-5都可以明显增大-40 mV、-20 mV、0 mV电压下KCNQ4通道电流，增大电流幅度均高于10 mM RTG。(3)化合物QO-28对钾通道选择性的研究:①QO-28先增加后抑制KCNQ1钾通道电流，并使KCNQ1通道电流动力学特点由慢激活改变为快激活。②QO-28先增加后抑制Kir2.3钾通道电流。(4)化合物QO-58能够剂量依赖性增大KCNQ2/Q3电流，以-40mV电压下最大激活电流值为1标准化，用logistic方程对其进行拟合量效关系曲线得EC50=2.30±0.86 mM，斜率为0.60±0.14。(5)化合物QO-58能够剂量依赖性增大KCNQ4电流，以-40mV电压下最大激活电流值为1标准化，用logistic方程对其进行拟合量效关系曲线得EC50=0.60±0.09 mM，斜率为0.91±0.13。(6)QO-58能够将KCNQ2/Q3通道电压激活曲线向超极化方向移动，并呈浓度依赖性作用。10 mM QO-058能够将其半数最大激活电压 从给药前的-13.2±0.1 mV左移至-58.2±0.2 mV。(7)QO-58能够将KCNQ4通道电压激活曲线向超极化方向移动。10 mM QO-058将其半数最大激活电压 (V1/2)从给药前的-22.0±1.4 mV左移至-80.7±2.9 mV。(8)10 mM QO-058能够显著增强大鼠背根神经元中的M电流，其作用强度与10 mM 瑞替加滨相当，可引起通道电流增大25[％]。(9)100 mM QO-58可以引起KCNQ1/KCNE1通道电流增大1倍。　　
结论：(1)电生理膜片钳技术确证KCNQ2/3通道和KCNQ4通道靶点高通量筛选结果。(2)化合物QO-28对KCNQ1钾通道电流和Kir2.3钾通道电流具有先增加后抑制作用。(3)化合物QO-58呈剂量依赖性增大KCNQ2/Q3通道和KCNQ4通道电流，其EC50值分别为2.30±0.86 mM和0.60±0.09 mM。(4)化合物QO-58呈剂量依赖性使KCNQ2/3和KCNQ4通道电压依赖性激活向超极化方向移动。(5)化合物QO-58能够增大大鼠背根神经元中的M电流。(6)化合物QO-58能够增大KCNQ1/KCNE1通道电流。　　
总结：　　
1.成功建立起稳定表达Kir2.3钾通道HEK293细胞株。　　
2.成功建立以KCNQ2/3通道为靶点的高通量筛选平台，并完成近150种化合物的筛选，筛选出能够开放KCNQ2/3通道作用的三个系列具有创新性结构的，近38个化合物具有开放KCNQ2/3通道的作用，其中26个化合物是首次合成。　　
3.成功建立以KCNQ4通道为靶点的高通量筛选平台，完成对近100种化合物的筛选，筛选出14个具有开放KCNQ4通道作用的化合物，与开放KCNQ2/3通道的化合物相同。　　
4.成功建立以Kir2.3通道为靶点的高通量筛选平台，并发现QO-28和QO-58对Kir2.3通道作用为低浓度抑制高浓度开放。　　
5.电生理膜片钳技术确证KCNQ2/3通道和KCNQ4通道靶点高通量筛选结果。　　
6.化合物QO-28对KCNQ1钾通道电流和Kir2.3钾通道电流具有先增加后抑制作用。　　
7.化合物QO-58呈剂量依赖性增大KCNQ2/Q3通道和KCNQ4通道电流，其EC50值分别为2.30±0.86 mM和0.60±0.09 mM。　　
8.化合物QO-58呈剂量依赖性使KCNQ2/3和KCNQ4通道电压依赖性激活向超极化方向移动。　　
9.化合物QO-58能够增大大鼠背根神经元中的M电流。　　
10.化合物QO-58能够增大KCNQ1/KCNE1通道电流。
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万方数据电子出版社机械敏感性门控离子通道
当活细胞和有机体受到环境中的机械刺激时，机械信号随即转化成生物信号，使细胞作出反应，此过程称为机械转导，这是从细菌到人类所有活的有机体共有的特征。生物体对机械刺激产生反应和适应的能力在许多生理现象中起重要作用，如听觉和平衡的产生、体液平衡和血压、多精授精的防止、细胞体积和形状调控、细胞移动、组织生长和形态发生等。
机械刺激包括高频震动、渗透压的变化、静水压和液体的剪切力等。机械信号的转导有多种途经，每种途径都能筛选出相关的刺激和过滤掉无关的刺激。
在机械信号转导过程中，机械敏感性离子通道（mechanosensitive channel，MS通道）起了很重要的作用。
脊椎动物内耳毛细胞是非常灵敏的机械感受器,将机械能(声波)转换成电化学信号。正向偏转静纤毛束,能快速开启纤毛尖端的离子通道。这些通道直接受通道蛋白机械力的门控,称为机械门控类离子通道。在其它系统中已鉴定多种机械门控通道,但,毛细胞转导通道的分子机制还不很了解。困难在于内耳通道蛋白相当稀少。
来自清华大学生命科学学院，中科院上海药物研究所等处的研究人员首次报道了一种具有阴离子选择性的机械敏感性离子通道的晶体结构，并指出了一种β-barrel结构对这种通道离子选择性的重要意义。相关成果公布在《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上。
文章的通讯作者是清华大学生科院杨茂君研究员，以及上海药物研究所李扬研究员。其中杨茂君研究员早年毕业于吉林大学生命科学院，曾师从王琳芳院士，饶子和院士。他主要从事结构生物学领域的研究工作，曾于2003年在世界上第一个解析了SARS病毒主要蛋白酶的晶体结构，并且发现一种经过修饰的底物类似物可以有效地抑制这一蛋白酶的活性，为设计抗SARS的药物打下了坚实的基础。
生物膜离子通道（ion channels of
biomembrane）是各种无机离子跨膜被动运输的通路。离子通道的开放和关闭，称为门控，根据门控机制的不同，离子通道被分为三大类：电压门控性，又称电压依赖性或电压敏感性离子通道；配体门控性，又称化学门控性离子通道；机械门控性，又称机械敏感性离子通道。
其中机械门控性，即机械敏感性离子通道（Mechanosensitive，MS）是指一类感受细胞膜表面应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道，根据通透性分为离子选择性和非离子选择性通道，根据功能作用分为张力激活型和张力失活型离子通道。这类通道广泛存在于所有原核和真核细胞中，是地球上最古老以及最广泛存在的生物膜上的孔洞。当细胞感受到机械刺激时，这类离子通道可以打开，使溶液中的某些离子被动地顺着浓度梯度通过生物膜。
研究证明，细菌Ms通道，比如典型的大肠杆菌机械敏感性离子通道在低渗情况下能释放渗透剂，然而科学家们对于其离子选择机制，却不是十分清楚。
据报道在这篇文章中，研究人员克隆并检测了60多个物种的MscS的离子选择性，最终成功鉴定到了一个具有强阴离子选择性的通道蛋白。经过多年的不懈努力，研究组解析了其晶体结构并对其离子选择机制进行了研究。
大量电生理学实验证明，该离子通道之所以具有阴离子选择性主要是因为位于该通道胞内区底部的β桶结构域可以选择性的透过水合阴离子(图A)。
长久以来，基于对细菌MscS的研究，人们一直认为离子进入这类通道是通过位于其胞内区侧面的7个孔洞。然而，杨茂君研究组通过对晶体结构的分析发现，相比7个孔洞而言，位于该通道胞内区底部的β桶结构域很可能是更主要的离子入口。
令人惊奇的是，体内和体外的电生理实验表明，将该通道和大肠杆菌MscS的β桶结构域互换之后，两个通道的离子选择性竟然也随之互换，这充分验证了他们之前的推测。通过进一步的突变体实验，杨茂君研究组成功找到了该结构域介导离子选择性的关键氨基酸残基，进而提出了该通道的阴离子选择机制模型(图B)。
多年以来，离子通道的离子选择机制一直是生物学的研究热点。Roderick
MacKinnon更是因为在钾离子通道结构和机制研究中的杰出贡献获得了2003年的诺化学奖。相比之下，阴离子通道的离子选择机制则一直存在争议。
这项研究为理解阴离子如何被通道蛋白所选择这一基本问题提供了新的视点，同时也为研究这类最古老的通道蛋白提供了新的思路。
图A， MscS七聚体蛋白质结构。
MscS选择阴离子的可能机制。其中绿色为水合状态的氯离子，粉色为水合状态钾离子
体内存在不少能感受机械性刺激并引致细胞功能改变的细胞。如内耳毛细胞顶部的听毛在受到切和力的作用产生弯曲时，毛细胞会出现暂短的感受器电位，这也是一种跨膜信号转换，即外来机械性信号通过某种结构内的过程，引起细胞的跨膜电位变化。据精细观察，从听毛受力而致听毛根部所在膜的变形，到该处膜出现跨膜离子移动之间，只有极短的潜伏期，因而推测可能是膜的局部变形或牵引，直接激活了附近膜中的机械门控通道。
听觉的产生是由于毛细胞顶部膜中有机械门控通道的存在,听毛受力引起该处膜的轻微变形,就足以改变这种通道蛋白质的功能状态,引起跨膜离子移动和相应的电位改变。
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TRP离子通道_图文
导读：ＴＲＰ离子通道，钙离子作为一种第二信使，钙通道的钙流人升高胞浆钙，质膜上钙通道的种类常因组织部位的不同而不同，电压门控钙通道（ｖｏｌｔａｇｅ―ｇａｔｅｄ，ＶＧＣＣ）开放带进大量的钙离子，但该类受体本身就是非选择性阳离子通道，配体和胞外受体部位的结合引起通道的开放，这类钙通透性离子通道受体又可称为配体门控钙通道（１ｉｇａｎｄ―ｇａｔｅｄｃａｌｃ，大多数非兴奋性细胞中存在另一类钙通道，即受体激活的
Ｍａｒ．２００４２０（２）１９７～２０４
神经解剖学杂志
（ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ）
ＴＲＰ离子通道
（第四军医大学基础医学部人体解刹学教研室，梁镓琚脑研究中心，话安７１００３２）
钙离子作为一种第二信使，在许多细胞功能中发挥着重要作用。短期的，如递质、腺体分泌，肌肉收缩；长期的，如细胞分化、程序死亡等ｎ］。正常细胞都有一套完善的体系来维
依赖ＰＬＣ信号通路，因此被视为ＲＡＣＣ的首要候选分子。围绕ＴＲＰ的研究正如火如荼地展开，本文对其研究状况进行简单综述。
持钙的内稳定平衡。内质网／肌浆网的钙释放和来自质膜上
钙通道的钙流人升高胞浆钙，而同时位于这两个部位的ｃａ”一泵也不断地将胞浆钙储存回钙库或泵出胞外。质膜上钙通道的种类常因组织部位的不同而不同。在兴奋性细胞中，伴随着动作电位的产生，电压门控钙通道（ｖｏｌｔａｇｅ―ｇａｔｅｄ
ｃａｌｃｉｕｍ
ＴＲＰ的发现
ＴＲＰ基因首次发现于黑腹果蝇的视觉传导系统中。
１９７５年Ｍｉｎｋｅ等ｎ］在筛选突变体时发现了一株奇特的表现型。与野生型的光诱导反应不同，这株突变体对持续性光刺激只产生瞬时而非持续性的感受器电位（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｃｈａｎｎｅｌ，ＶＧＣＣ）开放带进大量的钙离子，以维持神
经递质分泌或肌细胞收缩。ＮＭＤＡ受体和Ｎ型乙酰胆碱受体等的激活是神经细胞内另一个重要的钙来源，但该类受体本身就是非选择性阳离子通道，配体和胞外受体部位的结合引起通道的开放。因此，这类钙通透性离子通道受体又可称为配体门控钙通道（１ｉｇａｎｄ―ｇａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ，ＬＧＣＣ）。与兴奋性细胞不同，大多数非兴奋性细胞中存在另一类钙通道，即受体激活的钙通道（ｒｅｃｅｐｔｏ卜ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎ－ｎｅｌ，ＲＡＣＣ）。刺激磷脂酶Ｃ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ，ＰＬＣ）特异性的Ｇ蛋白偶联受体或ＰＬＣ，特异性的受体酪氨酸激酶激活该类通道。由于活化的ＰＬＣ水解４，５一二磷酸磷脂酰肌醇（ＰＩＰ２）而产生肌醇三磷酸（ｉｎｏｓｉｔａｌ１，４，５一ｔｈｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＩＰ。）和甘油二酯（ｄｉａｃｙｌ９１ｙｃｅｒ０１，ＤＡＧ），前者作用于钙库ＩＰ３
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）。最初，他们认为这种表现型是由于钙的兴奋性耗竭，因为剥夺野生型的视觉感受器钙离子一个小时，可以诱导出与突变体完全相同的对光反应症状。随后他们发现镧离子可以阻断野生型感受器电位的持续性，而使之展现突变体表征［６］。因为镧离子是周知的非选择性钙离子通道的阻断剂，这一发现提示突变体的表征可能并不是由于细胞内钙离子匮乏，而是由于某种未知的钙离子通道功能受阻。进一步的膜片钳实验发现，野生型和突变型的光反应具有不同的离子选择性，前者对钙离子的通透性是后者的十倍以上，提示这两种对光表现可能是由不同的钙离子通道介导的［７］。１９８９年Ｍｏｎｔｅｌｌ等［８］克隆了ＴＲＰ基因，发现将其表达于突变体可以挽救其对光反应缺陷。三年后，另一个与ＴＲＰ有４０％同源性的新基因被克隆，并命名为ＴＲＰ样（ＴＲＰ一１ｉｋｅ，ＴＲＰＬ）基因。ＴＲＰ和ＴＲＰＬ与电压门控钙通道在跨膜区域具有很大的同源性，显示这两个蛋白可能是功能性的离子通道。对突变体实行ＴＲＰＬ基因敲除，能消除其所有的对光反应；同时突变这两个基因则导致野生型全部的对光反应消失［９］。至此，野生型和突变型表征的分子机制终于走出了迷雾。ＴＲＰ和ＴＲＰＬ参与果蝇对光反应；野生型果蝇具有这两种离子通道，所以展现正常的对光反应，而突变体由于缺少ＴＲＰ通道而表现出一过性的瞬时感受器电位表征。
受体释放内钙造成钙库清空／枯竭（ｓｔｏｒｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎ），后者激活蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ＰＫＣ）。长期以来关于ＲＡＣｃ的激活机制，有钙库作动性（ｓｔｏｒｅ―ｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ，ｓｏＣＣ）和受体作动性（ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿ｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ，ＲＯＣＣ）两种争论［２。４］。前者是指通道的开放取决于钙库的枯竭状态，后者是指通道的开放与钙库状态无关，而与受体激活后所产生的第二信使的直接作用有关（图１）。ＲＡＣｃ是一类极为多样的复杂群体，其生物物理特征常因细胞种类的不同而各异，如在肥大细胞和Ｔ淋巴细胞中，ＲＡＣＣ表现为高钙选择性、小单通道电导，通道激活严格依靠钙库状态的ＳＯＣＣ，而在人胚肾细胞和主动脉平滑肌细胞中则表现为低钙选择性的ＲＯＣＣ。导致ＲＡＣＣ激活机制颇有争议的关键原因在于这类钙通道的分子实体一直未能阐明。
ＴＲＰ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ
２．哺乳类ＴＲＰ同源物及其命名和分类
在ＴＲＰ和ＴＲＰＬ被发现的基础上，利用ＥＳＴ数据库，
通过ＲＴ―ＰＣＲ以及基因克隆表达等技术，七种与果蝇ＴＲＰ／ＴＲＰＬ具有高度同源性的哺乳类基因（ＴＲＰＣＩ―７）已被克隆鉴定‘”。１“。其它同源性较低且功能差异较大的基因也陆续被
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）基因的克隆为这一领域打
开了新局面。由于该基因编码钙通透性离子通道，且激活也
１９８神经解剖学杂志第２０卷第２期２００４年３月
发现，如与痛觉传导有关的ＶＲ、ＶＲＬ基因［”“…，介导上皮细胞钙离子吸收的钙通道基因（Ｅｃａｃ／ＣａＴｌ）以及在黑色素瘤细胞中发现的黑素瘤基因（ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ）等［１“２０］。由于ＴＲＰ领域是一个相对较新的领域，新基因日新月异，不断涌现，截至目前，２０多种ＴＲＰ同源基因已经被克隆。在研究初期，同一个基因常因发现实验室的不同而命名各异，导致命名混乱。通过同源检索筛选线虫基因组，Ｈａｒｔｅｎｅｃｋ等［２１］根据蛋白长短和同源性将ＴＲＰ家族分为三类：短（ＳＴＲＰＣ）、长（ＬＴＲＰＣ）和渗透压感受性ＴＲＰ（０ＴＲＰＣ）。哺乳类ＴＲＰＣＩ―７被戈０归为ＳＴＲＰＣ（ＳＴＲＰＣＩ―７），ＶＲ、ＶＲＬ、ＥＣａＣ／ＣａＴｌ被归为０ＴＲＰｃ（０ＴＲＰｃｌ―３），而ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ及其类似物则被归于ＬＴＲＰＣ。最近，以Ｍｏｎｔｅｌｌ为首的ＴＲＰ命名委员会又郑重提出另一套新的命名方法，以上的ＳＴＲＰＣ、０ＴＲＰｃ、ＬＴＲＰＣ分别被重新命名为ＴＲＰｃ（ＴＲＰＣＩ―７）、ＴＲＰＶ（ＴＲＰＶｌ―６）、ＴＲＰＭ（ＴＲＰＭｌ―８）［２“。在此命名中，Ｃ代表ｃａｎｏｎｉｃａｌ或ｃｌａｓ―ｓｉｃａｌ，表示此家族和原型的果蝇ＴＲＰ／ＴＲＰＬ的同源性较高；Ｖ代表ｖａｎｉｌｌｏｉｄ，以纪念该家族第一个成员ＴＲＰＶｌ被ｖａｎｉｌ＿
ｌｏｉｄ（辣椒素类物质）类化学物质所激活；Ｍ代表ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ，源于家族中第一个成员ＴＲＰＭｌ被克隆的细胞名。ＴＲＰＶ和ＴＲＰＭ与果蝇ＴＲＰ同源性较低，且其激活和调节机制也呈现不同的趋势，因而又被称之为ＴＲＰ相关蛋白。除此而外，ＴＲＰ相关蛋白还包括一些在结构上与果蝇ＴＲＰ有联系，而功能却差异很大的另一些遥远的亚家族（ｒｅｍｏｔｅＴＲＰｓｕｂ―ｆａｍ订ｉｅｓ）：ＴＲＰＮ，ＴＲＰＰ和ＴＲＰＭＬ。ＴＲＰＮ包括两个成员，目前只在果蝇和黑腹线虫体内被克隆，与其机械性感受有关。ＴＲＰＮ可能只局限性分布于无脊椎动物体内，因为自２０００年这两个基因被克隆以来，并未见任何同源基因从哺乳类基因组中被钓出。ＴＲＰＰ是与人类先天性疾病多囊肾密切相关的一个亚家族，包括３个成员，该类基因突变可以导致肾脏发生囊肿性病变。ＴＲＰＭＬ基因突变可以引起ＩＶ型粘膜脂质沉积而最终导致神经变性性疾病。由于对后三个亚家族的研究较少，故仅在此稍作说明，后续介绍中将不多提及。ＴＲＰ基因超家族的系统发生如图２所示。
激活ＴＲＰ通道的信号转导通路。神经递质和生长因子等分别作用于Ｇ蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶，激活磷脂酰肌醇信号通路，产生两个第二信使ＩＰ。和ＤＡＧ。前者作用于内质网ＩＰｓ受体引起钙库钙释放和钙库清空，后者可被代谢为花生四烯酸（ＡＡ）和亚麻酸（ＬＡ）等。目前认为，这两个信号支路都可以激活ＴＲＰ通道。钙库清空诱发ＴＲＰ通道激活所导致的钙流人为钙库依赖性钙流人（ｓｏｃＥ），负载的通道为钙库作动性钙通道（ｓＯｃｃ）；而ＤＡＧ及其脂质代谢物激活ＴＲＰ通道所导致的钙流人为受体作动性钙流入（ＲＯｃＥ），负载的通道为受体作动性钙通道（ＲＯＣｃ）。
ＴＲＰ的分子结构
计算机辅助序列分析显示ＴＲＰ蛋白具有六次疏水的跨
以上的结构特点，ＴＲＰ相关蛋白却或多或少地呈现结构特异性：ＴＲＰＶ缺少ｃ末端的多聚脯氨酸序列，而ＴＲＰＭ则缺少Ｎ末端锚蛋白样重复。另外，ＴＲＰＮ不具有在其他五个亚家族中都高度保守的ＴＲＰ结构域，但其Ｎ端却具有高达２９个的锚蛋白样重复序列；ＴＲＰＰ与ＴＲＰＭＬ相似，不具有锚蛋白重复序列和ＴＲＰ结构域，但在第一和第二跨膜区之间却有很长的连接片断，形成胞外环。总之，不同的ＴＲＰ亚家族虽具有自身的结构特点，但它们都具有高度保守的六次跨膜结构。这种结构和电压门控离子通道（ｖｏｌｔａｇｅ―ｇａｔｅｄｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＧＩＣｓ）如钙通道、钠通道和部分钾通道的ａ亚单
膜结构，在第五和第六节段之间有一内嵌的发卡通道结构，其氨基端和羧基端都位于细胞内。氨基端同源性较高，多含有２到４个保守的锚蛋白（ａｎｋｙ“ｎ）样重复，可能与通道蛋白的细胞膜锚定有关。羧基端变异性较大，与ＴＲＰ通道的自身调节有关。除了紧邻第六跨膜节段的ＴＲＰ结构域和多聚脯氨酸序列较为保守之外，其下游含有各种多样化的调节位点，如钙调蛋白／ＩＰｓ受体结合位点，ＰＫＡ／ＰＫＣ调节位点，以及ＰＤｚ结合序列。有些ＴＲＰ通道蛋白（部分ＴＲＰＭｓ），Ｃ端还分布有激酶结构域，因而称之为通道酶。ＴＲＰ家族的分子
位相类似，所不同的是ＴＲＰ蛋白的第四跨膜节段不具有感
受电压变化的碱性氨基酸。另外，ＶＧＩＣｓ的ａ亚单位基因编
结构模式图如圈３所示。虽然果蝇ＴＲＰ和ＴＲＰＣ家族满足
史娟等：ＴＲＰ离子通道
码四次重复的六次跨膜结构，而ＴＲＰ基因只编码单个的非重复的六次跨膜结构。但已有研究提示，同一或不同的ＴＲＰ蛋白可能通过形成同源或异源四聚体参与在体生理功能调
节。因此，ＴＲＰ是一类与ＶＧＩｃｓ从进化上有关联的离子通道，目前已被囊括于电压门控离子通道基因超家族之中。对其激活和调节机制的研究是目前该领域的热点之一。
ｆＯｓｍＯ―ｓｅｎｓａｔｉＯｎｔｈｅｍｌ０．ｓｅｎｓａｔｉＯｎ）
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的一个研究热点。在果蝇的基因组中，ｒｄｇＡ基因突变不但致
盲且诱发严重的视网膜溃变。最近，大量有力的证据阐明了
图２人ＴＲＰ蛋白的系统发生树。为ｃＬＵＳＴＡＬｗ氨基酸序列同源性排序结果。由于ＴＲＰｃ２在人类为假基因，故用鼠类
ＴＲＰｃ２代替。小括弧内所注为目前已报道的ＴＲＰ通道可能的病理生理功能（详见文中）。前缀ｄ，ｈ和ｍ分别代表果
蝇（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、人（ｈｕｍａｎ）和小鼠（ｍｏｕｓｅ）。
ＴＲＰ的激活机制
４．１果蝇光敏感通道
脊椎动物视觉转导的分子机制我们已经非常熟悉。在视杆细胞中，视紫红质吸收光子产生构象变化激活Ｇ蛋白（Ｇｔ），活化的Ｇｔ激活磷酸二酯酶（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ，ＰＤＥ）促使ｃＧＭＰ水解为ＧＭＰ，受ｃＧＭＰ门控的环核苷酸激活的阳离子通道关闭引发细胞膜超极化。因此脊椎动物光诱发反应的结果是离子通道的关闭。与此不同，果蝇等无脊椎动物的视觉转导依靠ＰＩ，Ｃ信号通路，因为ＰＬｃ基因突变致盲。位于视感受器微绒毛上的视紫红质吸收光子，激活与其偶联的Ｇｑ蛋白导致ＰＬｃ的激活，后者水解ＰＩＰ。产生ＩＰ。和ＤＡＧ。这两个第二信使分子以某种尚不清楚的分子机制激活ＴＲＰ／ＴＲＰＬ非选择性阳离子通道引起细胞膜去极化（参考图１）。因此，果蝇的对光反应的结果是离子通道的开放。但ＴＲＰ／ＴＲＰＬ究竟如何被激活？在研究早期，人们认为钙库清空最有可能介导通道激活，因为ＩＰ。可以作用于内质网或肌浆网上的ＩＰ。Ｒ释放内钙而清空钙库。直接的证据来自各种异源表达研究。将ＴＲＰ或ＴＲＰＬ基因表达于昆虫ｓｆ９细胞和非洲蟾蜍卵母细胞，发现ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（一种抑制钙库ｃａ“一ＡＴＰ酶从而被动清空钙库的药物，一般用作在体ＳｏＧｃ研究的激动剂）可以激活该通道［２“２“。然而，这种机制却被在体研究所否认，因为ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ并不能代替光子兴奋果蝇的光感受器［２“，而且基因敲除ＩＰ。受体也不对果蝇的正常视反应造成明显影响［２“。因此，钙库清空并不是光诱导反应的生理激活机制。ＤＡＧ及其代谢物参与激活光敏感通道是目前
这一表现型的分子机制。利用电生理膜片钳技术，Ｒａ曲ｕ
等［２７］发现ｒｄｇＡ突变体的光敏感通道持续性开放。同时突变ｔｒｐ和ｔｒｐｌ不但消除以上的持续性电流而且大大阻碍视网膜溃变进程。这说明ｒｄｇＡ基因突变导致果蝇光敏感通道的失活机制障碍。果蝇的ｒｄｇＡ基因编码ＤＡＧ激酶．该激酶可通过促进肌醇磷脂的再循环而下调胞内ＤＡＧ含量。因此，ｒｄｇＡ基因突变可以导致胞内ＤＡＧ堆积而形成对ＴＲＰ／ＴＲ―ＰＬ的持续性刺激。ＴＲＰ和ＴＲＰＬ都是钙通透性离子通道，特别是前者具有很高的钙选择性，持续性开放可能导致钙超载而诱发视网膜溃变。ＤＡＧ的这种激活作用在重组表达实验中得到了证实。ＤＡＧ的另一作用是激活ＰＫＣ，但ＰＫＣ似乎不参与激活过程而与通道的反馈性调节有关，因为该基因缺失只导致通道失活障碍和光适应缺陷［２…。另外，ＤＡＧ还可被ＤＡＧ脂酶降解为不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、亚麻酸、亚油酸等。现已证明不饱和脂肪酸也可以直接激活ＴＲＰ和ＴＲＰＬ通道，并且不依赖ＰＬＣ的存在［２…。以上结果说明ＤＡＧ及其下游代谢物可能激活果蝇光敏感通道，但最近有人指出ＤＡＧ的上游前驱物质ＰＩＰ。也可以对ＴＲＰ通道的活
动起调控作用［３…。在静息状态下，大量的ＰＩＰ。分子聚集在通道周围对其进行紧张性抑制，激活的ＰＬｃ水解ＰＩＰ。通过去
抑制效应而导致通道的开放。因此，ＰＩＰ。、ＤＡＧ及其脂质代谢物很可能代表了果蝇光敏感通道的内源激活机制。鉴定ＴＲＰ通道未知的配体结合区，生化分析光诱导脂质代谢将
神经解剖学杂志第２０卷第２期２００４年３月
最终阐明果蝇的视转导机制。
ＴＲＰＣ通道
在ＴＲＰｃ、ＴＲＰＶ和ＴＲＰＭ的三个亚家族中，ＴＲＰＣ与
果蝇ＴＲＰ／ＴＲＰＬ同源性最高且激活机制都依赖ＰＬＣ信号通路，因而被认为是最可能的ＳＯＣＣ和ＲＯＣＣ的分子基础。其他的两个家族，ＴＲＰＶ感受体内外物理和化学刺激，被认为是快速的配体门控型离子通道；ＴＲＰＭ则通过其它物质，如ＡＤＰ核糖（ＴＲＰＭ２）、Ｍ９２＋／ＡＴＰ下调（ＴＲＰＭ７）等方式来激活。因此，本文只集中于对ＴＲＰｃ家族激活机制进行讨论。由于该领域的研究才刚刚展开，结论性的东西很少，我们只是对各家的研究结果作综合叙述。根据结构同源性和功能倾向性ＴＲＰｃ家族可划分为四个皿群，ＴＲＰｃｌ、ＴＲＰＣ２、ＴＲ―ＰＣ４／５和ＴＲＰＣ３／６／７。
４．２．１
ＴＲＰＣＩ
ＴＲＰｃｌ是第一个被克隆的最短的哺乳
类ＴＲＰ，与果蝇ＴＲＰ有４０％左右的同源性，广泛分布于脑、心脏、睾丸、卵巢、唾液腺，也少量分布于肝和肾上腺［１…。将ＴＰＲｃｌ表达于Ｃ０ｓ和ｃＨ０细胞，发现ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ可以激活该通道［１２’３“。相类似的，将其表达于人ＨＳＧ（下颌下腺细胞），可以呈数倍地增强该细胞的钙库依赖性钙流入（ｓｔｏｒｅ―
ｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍ
ｅｎｔｒｙ，ｓＯＣＥ），并且细胞内源性ｓｏｃＥ可
以因ＴＲＰＣＩ的反义ｃＤＮＡ表达而大大削弱［３…。这说明ＴＲ―ＰＣＩ是ＨｓＧ细胞内源性ｓｏｃＥ的有效组分。最近，Ｖａｃａ等［３３３证明了ＴＲＰｃｌ还参与构成ｃＨｏ细胞的ＳｏｃＥ，并且发现ＩＰ。／ＩＰ。Ｒ和Ｃａ２＋／ｃａＭ的竞争作用是其激活调节机制。以上的结果表明ＴＲＰＣＩ在许多细胞中参与构成ｓＯＣＥ。但相反的实验结果也同时显示，当将ＴＲＰＣＩ表达于人胚肾细胞时，其激活并不依靠钙库的清空，相反地，却可以被ＤＡＧ的类似物０ＡＧ以不依靠ＰＫｃ的方式激活［３“。有趣的是，在相同的实验条件下，Ｈｏｆｆｍａｎｎ等［３５３却得出完全相反的结论，即ＤＡＧ类物质并不能激活ＴＲＰＣＩ。
４．２．２
ＴＲＰｃ２
ＴＲＰＣ２基因是七个ＴＲＰＣ家族成员中
最长的基因，在小鼠中编码１１７２个氨基酸，具有特殊的序列，与其它的哺乳类ＴＲＰ同源性较低［１“。其Ｎ端含有功能不详的ＩＩ型多囊。肾病基因（ｔｙｐｅＩＩｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅ）编码片段。并且在跨膜区只含有一个糖基化位点，其他的位点位于细胞内的Ｎ末端。ＴＲＰＣ２的分布也很有特点：在大鼠只特异性地分布于鼻犁骨器，在小鼠中分布于该区和睾丸［１“３６］。因为鼻犁骨区的细胞不含有内质网钙库，所以最初人们推测该通道的激活可能不依靠钙库活动。然而，将ＴＲ―Ｐｃ２表达于ｃｏｓ细胞却可以观察到典型的ｓｏＣＥ［“］。总之，关于ＴＲＰＣ２的功能性研究很少，这可能和该基因在人类被证明是一个假基因有关【１“。
４．２．３
ＴＲＰｃ４／５
这两个蛋白结构上和ＴＲＰＣＩ较为相
似，而且具有相似的生物物理和调节特性，因此有些作者也趋于将这三者归为一类。ＴＲＰＣ５的ｍＲＮＡ主要分布于
脑［１“，ＴＲＰＣ４却分布广泛，大量分布于脑和肾上腺，也少量
分布于心、肝、肺、脾、。肾、睾丸和卵巢［１“。与其它亚群相比，ＴＲＰＣ４／５有非常独特的离子调节特性，表现为镧离子（被公
认的非选择阳离子通道阻断剂）非但不能阻断反而大大增强其通道电流‘３…，并且ＴＲＰＣ５的激活在很大程度上依赖细胞外的钙流入［１“。将牛的ＴＲＰＣ４和ＴＲＰＣ５表达于ＨＥＫ细胞，用ＧＴＰ，ｓ、ＩＰ。或ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ可以诱导出一个极大的内向整流电流，显示这两个通道参与构成了ＳＯＣＣ［１“。然而，将小鼠的ＴＲＰＣ４和ＴＲＰＣ５表达于ＨＥＫ细胞，却发现其激活依靠Ｇ蛋白偶联受体或受体酪氨酸激酶信号转导，而与钙库
活动无关ｍ］。这说明这两个通道的激活机制存在较大的种属
４．２．４
ＴＲＰＣ３／６／７这一亚群有着显著的生物物理特
性，如短暂的（＜１ｍｓ）单通道开放，双向整流等［３…，但其组织分布却差异较大。ＴＲＰｃ３和ＴＲＰＣ６都在脑中大量分布。除此而外，ＴＲＰＣ３还在卵巢、结肠、小肠、肺、前列腺、胎盘和睾丸中广泛分布，ＴＲＰＣ６却只在肺和卵巢有分布［１２““。另外，ＴＲＰＣ６还大量而特异性地表达于不同的血管平滑肌细胞［３…。ＴＲＰＣ７主要分布于心、肺、眼等外周器官，在脑、脾和睾丸中只有少量表达［１“。这一亚群区别于其他ＴＲＰＣ成员的另一个显著的特征是，这三者都可以被ＤＡＧ或其类似物以不依赖钙库活动的方式激活［１“３５］。ＤＡＧ的作用靶区可能位于Ｎ末端，因为ＴＲＰＣ６蛋白Ｎ末端５４个氨基酸序列缺失导致ＤＡＧ对通道的激活作用消失［３…。虽然目前人们已广泛接受ＤＡＧ能够直接激活ＴＲＰＣ３／６／７家族，但在一些表达系统中，这三个通道也可以表现出ｓｏｃｃ的激活方式。对此，Ｋｉｓｅｌｙｏｖ等Ｈｏ］通过大量的研究，首次阐述了ＴＲＰｃ３钙库依赖性的激活机制。将人的ＴＲＰＣ３基因稳定表达于ＨＥＫ细胞，在细胞贴附式的记录条件下，不单ｃａｒｂａｃｈｏｌ（作用于Ｍ型乙酰胆碱受体），ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ也可以诱发单通道电流；在细胞内朝外记录中，ＴＲＰＣ３电流被ＩＰ。显著增强而被ｈｅｐ―ａｒｉｎ等ＩＰｓ受体拮抗剂几乎完全抑制。这提示受体激活的ＩＰ。支路参与了该通道的激活。继之，作者组建了含有ＩＰ。Ｒ且表达ＴＲＰＣ３的微粒体专门探讨ＩＰ。的生理功能，发现ＩＰ。可以帮助恢复已经“ｒｕｎ―ｄｏｗｎ”的ＴＲＰｃ３电流从而证实了以上结论。ＩＰｓＲ与ＴＲＰＣ３的物理连接也在免疫共沉淀实验中得到证明，其作用部位位于Ｎ末端［４“。以上结果表明激活ＰＬＣ信号通路产生的ＩＰ。作用于钙库上的ＩＰ。Ｒ引发后者产生构象变化，可能通过构象一偶联的方式激活位于胞膜上的离子通道。其实，ＩＰ。Ｒ与ＴＲＰ的物理连接可能具有普遍性，因为所有的ＴＲＰＣ成员的Ｃ末端都具有潜在的ＩＰ。Ｒ结合域，提示这两个生物大分子之间的物理连接可能是ＴＲＰＣ家族普遍的激活机制。既然ＰＬＣ通路的两个第二信使分子（ＩＰ。和ＤＡＧ）都可以参与激活ＴＲＰＣ３／６／７通道，这两者之间有什么内在联系，细胞本身又如何对这两种激活机制加以识别？对此，Ｖａｚｑｕｅｚ等［４纠对ＴＲＰＣ３进行了进一步的研究，在一定程度上回答了这一问题。他们指出ＴＲＰＣ３的门控方式和表达水平有很大关系：在低水平表达时，足够的内源性ＩＰ。Ｒ能和通道蛋白形成匹配联结，从而使通道表现钙库依赖性激活
模式；而当ＴＲＰＣ３高水平表达时，内源性ＩＰ。Ｒ在数量上短
缺而使大量的外源表达的通道蛋白处于“挂空”状态，因而总
包含总结汇报、IT计算机、计划方案、办公文档、党团工作、人文社科、资格考试、word文档以及TRP离子通道_图文等内容。本文共3页
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