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斑马鱼免疫相关基因及研究.pdf156页
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巾山大学博士学位论文 摘要 作为一种模式生物，斑马鱼被广泛应用于发育生物学、分子生物学、遗传学、
毒理学、病理学及免疫学等领域的研究。本文通过建立金黄色葡萄球菌感染前后
的斑马鱼淋巴绌胞cDNA文库和探索斑马鱼基因打靶技术来研究斑马值的免疫。 oblreas 是临床上一种常见的引起炎症反应 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus
的病原微生物，我们通过两次腹腔注射感染斑马鱼，建立了saUFeUS．斑马鱼感
染模型，从而为研究置aureus的致病机理和探索斑马鱼免疫防御机制打下了基 Plus试剂，从斑马鱼全血中分离出高纯度的淋巴细胞，
础。用传统的Ficoll―Paque
应用SMARTT”cDNA Library
测得4261 ESTs序列并拼接成5334clusters。通过对
胞eDNA文库 Driflym 已测得6988
感染前后文库中与免疫应答或抗感染信号途径有关的序列及与其它高等脊椎动
物 小鼠和人 比较表明，斑马鱼的免疫应答和抗感染机制与小鼠及人有较高的
等分子相应高表达，显示了在斑马鱼中也可能同样存在完整的IL-IO抗感染信号
通路。另外，在Driflym中还发现了一系列CD分予的高表达，其rr『的一些还是
对感染前后两个文库的比较表明，saureus有能力激活斑马鱼淋巴细胞的增殖、
分化和启动‘些相关基因的表达。 在对两个cDNA文库的ESTs序列分析中，分别发现了两个新的免疫型受体
基因 Novel immune．type
突变捉|jif终I
把这7个IGv序列建立系统发生树，分析结果表明，它们来自同一个祖基因的两 张广献
I卜山犬学博I学位论文
有差异，在鳃里有较高表达。|一J样，nitrl4通过与斑马鱼基蹦组的比埘，被定位
也有较高表达，在精巢和心脏中表达水平较低，而在其他样品组织中没能检测到
表达，表明NITRl3和
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斑马鱼基因敲除--CRISPR-Cas9技术流程
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斑马鱼基因敲除--CRISPR-Cas9技术流程
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3秒自动关闭窗口　　ALEXANDER F. SCHIER/编译：国家斑马鱼资源中心谢训卫
人类发育，生理功能及疾病发生的过程涉及到成千上万的基因和其变异体，但是大部分的基因和其变异体的功能依然是未知的。过去的20年里，斑马鱼逐渐成为研究人类基因功能的重要模式动物。在《自然》杂志网站发表的两篇文章里,，报道了斑马鱼参考基因组序列和完成超过10,000个蛋白编码基因的断裂性突变体的鉴定，与最近的研究报道一起将有力地促进人类疾病研究。
常见的研究基因功能的手段是确定某个特定的突变对机体表型的影响，如骨骼，生理机能和行为模式等。斑马鱼胚胎和幼鱼具有个体小，易于获取，胚体透明等特点，可以在单细胞水平上进行大量活体检测分析，十分适于此种研究。斑马鱼基因功能大部分是通过“正向遗传学”手段揭示的，首先在斑马鱼基因组中引入随机突变，在子代中鉴定表型的改变,（图1a）。使用这种方法鉴定致畸突变工作量很大，但在很大程度上帮助人们揭示了从胚胎发育到心脏生理机能调控等众多遗传途径。
由Howe et al研究人员报道的高质量的斑马鱼基因组序列，使得将突变序列和野生序列直接进行比对变为可行，将极大地促进突变的鉴定。斑马鱼基因组序列显示75%的人类疾病相关基因都可以在斑马鱼中找到同源基因，从而我们可以利用斑马鱼进行疾病相关基因的功能研究。
Figure 1 表型与基因的联系。斑马鱼中常见的三种研究特定基因在机体表型中功能的方法。a, 正向遗传学，向成年鱼中引入随机突变，在子代中鉴定表型变异，分析基因组以寻找突变基因。b, 另一种方法是先进行随机突变，但接下来对子代全基因组序列比对以寻找突变，进而确定表型的改变。c, 针对特定靶基因的突变技术，向某个特定的基因引入突变再分析子代的表型。
但是如何在斑马鱼中研究一个特定的人类基因的功能呢？首先需要向斑马鱼同源基因引入突变，接下来进行表型分析（图1b）。 Kettleborough等证实了可以大规模地进行类似的实验。该作者将雄性斑马鱼进行随机突变，随后对子代基因组DNA的蛋白质编码区域进行测序。在1,673尾鱼中，研究人员鉴定出10,043个基因（超过1/3的所有斑马鱼蛋白编码基因）存在着破坏。这些突变品系将成为系统研究这些基因功能的宝贵资源。
另一种研究基因功能的方法是针对特定基因引入突变，而不是向整个基因组引入随机突变（图1c）。随着在特定位点剪切DNA的技术的出现和完善，基因突变技术发生了根本性的变化。最新报道的技术是CRISPR-Cas9系统，已成功应用于斑马鱼,。该技术的核心是一个与靶基因的部分序列互补的RNA分子，引导核酸内切酶到靶基因的特定DNA位点，进行剪切，进而通过易错修复机制引入突变。CRISPR-Cas9系统相对大规模的突变筛选要便宜，快速些，可以被较小的实验室采用。因此大部分的斑马鱼基因相应突变体的产生只是一个时间的问题。
虽然有这些突破性的发现，但我们对于有多少基因在发生破坏时会产生相应的表型还不太清楚。根据之前的正向遗传学筛选结果，推测有大约有不到10%斑马鱼基因的破坏会在胚胎和幼鱼期的前5天产生异常表型,。与之一致的是，Kettleborough等发现在超过800个基因中，仅有大约5%的基因是这个时期正常发育所必需的。
是否这意味着超过90%的斑马鱼基因是功能无关的？以下有几点考虑使得这个说法完全站不住脚。首先，Kettleborough和同事们在进行表型分析时仅包括了十分明显的结构上的特征，相对细微的表型经常被忽略掉。其次，许多基因仅在晚期发育或成年期中发挥功能。第三，在早期发育时期，基因功能的破坏常被存在于卵黄或胚体中的母源因子所补偿。最后一点，具有相似序列的基因通常拥有重叠或部分冗余的功能，导致单个基因的破坏没有表型或是只有轻微的表型。
Howe等发现1/4的斑马鱼基因拥有高序列相似性的同源基因，说明上述最后一点在斑马鱼中尤其适用。然而，所有这些可能性都可以通过可应用于斑马鱼的精细技术来解决：表型的分析可使用高分辨率的拍摄技术和基因表达谱；突变鱼可用于发育晚期的研究；产生无母源和合子期基因表达的突变鱼，或在同一机体中同时敲除2-3个相关基因相对变得容易。
这些工具和资源将如何加速人类疾病相关基因的研究？方法很明了，寻找人类疾病相关基因在斑马鱼中的同源基因并进行编辑，分析异常表型，使用高通量的药物筛选平台寻找或鉴定可以调节该表型改变的小分子化合物。另外，斑马鱼基因组序列的完成，使得我们可以使用新的研究手段去解决长期以来困扰人类的问题。比如，斑马鱼具有很高比例的遗传变异――Howe等发现在不同的品系甚至于在不同的个体中，每隔200bp就有一个变异。在其他生物体中的研究显示这样的差异会导致表型效应。可以想象斑马鱼将成为研究轻微基因型变异在表型差异中的作用的一个有用的脊椎模式动物。
斑马鱼基因组序列的完成是否会在生物学中引入新观念？非常有可能。很明显人类基因组序列的公布并没有带来很大的改变。比如，没有人预测大量的非编码蛋白的RNA分子在功能调控中的重要作用，或是预见使用基因组序列去重建人类进化史？斑马鱼基因组序列和突变体的收集也许是下一个重大发现的前兆。
该文的原作者Alexander F. Schier 是哈佛大学分子与细胞生物学系教授
本文承蒙国家斑马鱼资源中心谢训卫编译供稿，特此鸣谢！
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&&& &斑马鱼（Danio rerio,俗称zebrafish）具有繁殖能力强、体外受精和发育、透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，特别是各种成熟的基因组修饰技术方便快捷，可进行大规模突变与筛选。这些特点使其成为后基因组时代生命科学研究中重要的模式动物之一。作为遗传工程小鼠模型研发技术平台的重要补充，中心建立了国际水准的斑马鱼转基因技术平台，拥有斑马鱼密集饲养系统、纯水净化系统、养殖水体循环系统、胚胎显微注射系统、胚胎操作系统，以及胚胎显微成像系统等仪器设备，为研究人员提供以斑马鱼为模式生物的基础生物学研究以及药物研发的技术支持。利用该技术平台可开展胚胎的显微注射、转基因斑马鱼构建、抗血管药物的筛选和研究、斑马鱼肿瘤移植模型的建立、抗肿瘤药物的筛选、胚胎显微成像等相关实验。&&
&斑马鱼密集饲养系统
&&& 由6个相互连通的养殖单元构成。每个养殖单元包括5层双排不锈钢机架，安装有40个1升养殖缸，48个3升养殖缸和24个10升养殖缸。系统可供约1万条斑马鱼的养殖。
纯水净化系统
&&& 由不锈钢机架，砂滤器，反渗透滤膜，压力泵，储水罐，及控制单元等组成。系统可生产250升/小时纯净水，纯水电导小于40&s/cm。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&养殖水体循环系统
&&& 由不锈钢机架，循环水泵，紫外线消毒器，电导率自动监控，酸碱度自动监控，及控制单元等组成。系统控制养殖缸内水的循环量大于4次/小时，自动调整酸碱度为pH7-8，电导率为450-550&s/cm。
胚胎显微注射系统
&&& 包括2组显微注射单元及1组高纯氮气供气单元。每个显微注射单元单元由1台体视显微镜，1台微操仪，以及1台精密气压注射泵组成。
&胚胎显微成像系统
&&& 由1台体视荧光显微镜，1台正置荧光显微镜，及2部CCD数码相机组成。
服务内容：
技术服务：药物对斑马鱼胚胎发育的毒性分析；药物的抗血管生成效果分析；斑马鱼胚胎显微注射；转基因斑马鱼；斑马鱼基因knockdown；斑马鱼移植肿瘤模型；斑马鱼品系的引种和繁殖等。
仪器服务：包括显微注射系统、体视显微荧光照相系统等。
管理服务：斑马鱼品系寄存、代管、繁殖等。
试剂耗材：小剂量分装鱼用麻醉剂tricaine（MS-222）。　　Wellcome Trust Sanger InstituteNature
Christiane Nüsslein-Volhard
Dr Derek Stemple
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