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7ud[农学]实验二
细菌及放线菌培养特征的观察
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细菌及放线菌培养特征的观察
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对氨基苯甲酸对粘性放线菌表面疏水性的影响
摘　要：目的研究血链球菌合成的生态调节因子--对氨基苯甲酸(PABA)对粘性放线菌细胞表面疏水性的影响,进一步了解PABA影响细菌粘附的机制.方法在含不同浓度PABA(10-9g/L、10-7g/L、10-4g/L)的改良Carlsson液体培养基中厌氧培养粘性放线菌,并采用微生物粘着碳氢化合物法(MATH)测试细胞表面疏水性.结果随着培养基中PABA浓度的增高,粘性放线菌细胞表面疏水性随之逐渐降低,其疏水率分别为0.326,0.268,0.126(P均<0.05).结论 PABA可能通过降低细菌非特异性疏水作用而抑制粘性放线菌的粘附.
优质期刊推荐探究不同土质、深度和培养基对放线菌长势的影响_走出来的教育见闻！_天涯博客
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摘要& . - 2 -
关键词& . - 2 -
1．引言... - 2 -
2．材料与方法... - 3 -
2.1材料... - 3 -
2.1.1供试土样... - 3 -
2.1.2培养基... - 3 -
2.1.3主要仪器和试剂... - 4 -
2.2方法... - 4 -
2.2.1土壤浸液配制方法... - 4 -
2.2.2稀释涂布平板法... - 4 -
2.2.3 放线菌菌落鉴定印片法... - 5 -
2.2.4 菌落计数方法... - 5 -
3．菌落计数与数据分析... - 5 -
3.1不同土质培养对放线菌的影响... - 5 -
3.2特殊培养方式对放线菌的影响... - 6 -
3.3同一土质不同深度培养对放线菌长势的影响... - 7 -
3.3.2林地土一般培养与特殊处理后得到的放线菌的数量... - 8 -
3.3.3菜园土一般培养与特殊处理后得到的放线菌的数量... - 9 -
4．小结... - 9 -
参考文献... - 11 -
附录... - 12 -
鸣谢... - 13 -
英文摘要... - 13 -
广西师范大学本科毕业论文(设计)学生诚信保证书... - 14 -
摘要& 由于放线菌的市场需求越来越大，了解放线菌的分布，对于进一步开发放线菌资源，发现和筛选新的放线菌品种，研究有益放线菌的数量及获得方式成为我们关注的热点。就这个问题，我采用稀释平板法分离研究菜园土、林地土、裸沙土三种典型代表的土样类型，借以寻找不同土质，不同深度，不同处理方式中，哪种条件有利于放线菌的生长。研究结果表明三种土质中，菜园土所含的放线菌种类最大，数量最多，其次为林地土和沙土；同种土质，深度在6-12cm的菜园土中所含放线菌数量较大，普通培养比特殊培养数量较为可观，深度为1-6cm的林地土中放线菌经过特殊培养含量较大，沙土中普通培养的放线菌几乎不长，特殊处理后每个深度层面都长，但数量较少。
关键词&不同土质；深度；培养基； 放线菌； 长势影响
放线菌为革兰氏阳性细菌，细胞核无核膜包被，细胞DNA的G
C mol %含量高 （>50 %）。多数菌生长较缓慢，产生可深入培养基内的营养菌丝和生长在表面的气生菌丝，并形成无性孢子。由于孢子、气生菌丝和营养菌丝颜色不同，常使菌落正反面呈不同颜色。放线菌的菌落形态多干燥致密，不易被跳起。
就目前研究得出放线菌实际上是细菌家族中的一员，是一类具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性细菌，因菌落呈放射状而得名。放线菌最喜欢生活在有机质丰富的微碱性土壤中，泥土所特有的"泥腥味"就是由放线菌产生的。用干燥、加热和药剂处理等选择性分离方法，可以从土壤中挑选出我们所需要的有益放线菌菌种。
放线菌与人类的关系极为密切。一是它分枝状的菌丝体能够产生各种胞外水解酶，降解土壤中的各种不溶性有机物质以获得细胞代谢所需的各种营养，对有机物的矿化有着重要作用，从而参与自然界物质循环，净化环境、改良土壤。二是放线菌代谢功能各异，大多数放线菌能产生生物活性物质，是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。药理学研究发现，放线菌产生的许多结构复杂的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途，已广泛应用作为抗细菌，抗真菌和抗肿瘤药物。在目前已经发现的数万种微生物来源的生物活性物质中，约有70％是由放线菌所合成的各种次生代谢产物，如抗生素，有机酸、氨基酸、维生素、甾体、酶及酶抑制剂、免疫调节剂等。三是弗兰克氏根瘤放线菌能够诱导大范围的放线菌根植物产生根瘤、结瘤固氮，促进植物自身的生长，并增强土壤肥力。这类放线菌与200多个树种具有共生结瘤固氮的能力，是陆地生态系统中有机氮输入的主要贡献者之一，在自然界氮素循环和生态平衡中起着重要作用。有些共生固氮树种被作为贫瘠土壤上的先锋树种，用于防风和治沙。　此外，放线菌特有的形态和生物学特性也是研究生物形态发育和分化的良好材料。
随着科学研究和市场生产的需要，放线菌的需求越来越大，了解放线菌的分布，对于进一步开发放线菌资源，发现和筛选新的放线菌品种，研究有益放线菌的数量及获得方式成为我们关注的热点。因此，就这个问题，我们选取菜园土、林地土、裸沙土这三种典型代表的土样类型，借以分析哪种土质中所含放线菌的种类大，数量多，此外通过普通和特殊培养，两种方式，进一步找出最适于放线菌大量繁殖的土质和生产培养的方法，旨在对研究者和生产者采集放线菌时有一定的指导意义。
2．材料与方法
2.1.1供试土样
菜园土、林地土、裸沙土三种典型代表的土样类型，同一天分别在广西省桂林市七星区附近采好点后，量取长：50cm，宽30cm的样地，取表层2cm厚的土作为第一层土样，往下挖掉5cm深的土刨开后，取第二份土样，再挖掉5cm深的土，取第三份土样，最后挖掉5cm深的土取最后一层土样。包扎好标上采集时间、地点、采样深度等记号。带回实验室将其均匀弄散，平均分成两份，一份直接在自然状态下晾晒一星期；另一份以1：10的比例与CaCO3混合后干热处理一小时，在室温下晾晒（此举用以减少各种土质中的杂菌含量。用来进行特殊培养）。
第一层土样：表层
第二层土样：6cm
第三层土样：12cm
第四层土样：18cm
图2-1表示：取样剖面图(菜园土、林地土、裸沙土每一种土样各取四层)
2.1.2培养基（普通培养基）
第一种是：高氏一号培养基：&& 可溶性淀粉20g，& NaCl ：0.5g， &&&K2HPO4&3H2O：0.5g, &&KNO3：1.0g& &&&&&PH：7.4-7.6&&& &&&&&MgSO4&7H2O：0.5g&&&&& &FeSO4&7H2O：0.01g, &&&琼脂：15-25g,& &水：1000ml,&
另一种是：改良的高氏一号培养基（特殊培养基）：&&& 可溶性淀粉（先加少量冷水调成糊状加入）20.0g&&&& &&&KNO3：1.0g& &&FeSO4&7H2O：0.01g,&&& KH2PO4：0.5g&&&&& MgSO4&7H2O：0.5g& &&&&&NaCl ：0.5g&& &&&&&PH：7.2-7.4& &&&&&&&&&&琼脂18～20g
临用时在已融化的高氏一号培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌和霉菌生长。每300mL培养基中加3％重铬酸钾1mL(100mg/kg)。
注：以上培养基成分除已说明之外均为定容至1000ml的量，实际配制时根据需要换算成需要的量，称完药品后用蒸馏水定容，摇匀，115&C高压灭菌20分钟。
2.1.3主要仪器和试剂
HP250G-C型智能光照培养箱&&& &&&&&&&&&&&&&武汉瑞华仪器设备有限责任公司
CSW-CT微波炉&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&苏州安泰空气技术有限公司
手提式压力蒸汽灭菌锅&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&上海医用核子仪器厂
水浴恒温振荡器&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&江苏省金坛市医疗器械厂&&
VS-840-1型洁净工作台&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&上海博讯实业有限公司医疗设备厂&
玻璃仪器气流烘干器&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&郑州长城科工贸有限公司
101&3&B5Ⅱ电灯恒温鼓风干燥箱&&&&&&&&&& 上海跃进医疗器械厂&&&
立式压力蒸汽灭菌器&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 上海博讯实业有限公司医疗设备厂&
其他仪器：电磁炉&& 干热消毒器&&& 光学显微镜&&& 电子天平，& 量筒，&& 三角瓶， 镊子，培养皿和容量瓶
2.2.1土壤浸液配制方法：分别取已磨成粉末的12种土样每份20g，放入12个事先已灭好菌的三角瓶中，内装无菌水100Ml,混匀后在摇床上振荡（100r&min-1）60min。过滤后密封待用。
2.2.2稀释涂布平板法：先将高氏一号琼脂培养基加热溶化，冷却至55-60&C时，混匀后分别倒平板，每种土层深度倒三个平皿。将配置好的土壤浸液充分混合，使细胞分散后，用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入盛有9cm无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6几种稀释度的土壤溶液。然后在上述每种培养基的平板底部用记号笔分别写上10-4、10-5和10-6 这三种稀释度字样，每种培养基每稀释度标记3皿，后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6 这三管土壤稀释液中吸取0.2ml的样液对号放入已写好稀释度数的平板中央位置，毎皿放入0.2ml，用无菌涂布棒在培养皿表面轻轻地涂布均匀后，室温下静置10-20分钟，将其倒置于28&C温室中培养5-7天，观察并检验菌落生长情况，统计菌落数目。
2.2.3放线菌菌落鉴定印片法
（1）用解剖针在高氏一号培养基上划一小块菌苔至于载玻片上，菌面朝上，用另一载玻片轻轻在菌苔表面按压，，使孢子丝及气生菌丝附着在载玻片上。
（2）固定：将印迹一面朝上，通过火焰2&3次固定。
（3）染色：用石炭酸复红染色1min，水洗，晾干。
（4）镜检：用油镜观察孢子丝形态特征。
图注：光学显微镜下的螺旋形放线菌（10&100）
图注：光学显微镜下的线形放线菌（10&100）
光学显微镜下的螺旋形放线菌（10&100）
2.2.4菌落计数方法
培养48小时后取出培养平板，根据统计的菌落数，计算出同一稀释度3个平板上的菌落平均数，按下列公式进行计算：
每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）=同一稀释度3次重复的平均菌落数&稀释倍数&5
3．菌落计数与数据分析
3.1不同土质培养对放线菌的影响
经过4天后统一取稀释浓度为10-5培养得到的放线菌，观察实验结果统计如下，
表3-1不同土质培养及不同深度中放线菌的含菌数。单位（&10-5cfu/ml）
由表3-1显示：土壤质地制约着土壤中放线菌的数量。不同土质放线菌数量存在很大的差距，统计结果中各种土质放线菌的平均数量（&10-5cfu/ml）为菜园土（2.90&107）＞林地土（2.83&107）＞裸地土（6.66&105），这可能是由于菜园土中经常依据不同的季节种植不同蔬菜，其生产周期短，收成快，土壤经常得到翻新，透气性好，因此含氧量较大，再说土壤中的有机物质比较丰富，保水保湿能力强，适于多种多样的昆虫在里面生长，其新陈代谢产生的废物种类丰富，构成一个小的生态系统，这些条件利于放线菌的繁殖。因此菜园土中放线菌的数量是最大的，相对于林地土，虽然林中长有种类繁多的高大乔木、灌木、还有各种杂草，多种多样的动物构成一个相对较大的稳定的生态系统，但是由于枯枝落叶的新陈代谢相对较慢，土壤中有机物的含量相对较少，土壤没有得到及时翻新，板结，透气性不好，因此其放线菌数量相对次之，而裸沙土中，由于没有植被覆盖，土质过于细腻，保水保湿能力最差，不适于各种动植物生活，因此构不成一个小型生态系统，不能形成放线菌生长的条件，因此几乎没有放线菌生长。
总的来说，菜园土中采取的放线菌数量最多，种类丰富。在表层到18cm的深度挖掘中，均可以采集到大量的放线菌。
3.2特殊培养方式对放线菌的影响
表3-2特殊培养统计稀释浓度为10-5得到的放线菌数量。单位（&10-5cfu/ml）
12cm含菌数
18cm含菌数
由表3-2显示：抑菌剂抑制杂菌的生长，一定程度上促进土壤中放线菌的生长。加入抑菌剂CaCO3处理三种土壤样品后，用改良的高氏一号培养基（加抑菌化合物重铬酸钾）得到的不同土质中放线菌数量虽存在很大的差距，但是放线菌的数量有一定的增加，且培养皿中杂菌数量相对较少，效果比较明显的是裸沙土中的放线菌数量有明显的增加。统计结果中各种土质放线菌的平均数量（&10-5cfu/ml）为菜园土（2.98&107）＞林地土（2.0&107）＞裸地土（0.25&107），CaCO3能作为抑菌剂，其理论原理基础是干热处理可以降低开始时土壤细菌的数量，添加CaCO3后土壤的PH更适合放线菌的生长，不利于大部分真菌的生长。这也是充分利用真菌和放线菌不同性质来筛选富集培养。
在加抑菌剂CaCO3处理三种土壤样品后，用改良的高氏一号培养基（加抑菌化合物重铬酸钾）培养，重铬酸钾作为抑菌剂的理论依据是因为重铬酸钾具有非常强的氧化性，细菌表面有很多的接触酶等一系列的酶。受到强氧化性的作用几乎失去活性，代谢受阻，从而抑制细菌的生长。
在特殊培养下，抑菌剂CaCO3能抑制真菌的生长，而重铬酸钾能抑制细菌的生长，由此大大减少了抑制放线菌生长的因素。表现较为显著的是裸沙土中生长的放线菌在普通培养基中几乎不长，而在特殊培养中，稀释的各个平板中几乎全部生长。
3.3同一土质不同深度培养对放线菌长势的影响
针对不同土质探索出最适放线菌的生长环境和最佳培养条件外，由于不同放线菌在不同深度的土质类型中，其数量存在很大的差异，就这个问题，我们还得出以下结论。通过分析同一种土质，我们还发现一些结果。数据显示如下
3.3.1裸沙土一般培养与特殊处理统计不同土层得到的放线菌的数量。
表3-3裸沙土一般培养统计不同土层得到的放线菌的数量。单位（cfu/ml）
常规培养浓度
表3-4裸沙土特殊培养统计不同土层得到的放线菌的数量。单位（cfu/ml）
特殊培养浓度
裸沙土[sandy soil] 是由大量的沙（80%以上）和少量的黏土（20%以下）混合而成的土壤。泛指含沙很多的土。这种土壤土质疏松，透水透气性好，但保水保肥能力很差，耕种时需要改良。不太适宜某些植物生长。因此得不到人类的充分开发和利用，土质相对贫瘠。由表3-3和3-4显示，就土质类型来说，裸沙土几乎不具备放线菌生长的条件。但经过加抑菌剂CaCO3处理三种土壤样品后，用改良的高氏一号培养基（加抑菌化合物重铬酸钾）进行特殊培养，裸沙土中的放线菌数量得到相对大幅度增长，这也进一步得出结论，特殊培养在一定程度上能够促进放线菌的生长。通过观察数据我们还发现，普通培养中，深度为6cm的土质中放线菌含量较多，为75&104cfu/ml，特殊培养后，表层生长的放线菌数量较多，为16.4&106cfu/ml，且表层至18cm的深度中均有放线菌增长，表层最多，18cm含量最少。这也是沙土本身的一个结构所致。
3.3.2林地土一般培养与特殊处理后得到的放线菌的数量。
表3-5林地土一般培养得到的放线菌的数量。单位（cfu/ml）
常规培养浓度
表3-6林地土特殊培养得到的放线菌的数量。单位（cfu/ml）
特殊培养浓度
林地土多属于黏土，含沙粒很少、有黏性的土壤，水分不容易从中通过，含颗粒非常小的（<2&m）硅酸铝盐。除了铝外黏土还包含少量镁、铁、钠、钾和钙。含有粘土的土壤非常容易结合水、矿物质和有机营养，原因在于颗粒非常小的粘土有较大的相对表面以及其表面的电极性。在生产上粘土具有保肥、保水的特性，有"湿时一团糟、干时一把刀"之称，耕性较差。从其土壤性质来看，相对于沙土，放线菌可以在这样的环境中生长，但相对于菜园土，它还不是最佳的生存环境。从表3-5和表3-6数据显示，我们发现，不同深度的林地土放线菌的含量存在很大的差异。普通培养中，统计结果不同深度中放线菌的平均数量（cfu/ml）得到1cm（4.01&107）＞ 6cm(3.17&107) ＞ 12cm（1.49&107）＞18cm（1.13&107），加入抑菌剂做特殊培养后，不同深度中放线菌的平均数量（cfu/ml）得到1cm（15.4&107）＞ 6cm(4.24&107) ＞ 12cm（4.18&107） ＞ 18cm（3.44&107），多数放线菌的增长，需要除掉各种杂菌的阻碍，没有了抑制物，菌落的成长更为可观，在有机物丰富的土层表面至6cm深度中，放线菌的生长较为适宜。这是由于放线菌最喜欢生活在有机质丰富的微碱性土壤中，它们中绝大多数是腐生菌，能将动植物的尸体腐烂、&吃&光，然后转化成有利于植物生长的营养物质，在这个深度中，动物种类较为丰富。为放线菌带来更多的食源。
3.3.3菜园土一般培养与特殊处理后得到的放线菌的数量。单位（cfu/ml）
表3-7菜园土一般培养得到的放线菌的数量。单位（&10-5cfu/ml）
常规培养浓度
表3-8菜园土特殊培养得到的放线菌的数量。单位（&10-5cfu/ml）
特殊培养浓度
菜园土又称园土，这是普通的栽培土，因经常施肥耕作，肥力较高，团粒结构好，缺点是干时表层易板结，湿时通气透水性差，不能单独使用。种过蔬菜或豆类作物的表层沙壤土，其土壤环境因子如有机质、水分、温度、通气状况等最好。因此最适于放线菌的生长。通过统计表3-7发现普通培养中，不同深度中放线菌的平均数量（cfu/ml）得到6cm（17.03&107）＞ 12cm(8.92&107) ＞ 1cm（6.30&107）＞ 18cm（6.12&107），加入抑菌剂做特殊培养后，不同深度中放线菌的平均数量（cfu/g）由表3&8得到12cm（9．83&107）＞6cm(8.18&107) ＞ 1cm（8.05&107） ＞ 18cm（2.25&107），由此我们可以得出菜园土最适于放线菌的生长深度在6cm&&12cm之间，这是由于人为因素的耕作，翻新，在这个区域中有机质的含量丰富，较为均匀分布，且不易受外界因素的影响而丧失（如雨水冲刷、小性质破坏、阳光暴晒、水分缺失），放线菌所处的环境相对稳定，有机质丰富的微碱性土壤，土壤经常耕新，透气好，土中动植物腐尸多，食物来源广泛。菜园土中土壤环境因子如有机质、水分、温度、通气状况等都满足且最利于放线菌的繁殖。因此其数量最为可观。
4.1& 桂北地区土壤放线菌数量受采样土壤质地、土壤更新频率的综合影响。随植被层次结构的不同而发生很大的变化；在三种土质检测中发现，菜园土中放线菌数量最多。
4.2& 桂北地区土壤放线菌数量受培养条件不同在数量上会产生显著的影响。通过加入抑菌剂CaCO3处理三种土壤样品后，用改良的高氏一号培养基（加抑菌化合物重铬酸钾）培养，结果出现不同土质中放线菌数量存在一定程度的增加，其中较为显著的是裸沙土。
4.3& 桂北地区土壤放线菌数量除受土质和培养条件影响外，还跟土层深度有一定的关系。多数随土壤采样层次的加深而减少，这主要受土壤环境因子如有机质、水分、温度、通气状况等综合因素影响。
4.4除以上发现外，本实验还遗留一些问题尚待继续研究。
一是抑菌剂CaCO3处理土壤，具体是如何发挥抑菌作用，再其过程是否会对放线菌的种类筛选造成影响。
二是使用重铬酸钾抑制细菌生长，现研究发现，放线菌也属于细菌的一种，它会不会也会抑制部分放线菌的生长。这一部分放线菌有哪些？其抑菌作用是否可取。
三是研究不同深度中放线菌的数量时，其结果存在一定的交叉性，导致这种原因的多方面因素（有机质、水分、温度、通气状况）的影响，其最适深度挖掘，尚待进一步探究。
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3秒自动关闭窗口玻璃纸琼脂平板透析培养法观察放线菌形态[附插片培养法]
(玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜检可观察到自然生长的放线菌个体形态。 var. Yingchengensis (2)(3)、玻璃纸、(1)(2)(3)无菌培养皿内，每皿倒(4)均匀。(5)(6)。在无菌环境下。打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片置于载玻片上用显微镜观察。均匀，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培养基中，置