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一个生物化学题目
1mg纯酶的氨基酸分析给出58.1ug的亮氨酸（Mr131.1）和36.2ug的色氨酸（Mr204.2），试问此酶的最低相对分子质量为多少？
& &参考答案为：1128.2
但不知如何算来？
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13个考研和考博生物化学、分子生物学与微生物学问题和解答
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本帖最后由 asuka2013 于
19:32 编辑
“13个考研和考博生物化学、分子生物学与微生物学问题和解答”是以前我在网上回答的别人的此三门课程习题和试题的很一小部分（数量小于总数的5%）的汇编，答案均由我本人给出。本文不收入不可能出现在研究生或博士生入学考试中的设计实验设计与操作细节的实际上实验操作中的讨论题目，各位可以参考。
其他试题和习题讨论我就不贴出了，因为大家时间很紧，没有必要再上些压力；另外因为我个人的专业题库中很多是从看过的SCI论文中整理的设计、protocols、实验数据或Idea的讨论，不经过整理就贴出来，对于各位考研只会有干扰。
本文每道题都有一定的难度，说是13个，实际上大于此数量，各位如果复习累时想换一下思维（权当休息一会儿）。Good Luck!{:soso_e113:}
题1。紧急求助!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
1.哪些蛋白可称为G蛋白?
2.哪些细胞成分消耗ATP?
3.叶绿体.线粒体等细胞器标志性酶是什么?
4.顺式作用援建因子,反式作用援建因子是什么?
1.哪些蛋白可称为G蛋白?
They&&serve as second messengers or transducers of the receptor-initiated response to&&intracellular elements such as enzymes to initiate an effect. They are also&&mediators of activated cell-surface receptors and their enzymes or of ion&&channels.
They are responsible for activating a chain of events that&&alters the concentration of intracellular signaling molecules such as cyclic AMP&&and calcium. In turn, these intracellular messengers alter the behaviour of&&other target proteins within the cell.&&
These proteins have a high affinity&&for guanine nucleotides and hence are named &G& proteins.
2.哪些细胞成分消耗ATP?
核糖体、粗面内质网、细胞核、线粒体、叶绿体。
3.叶绿体.线粒体等细胞器标志性酶是什么?
自己看书！
4.顺式作用援建因子,反式作用援建因子是什么?
援建还是元件？请写出英文。
题2。一个微生物问题
从一种位置革兰氏阳性菌中分离到一种聚酮类物质，具有很强的杀伤多种革兰氏阳性菌的作用。试设计实验克隆与改物质生物合成相关的基因或基因簇。
聚酮类物质不是蛋白质，但是肯定是细菌中响应的酶合成的。而且聚酮类物质疏水的，应该能够透过细胞膜，分泌到细菌体外，除非聚酮类物质非游离而结合上生物大分子。
这题就是找到这些酶的基因。观察聚酮类物质产生旺时，细菌体内哪些酶的数量多或者活性高。
这不难。如果酮类物质能够透过细胞膜分泌到细菌体外，只要分出不同的条件，将分泌聚酮类物质革兰氏阳性菌与其敏感菌一起氧，何时敏感菌挂得多，那就是分泌聚酮类物质革兰氏阳性菌产生酮类物质的时候，这时破碎细胞，用此时的细胞的蛋白质组的二维电泳图象对比分泌聚酮类物质革兰氏阳性菌不或少产生酮类物质时的细胞的蛋白质组的二维电泳图象对比，总可以找出表达量不同的蛋白质或有些蛋白质没有表达。
这样可能与分泌聚酮类物质对应的蛋白质就调出来了，再用gene&&knock in 或gene knock&&out逐个敲就能确定与分泌聚酮类物质对应的蛋白质了，对相关蛋白质测序（可用质谱），然后通过蛋白质序列反推基因序列，再用基因序列到该细菌的基因组文库钓出基因位点，还有RACE，反向PCR等钓出基因的位置和完整序列。
如果多聚酮类物质不能够透过细胞膜分泌到细菌体外，那也没有关系，不同条件破碎细胞，检测细胞内的多聚酮类物质，找到多聚酮类物质最多时的培养条件，与最少时对比蛋白质组。其余相同。
1。蛋白质组学概念和二维电泳方法；
2。基因克隆方法。
3。蛋白质与其基因的序列关系和确定方法；
4。基因敲除和敲入。
题3。请高手指点一道酶活计算题！
请高手指点一道酶活计算题！
某酶制剂经测定含氮量为5%，今称取2克溶解成50ml酶液，取上述酶液0.5ml，在最适条件下与底物反应，10分钟后测得100微克产物，设该酶催化底物反应，每小时产生6微克产物为一个活力单位。请计算：1）1ml酶液所催化的反应速度及其酶活力；2）该酶制剂每毫克蛋白氮和每毫克蛋白质的比活力；3）每克酶制剂的总活力。
请指教，我自己做过了，但不确定是不是正确答案，请高手尽量写清楚计算步骤，谢谢！
一般测定蛋白质比较粗糙的方法是用6.25进行计算。计算公式如下：
蛋白质样品含N(g)×6.25
————————————×100&&= 蛋白质(%)
蛋白质样品重(g)
某酶制剂经测定含氮量为5%,即蛋白质样品含N(g)为5%,蛋白质样品重(g)为100%,代入上式算出蛋白质(%),这也就是酶的浓度。
1）1ml酶液所催化的反应速度及其酶活力；2）该酶制剂每毫克蛋白氮和每毫克蛋白质的比活力；3）每克酶制剂的总活力。&&只有第二问与酶的浓度有关，其余两问只要直接算出酶制剂的实际催化速度，然后折合成题目的酶活力单位即可。
酶液0.5ml，在最适条件下与底物反应，10分钟后测得100微克产物，那木速度是10微克产物/分，折合为“每小时产生6微克产物为一个活力单位”------------即每分钟产生0.1微克产物为一个活力单位，所以此时是100活力单位。
1）1ml酶液所催化的反应速度及其酶活力？
速度和活力单位各加一倍。
2）该酶制剂每毫克蛋白氮和每毫克蛋白质的比活力？
该酶制剂每毫克蛋白氮，自己算，很简单。
每毫克蛋白质的比活力=100活力单位/[(2克*(0.5ml/50ml)*1000)*蛋白质(%)]
3）每克酶制剂的总活力?
第二问的值乘以2000。
题4。请教一道某名校的考研生化实验设计题
泛素（Ub）降解蛋白质是通过三种酶E1,E2,E3实现的。（1）设计实验证明Ub通过共价键连接E1,E2和被降解的蛋白上，不通过共价键连接E3；（2）设计实验利用Ub纯化E1,E2,E3；（3）证明泛素降解蛋白质过程中ATP为必需
谢谢大家帮忙了!
（1）设计实验证明Ub通过共价键连接E1,E2和被降解的蛋白上，不通过共价键连接E3；
这就是考察分离共价结合与非共价结合而已，可以用细胞外体系（也可以用细胞内体系，而后破碎细胞），对于Ub与E1,E2和被降解的蛋白及E3的两两蛋白的共价或非共价体系，按分子量（事先算好）层析，收取蜂尖产物（对应好分子量，确定好具体对象），然后分别进行SDS电泳，一条带的就是两者共价结合，反之为非共价。
（2）设计实验利用Ub纯化E1,E2,E3
细胞内体系，破碎细胞按上步层析后，共价结合的用酶或化学试剂切开，共价结合的加高离子强度，而后在层析或电泳分离。也可亲和层析，Ub共价连在介质共价结合的用酶或化学试剂切开，非共价结合的加高离子强度洗脱。
（3）证明泛素降解蛋白质过程中ATP为必需
用细胞外体系，不供给ATP。或者用细胞内体系，阻断线粒体功能，等待足够长时间。
题5。请教一道生化考研试题
获得一新蛋白可能与DNA复制有关，1.证明其是否有关；2.证明是与起始有关还是与延伸有关
谢谢大家帮忙了！
1.证明其是否有关；
细胞内实验用Gene&&knock in or Gene knock&&out，看DNA复制是否仍然正常，受到影响，包括不能复制和能复制但是量上有变化，都可以认定新蛋白与DNA复制有关，要在不同条件下测定，比如较高的温度是否出现“热休克”等。
2.证明是与起始有关还是与延伸有关
如果第一步实验证明新蛋白与DNA复制有关。细胞外实验，取新蛋白与起始因子，和延伸因子都加入体系，看看DNA复制能否进行，反应启动后同时除去蛋白与起始因子，看DNA复制是否继续，若继续，新蛋白与DNA复制起始有关。
题6。一个微生物问题
从一种位置革兰氏阳性菌中分离到一种聚酮类物质，具有很强的杀伤多种革兰氏阳性菌的作用。试设计实验克隆与改物质生物合成相关的基因或基因簇。
聚酮类物质不是蛋白质，但是肯定是细菌中响应的酶合成的。而且聚酮类物质疏水的，应该能够透过细胞膜，分泌到细菌体外，除非聚酮类物质非游离而结合上生物大分子。
这题就是找到这些酶的基因。观察聚酮类物质产生旺时，细菌体内哪些酶的数量多或者活性高。
这不难。如果酮类物质能够透过细胞膜分泌到细菌体外，只要分出不同的条件，将分泌聚酮类物质革兰氏阳性菌与其敏感菌一起氧，何时敏感菌挂得多，那就是分泌聚酮类物质革兰氏阳性菌产生酮类物质的时候，这时破碎细胞，用此时的细胞的蛋白质组的二维电泳图象对比分泌聚酮类物质革兰氏阳性菌不或少产生酮类物质时的细胞的蛋白质组的二维电泳图象对比，总可以找出表达量不同的蛋白质或有些蛋白质没有表达。
这样可能与分泌聚酮类物质对应的蛋白质就调出来了，再用gene&&knock in 或gene knock&&out逐个敲就能确定与分泌聚酮类物质对应的蛋白质了，对相关蛋白质测序（可用质谱），然后通过蛋白质序列反推基因序列，再用基因序列到该细菌的基因组文库钓出基因位点，还有RACE，反向PCR等钓出基因的位置和完整序列。
如果多聚酮类物质不能够透过细胞膜分泌到细菌体外，那也没有关系，不同条件破碎细胞，检测细胞内的多聚酮类物质，找到多聚酮类物质最多时的培养条件，与最少时对比蛋白质组。其余相同。
1。蛋白质组学概念和二维电泳方法；
2。基因克隆方法。
3。蛋白质与其基因的序列关系和确定方法；
4。基因敲除和敲入。
题7。请教大家一个关于酶的问题！
如果问代谢过程中调节酶的四项措施，应该怎样答最全面？
酶的调节：
（1）&&别构调节：包括前馈/反馈和能量调节在内，还有别的别构调节；
（2） 共价调节：包括可逆与不可逆修饰，后者主要指酶原活化，前者有磷酸化&&腺苷酰化等。
（3）&&活化/抑制蛋白对于酶的调节和生物膜对于酶的调节。前者如钙调蛋白，后者如双关酶在结合上生物膜时其活性与未结合时有所不同，也包括了酶的空间定位对其活性的影响；
前三者都是酶的活性调节
（4）&&酶的数量调节：包括由于基因表达的调节而使酶的表达量有所不同，还包括酶的降解----------这往往与其他的生物大分子有关，比如蛋白酶体。
沈同&&王镜岩 主编 生物化学第二版和 王镜岩 主编 生物化学 第三版&&的酶那章给出的四个酶的调节都是酶的活性调节，我把其中的可逆与不可逆修饰合二为一了。书上没有此题完全的现成的解答。
题8。回答“元元2007”的&&四个微生物学问题
1 请描述一个噬菌体颗粒在长有细菌菌苔的琼脂平板上是如何形成噬菌斑的.（8分）
提示：这题实际上问以下几个问题：（1）噬菌体定义，（2）噬菌斑(phague)定义，（3）噬菌斑(phague)形成的不同的几个时期的特征，就是从噬菌体侵染细菌到裂解的全部的几个过程，即：噬菌体侵染细菌、在细菌体内复制、装配和裂解的各个时期的特征。这些书上都有。这题不是让你描述噬菌斑(phague)的具体形态，而是说明形成噬菌斑(phague)的机理。
这样该会回答了吧。
2 真核微生物和原核微生物的跨膜转运有何区别？？（8分）
答:真核微生物:翻译后转运;原核微生物:边翻译边转运。具体叙述信号肽和导肽的特征。
3..在用酪素培养基平板筛选产胞外蛋白酶细菌时，发现在几株菌的菌落周围有蛋白水解圈，是否能仅凭蛋白水解圈与菌落直径比大，就判定该菌株产胞外蛋白酶的能力就大，而选其为高产蛋白酶的菌种，为什么？？（10分）
答：酪素：&&微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。
酪蛋白水解后富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全。&&因此常用于制备培养基。
酪素培养基当然富含酪素。酪素&&实质就是蛋白质片段，蛋白酶有不同的底物对象，专一性各有不同，有很多蛋白酶不能水解酪素，所以不形成蛋白水解圈。
菌落直径大小表明细菌书目的多少。
蛋白水解圈与菌落直径比大只能说明该种细菌该菌株产胞外的能够水解酪素的蛋白酶的能力大小，而不能仅此就判定该菌株产胞外蛋白酶的能力就大或选其为高产蛋白酶的菌种。
4 请从微生物的分解代谢和产能代谢的角度谈谈微生物的多样性。（10分）
提示：分别叙述微生物的分解代谢和产能代谢的的具体类型，然后说明类型很多非其他生物所具备。
题9。急求“模体”概念
急求“模体”概念
膜体(motif)：一般是指超二级结构（supersecondary&&structure)，若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，组成有规则的、在空间上能够识别的二级结构组合体。
详细请看下一楼。
Protein&&motifs may be defined by their primary sequence or by the
arrangement of&&secondary structure elements
The term motif is used in two different ways in&&structural biology. The first refers
to a particular amino-acid sequence that&&is characteristic of a specific biochemical function.
An example is the&&so-called zinc finger motif, CXX(XX)CXXXXXXXXXXXXHXXXH, which
is found in a&&widely varying family of DNA-binding proteins (Figure 1-49). The&&conserved
cysteine and histidine residues in this sequence motif form ligands&&to a zinc ion whose
coordination is essential to stabilize the tertiary&&structure. Conservation is sometimes of a class
of residues rather than a&&specific residue: for example, in the 12-residue loop between the&&zinc
ligands, one position is preferentially hydrophobic, specifically&&leucine or phenylalanine.
Sequence motifs can often be recognized by simple&&inspection of the amino-acid sequence of
a protein, and when detected provide&&strong evidence for biochemical function. The protease
from the human&&immunodeficiency virus was first identified as an aspartyl protease because&&a
characteristic sequence motif for such proteases was recognized in its&&primary structure.
The second, equally common, use of the term motif refers&&to a set of contiguous secondary
structure elements that either have a&&particular functional significance or define a portion of
an independently&&folded domain. Along with the functional sequence motifs, the former&&are
known generally as functional motifs. An example is the helix-turn-helix&&motif found in many
DNA-binding proteins (Figure 1-50). This simple&&structural motif will not exist as a stably
folded domain if expressed&&separately from the rest of its protein context, but when it can be
detected&&in a protein that is already thought to bind nucleic acids, it is a likely&&candidate for
the recognition element. Examples of structural motifs that&&represent a large part of a stably
folded domain include the four-helix&&bundle (Figure 1-51), a set of four mutually antiparallel
alpha helices that&&is found in many hormones as well as oth the&&Rossmann
fold, an alpha/beta twist arrangement that usually binds NAD&& and the Greek-key
motif, an all-beta-sheet arrangement found in&&many different proteins and which topologically
resembles the design found on&&ancient vases. As these examples indicate, these structural motifs
sometimes&&are suggestive of function, but more often are not: the only case here with&&clear
functional implications is the Rossmann fold.
摘自：Gregory&&A&&Petsko, Dagmar Ringe, Protein structure and function,2004 New Science Press&&Ltd,34.
题10。中国科学院06生化与分子最后一题....求助
已知动物培养细胞中的某一基因的表达受紫外线诱导,试设计一些实验来寻找该基因受紫外线调控的顺式作用元件和转录因子.
我简单说一下思路
1。紫外线诱导：有和无的紫外线有关蛋白质和RNA的水平检测-------------对不同状态的细胞粉碎后提取相关的蛋白质和RNA，进行有无和数量的对比，由于不知道是相关的蛋白质和RNA，就做双向电泳，对比有和无的紫外线表达不同的蛋白质；
2。反式因子与顺式元件的相互作用的研究：就是蛋白质与DNA的相互做用，也可以是蛋白质与RNA的相互做用，方法很多---------凝胶阻滞电泳，红外傅立叶，紫外等。
3。确定直接与顺式元件的相互作用后的蛋白质因子（反式因子）后，再用酵母双杂交，噬菌体展示钓取与反式因子相互作用的蛋白质。
4。有关系统生物学的内容（略）。
方法很多，组合起来更多。回答这个问题头两步就够了，作为基因表达调控研究课题来讲要深入做可以到3。4
这样的问题怎没人讨论。。。？
紫外光诱导出的蛋白质很多不是转录因子，所以必须用多出的蛋白质与顺式元件相互作用才能确定。
1。真核细胞有核，所以只要用双向电泳分析对比有和无的紫外线的表达后进入细胞核的蛋白质即可，提取细胞核不难，离心即可，不必全细胞蛋白质组对比；
2。要确定该基因的在哪条染色体上；
3。蛋白质相互作用还可以用分子筛层析、共结晶、NMR等。
4。在找顺式元件时可以使用双向电泳分析对比出的蛋白质与酶切后的DNA片段结合筛选之，根本不结合的先去掉；结合了但是不在一条染色体上的也去掉。剩下的蛋白质不好筛了，再换到DNA上，逐个敲掉与“剩下的蛋白质”可以结合的DNA序列，看细胞对于紫外线的影响。
就这样吧。看来这里的人不感兴趣讨论具体问题。
上面说的是不知道具体基因的位点和产物的情况，也就是知道有紫外诱导这回事，其余一概不知的实验思路。可能题目（原题我没有见过）没有这么复杂。
如果题意是已知&这一基因&的具体位置，那么要简单得多，可以对其同一条的DNA上邻近序列中寻找顺式元件，不必再对基因本身定位了，阻滞电泳和敲除片段都会少多得多。这是还可将这个基因克隆出来，表达出产物，以产物作为指标。
最后提醒一句：有很少的转录因子是RNA，这就要用电泳方法分离比较核内的功能RNA。至于这种情况的顺式元件就可以用功能RNA的互补序列去钓取了。如果出现特异电泳带，但是比较弥散，可以用PCR。不过作为试题这种情况不必考虑了。
题11。生物高手帮我看看这几题~谢谢大家！
1、生物膜中的类脂属于双亲性分子，根据类脂分子头部截面积的大小，类脂分子可以分为单体、微团、脂双分子层3种形态存在于水中，这句话对吗？
2、植物的细胞膜中含有钠钾泵吗？
帮我看下哈~谢谢大家！
1、生物膜中的类脂属于双亲性分子，根据类脂分子头部截面积的大小，类脂分子可以分为单体、微团、脂双分子层3种形态存在于水中，这句话对吗？
这句话不正确，因为前半句不对！
生物膜中的类脂取决于分子的固有特征，这即包括分子间的相互作用，也包括分子立体几何因素，同时与溶液的性质有关。由于人们对于溶液中的大分子相互作用的理解还不完善，比较实用的是类脂分子的立体几何因素来确定脂质趋向于哪种聚集形态。
后半段：“类脂分子可以分为单体、微团、脂双分子层3种形态存在于水中”，这半句大致正确。
隋森芳&&膜分子生物学 高教出版社 5。
2、植物的细胞膜中含有钠钾泵吗？
没有。目前的细胞生物学教材是这样说的，至于SCI文献有没有例外，我没有查过。
小分子RNA一般都是抑制或降低基因表达水平的，今年的PNAS就发现有促进基因表达水平的小分子RNA。
题12。为什么细胞利用Ca2+进行细胞内信号传递，而不是其他离子，如Na+呢？
很感谢上次你对我的那两个的解答！我这还有一个问题，你若有时间就帮我看下吧，谢谢！
问题是：为什么细胞利用Ca2+进行细胞内信号传递，而不是其他离子，如Na+呢？
请学姐做点简要回答吧，再次谢谢你！
回答（我打字慢，所以只是提示，全面回答请看书）：
在&&沈 同、王镜岩 主编 生物化学（上 ）高教出版社&&，1990，第450页。
1。细胞内Ca2+的浓度可以大幅度变化。
2。带负电的氧Glu和Asp侧链）和不带电的氧（主链羰&&基上）都能很好地结合与Ca2+。Ca2+具有和多个配体结合的能力，能和一个蛋白质的不同的片段结合使他结合的片段发生铰链，并诱导蛋白质发生巨大的构象改变。Ca2+具有有高度的选择性。
同时我回复了短信，因为我暂时把下载的英文电子书都关了。。。
题13。热稳定的酶
想请教一下&&如果纯化一个热稳定的酶是不是就不需要低温条件了？
纯化一个热稳定的酶可以使用高温使其他蛋白质变性后沉淀后收取上清夜,但是有些酶在低温下会解离而失活.还可能在低温下断开二硫键.
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发帖还要审核，这个网站也很奇怪！！
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就这样一个生物学专业问题讨论的贴还要审查两次！！？？今天下午才重新开发！！再往开放就改到2013年考研的时间了！！！
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看来也没有人在提问了，那么就再见吧。祝各位好运！Good Luck!
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本帖最后由 asuka2013 于
10:57 编辑
题7的回答更正：
题7。请教大家一个关于酶的问题！
如果问代谢过程中调节酶的四项措施，应该怎样答最全面？
答：酶的调节（修改版）
别构调节：现在把与各种配体（包括底物、抑制剂、激活剂等）结合后构象发生改变，从而导致与后续配体的亲和力改变的那一类酶统称为别构酶。先前结合与酶的配体能够改变后续的与同一酶结合的配体的亲和力的现象叫做别构效应，具有别构效应的酶叫做别构酶。别构效应中的先前结合的配体能够增加或者降低后续配体结合与同一个酶的亲合力，根据先前配体与后续配体是否相同，可分同促效应和异促相应，两者效应均不限于先前结合配体会促进后续配体的结合，也包括阻碍后续配体与酶的结合。配体与酶的相互作用至少调节酶活性阶段不涉及共价键形成，底物在酶的催化下形成产物有些时候会在反应历程中的一段时间内形成共价键。别构酶有极少数是只有一条肽链的，比如肝脏中的葡萄糖激酶。
（2） 共价调节：包括可逆与不可逆修饰，前者的有酶蛋白的磷酸化、腺苷酰化等，后者主要指酶原被切割掉部分一级结构片段而形成或暴露出活性中心进而成为有活性的酶。
（3） 活化/抑制蛋白对于酶的调节和生物膜对于酶的调节。前者如钙调蛋白能够调节多种酶的活性，Cyclin对CDK的催化活性的调节等，后者如双关酶在结合上生物膜时其活性与未结合时有所不同，即酶在细胞中的定位对其活性的影响；
（4）真核细胞的区室对于酶的空间定位和酶在细胞中运输对酶的活性也有明显的影响。酶在细胞中运输不仅需要信号肽或者导肽引导酶蛋白在细胞中正确运输与定位，而且跨膜转运时，在分子伴侣的作用下酶分子跨膜运输时会去折叠，跨膜后会再折叠，酶的不同的折叠状态影响了酶的活性。真核细胞的各种膜性细胞器构成区室会形成不同的亚细胞内环境，在不同的亚细胞内环境同一种酶的活性也会不同。
& & 前四者都是酶的活性调节。
（5）酶的数量调节：包括由于基因表达的调节而使酶的表达量有所不同，还包括酶的降解----------这往往与其他的生物大分子有关，比如蛋白酶体。
& & 这里只涉及生理条件下的酶的活性条件，不包括非生理环境中的酶，比如固定化酶和非水有机介质中的酶的调节。
沈同 王镜岩 主编 生物化学第二版和 王镜岩 主编 生物化学 第三版 的酶那章给出的四个酶的调节都是酶的活性调节，我把其中的可逆与不可逆修饰合二为一了。书上没有此题完全的现成的解答。
可参考：Alan Fursht，Structure and Mechanism in Protein Science-A guide to Enzyme catalyis and Protein folding，Freeman，1999.
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本帖最后由 asuka2013 于
11:47 编辑
补充两道生物化学计算题：
如果要考生物化学可以在考完英语的那天晚上看一下，最多20分钟就能能够理解并且记住，如果第二天考到了，拿个10分不是很合算吗。
题14. 250mmol/LPH=3.0和50mmol/LPH=4.5的酒石酸溶液怎么配制？（含缓冲溶液配制方法小结）
酒石酸是二元酸，但是解离时基本上只考虑一级解离即可，也是用Henderson-Hasselbalch方程，
1）PH=3的250mmol/L的酒石酸缓冲溶液的配制方法：
d-酒石酸，pKa1=3.04；pKa2=4.37.pH=pKa1+lg[C(HA-)/C(H2A)]
3=3.04+lg[C(HA-)/C(H2A)]
lg[C(HA-)/C(H2A)]=-0.04
[C(H2A)/C(HA-)]=10^(0.04)=1.0964，
这也就是说只要是同样摩尔浓度的酒石酸溶液和酒石酸钠溶液 按等体积混溶就成为PH=3，你既然要250mmol/L的酒石酸缓冲溶液，那就先配出250mmol/L的酒石酸溶液和250mmol/L的酒石酸钠溶液等体积混溶均匀即可成为PH=3的250mmol/L的酒石酸缓冲溶液。
2）250mmol/L的PH=4.5的酒石酸缓冲溶液的配制方法：
pH=pKa1+lg[C(HA-)/C(H2A)]
4.5=3.04+lg[C(HA-)/C(H2A)]
lg[C(HA-)/C(H2A)]=1.46
[C(HA-)/C(H2A)]=28.8403
也就是[C(HA-)/C(H2A)]=29/1，即配制时取【酒石酸钠的物质的量(摩尔数)】/【 酒石酸的物质的量(摩尔数)】=29/1.
补充一点：缓冲溶液的配制方法小结：1.用Henderson-Hasselbalch方程，pH=pKa+lg[C(HA-)/C(H2A)]，算出共轭碱(HA-)与共轭酸(H2A)的物质的量的比例（摩尔数比例）。2.对于多元弱酸，用Henderson-Hasselbalch方程，共轭酸变为共轭碱永远只取一级电离，也就是共轭碱(HA-)永远只带一个负电荷，因为二级解离要在一级解离的基础上，一般不必考虑。3.对于多元弱酸，用Henderson-Hasselbalch方程，pKa永远取pKa1。4.配制时比较简单的完整操作办法：将共轭碱(HA-)与共轭酸(H2A)的物质的量的总量定为1摩尔，并且共轭碱(HA-)与共轭酸(H2A)的物质的量的比例加以换算，是固体则换算成质量，是液体按其占有摩尔比换算成体积。举例：以第三题为例“250mmol/L的PH=4.5的酒石酸缓冲溶液的配制方法：pH=pKa1+lg[C(HA-)/C(H2A)]4.5=3.04+lg[C(HA-)/C(H2A)]lg[C(HA-)/C(H2A)]=1.46[C(HA-)/C(H2A)]=28.8403也就是[C(HA-)/C(H2A)]=29/1，即配制时取【酒石酸钠的物质的量(摩尔数)】/【 酒石酸的物质的量(摩尔数)】=29/1.”酒石酸钠的物质的量(摩尔数)+酒石酸的物质的量(摩尔数)=1mol溶质，这1mol溶质中酒石酸钠的物质的量(摩尔数)是29/30mol，用29/30mol X “酒石酸钠的分子量”=所要的酒石酸钠的质量。酒石酸是液体，我们用在1mol 溶质中: 酒石酸的物质的量(摩尔数)-----也就是：1/30mol/“酒石酸溶液的摩尔浓度”=酒石酸所需的体积。“酒石酸溶液的摩尔浓度&是指你们实验室的现货酒石酸溶液的摩尔浓度，当然要比最终缓冲溶液浓度大，不然还要先浓缩。这样，1mol溶质中酒石酸钠和酒石酸就凑齐了，先把两者都放进1L的烧杯中，然后向里注蒸馏水直到总体积到达1L或略少，搅拌均匀，测定PH，可往里面加极少量的酒石酸钠或酒石酸把PH值跳到4.5. 如此，你就有了1L的1mol/L的PH=4.5酒石酸缓冲溶液，然后再稀释到250mmol/L，稀释过程不影响pH值。除非无限稀释，因为那时就要考虑的水的pKa了。
当然，按250mmol溶质算酒石酸钠和酒石酸的用量，然后加蒸馏水定容至1L，不再稀释也可以。
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本帖最后由 asuka2013 于
12:48 编辑
补充两道题：
题15.三个lys连在一起，即三肽Lys-Lys-Lys的等电点如何计算？
解：这题不是我原创的，是张来群 等，生物化学习题集，科学出版社，2004，第二版，第4-5页上的，多肽Lys-Lys-Lys分子中有三个侧链可解离集团，等电点时侧链带正电，羧基带负电，由正负电荷相等每个侧链集团带1/3个正电荷(也就是[-NH2]/[-NH3+])& &&&
等电点：pH=pK3+lg([-NH2]/[-NH3+])& && && && && &&&
& && && && && &&&=10.53+lg([2/3]/[1/3])
& && && && && &&&=10.53+0.3& && && && && && &
& && && && && &&&=10.83
&&Lys-Lys-Lys多肽的等电点比任何一个pK数值都高。
&&多肽的等电点计算也是大家很头痛的问题。
&&更多的多肽的等电点计算的例子可参考：
&&张来群 等，生物化学习题集，科学出版社，2004，第二版，第一章，蛋白质化学；
&&陈俊辉 等，生物化学习题习题解析，科学出版社，2001，第三章，蛋白质化学，一看就懂，花不了20分钟，不然真的考到了就是10分的大题。
&&如果要考生物化学可以在考完英语的那天晚上看一下，最多20分钟，如果第二天考到了，拿个10不是很合算吗。
题16。常见的真核细胞翻译的起动因子的功能。
（题16.了解一下就行，考博也从来没有考过）
& & 各种版本的教材和专著上写的常见的真核细胞翻译的起动因子的功能太乱了，我根据Michael B.Mathews, Nahum Soneberg,John W.B.Hershey,Translational Control on Biology and Medicine,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2007, 整理了出来。
1.eIF1：起始密码子的识别：（1）使不正确的密码子与反密码子配对解离并且correct parings in poor sequence contexts in P site，（2）介导40S亚基对于正确的AUG密码的辨识的相关反应。参与确保起始密码子选择的忠实性（与原核的IF3相似）。
2.eIF1A：与原核生物的IF1功能相似，eIF1A可以占领真核细胞的核糖体A位（40S亚基），并使得40S亚基的一些结构域的相对位置发生变化。此外，eIF1A与eIF1还能够增强eIF3将80S核糖体解离为40S和60S亚基的活性。
3.eIF2：携带（Met-tRNAi Met）与40S亚基结合，形成三元复合体（40S complex），eIF2有GTPase活性。eIF2结合上的GTP水解为GDP+Pi的反应由eIF5介导，结合上eIF2的GDP与GTP交换反应由eIF2B介导。
4.eIF2B：结合在eIF2的GDP更换为GTP的反应由eIF2B催化，否则eIF2B上的GDP掉下来换上GTP的过程非常缓慢。
5.eIF3：有依赖性RNA的（RNA independent）解离80S核糖体为40S和60S亚基的活性，此活性可被eIF1A加强，部分地被eIF1增强。
eIF3能够结合到60S亚基的内表面的平台部位（platform），并且锁住40S亚基到达18Sr RNA元件（18r RNA属于40S亚基的通道），18Sr RNA元件位于40S亚基与60S亚基的内部接触面（inter subunit），并且象一座桥一样连接40S亚基中的B2b和B2d。
eIF3的另外功能：促进mRNA的结合与核糖体40S亚基的结合。
6.eIF4F：eIF4A，Eif4E和eIF4G各一个分子组成一个完整的eIF4F分子。
7.eIF4A：RNA helicase，使mRNA去除二级结构，其本身是较低的非持续性的螺旋酶（nonprocessive helicase），其酶活性能够被eIF4B所活化。也可以认为eIF4B是eIF4A的cofactor，eIF4B可能是增加了eIF4A与mRNA的亲合性而增加了eIF4A的RNA螺旋酶活性。
8.eIF4B：与eIF4A共同行使RNA螺旋酶活性，去除mRNA的二级结构。
9.eIF4E：真核mRNA的5'-帽子的结合蛋白。
10.eIF4G：连结eIF4E与PAB[Poly (A) binding protein]。
11.eIF5：与eIF2结合时会增强eIF2的GTPase活性，eIF5也是核糖体依赖性的GTPase。eIF5的GAP功能对40S亚基与60S亚基的结合是一个必需的先决条件（prerequisite），至少在细胞内是如此，因为敲除了酵母细胞eIF5基因会削弱翻译起并且引起48S前起始复合物（PTCs）的堆积。
12.eIF5B：有GTPase活性，eIF5B结合上GTP但未水解时，会占领核糖体40S亚基的A位。eIF5B的功能与原核的eIF2近似，eIF5B有很弱的结合Met-tRNAi Met活性。
13.eIF6：亚单位解聚，结合于60S亚单位。
参考：Michael B.Mathews, Nahum Soneberg,John W.B.Hershey,Translational Control on Biology and Medicine,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2007, P113, P91-P94, P100-P101, P103, P110-P111, P116, P104-105, P114, P250-P251, P253-254,P319。
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题17.什么是蛋白质变性？
答： 本题仅仅了解一下即可。
什么是蛋白质变性？关于蛋白质变性的定义，从本世纪30年代起，直到现在，一直是讨论的课题。有人认为，凡是涉及天然蛋白质的构象变化，而不涉及共价键断裂的任何过程，都是变性。有人把能引起蛋白质构象变化的二硫键断裂以及侧链基因的化学修饰，亦归之于变性。1931年，吴宪指出：蛋白质变性，就是天然蛋白质分子，从紧密有序结构变成松散无序结构的过程。上述定义的一个共同的缺点，就是没有与生物活性的变化联系起来。蛋白质变性是会丧失生物活性的。因此，比较完整的说法是：由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。这一过程就是变性。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构上肽键的断裂。从构象上看，变性蛋白质与天然蛋白质的差别有大小之别。最小者可以只差一个次级键，或一个侧链基因的取向；差别最大者，除一级结构相同而外，几乎所有原子的空间位置都与天然蛋白质的不同。变性所涉及的蛋白质的构象变化，范围很广。它可以是很小的构象变化，以致于用目前的实验手段几乎无法测出；它也可以是较大的构象变化，用物理、化学方法可以测定。摘自：陶慰孙、李惟、姜涌明主编，《蛋白质分子基础》，高等教育出版社，1995年，314页。Loss of Protein Structure Results in Loss of FunctionProtein structures have evolved to function in particular cellular environments. Conditions different from those in the cell can result in protein structural changes, large and small. A loss of three dimensional structure sufficient to cause loss of function is called denaturation. The denatured state does not necessarily equate with complete unfolding of the protein and ran-domization of conformation. Under most conditions, denatured proteins exist in a set of partially folded states that are poorly understood.Most proteins can be denatured by heat, which affects the weak interaction in a protein (Primarily hydrogen bonds) in a complex manner. If the temperature is increased slowly, a protein’s conformation generally remains intact until an abrupt loss of structure (and function) occurs over a narrow temperature range (Fig.6-26). The abruptness of the change suggests that unfolding is a cooperative process: loss of structure in one part of the protein destabilizes other parts. The effects of heat on proteins are not yet readily predictable. The very heat-stable proteins of thermophilic bacteria have evolved to function at the temperature of hot springs (~100℃). Yet, the structures of these proteins often differ only slightly from those of homologous proteins derived from bacteria such as Escherichia coli. How these small differences promote structural stability at high temperatures is not yet understood.Proteins can be denatured not only by heat but by extremes of pH, by certain miscible organic solvents such as alcohol or acetone, by certain solutes such as urea and guanidine hydrochloride, or by detergents. Each of these denaturing agents represents a relatively mild treatment in the sense that no covalent bonds in the polypeptide chain are broken. Organic solvents, urea, and detergents act primarily by disrupting the hydrophobic interactions that make up the stable core
extremes of pH alter the net charge on the protein, causing electrostatic repulsion and the disruption of some hydrogen bonding. The denatured states obtained with these various treatments need not be equivalent.From: D.L.Nelson M.M.Cox, LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY, Worth Publishers, 2000 3rd ED, P.192.
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本帖最后由 asuka2013 于
21:23 编辑
题18.用大肠杆菌表达来源于动物细胞的某一氧化还原酶；并利用免疫荧光技术对细胞中的该蛋白进行定位。
答：这问题由我本人设计实验（方法还有很多种，我没有都写出来），但不是我的实验课题，是我昨天在“百度知道”（偶尔去了一趟）回答内蒙古大学某人的一个实验设计问题，我刚回答完，原问题却被撤消了（⊙﹏⊙b汗）。
发在这里仅仅是通过这个例子给各位看一下思考实验设计问题的大致的较为完整的步骤和思路。这是具体的实验课题设计，考研一般考不到如此难度（各位不要害怕），考博有可能考到如此难度，对考博生物化学与分子生物学这样考也是10分以上的压轴题。再说一遍，这个问题是硕士生或博士生的实验课题的设计，不是考研试题，不要看到后惊慌，只是考完英语后扫一眼知道实验设计也不过如此，并非高不可及！而且具体的科研课题的实验设计也必须要以基础知识为逻辑起点和具体工具。{:soso_e100:}
这不难设计。
第一步，获得来源于动物细胞的某一氧化还原酶的基因并且将其导入大肠杆菌。
这就是分离基因，化学合成，cDNA文库，mRNA筛选（比如DDRT，RDA，mRNA差异显示技术,削减杂交等），鸟枪法分离基因等等；然后导入载体（质粒，用表达载体好一些，因为先把载体DNA整合到大肠杆菌的基因组不太容易，整合进去高表达还要费不少事情）；再将载体导入大肠杆菌细胞（比如氯化钙制备感受态大肠杆菌，使其转化载体进入其细胞），一般在其基因之前加上强启动子。这步还包括阳性克隆筛选和分离，大规模培养，产品收获就算了，不要粉碎细菌，也不要构成分泌蛋白质，就让目的基因表达的蛋白质留在大肠杆菌细胞里。这一步就是完全依据基因工程的进本步骤而设计。
第二步，获得抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体。
单抗的制备方法，最粗糙的方法：小鼠腹水法。其实用多克隆抗体也可以，只是效果差一些。
第三步，，给单克隆抗体标记上可以发出荧光的基团。荧光从哪来？给偶连蛋白质标记上能够发出荧光的有机染料分子不就行了。或者也可以直接使用量子点荧光法，量子点本身也就是靠其偶联的抗体在细胞内定位的。量子点制备与实验方法的原理与步骤可以参见Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。这一步也下一步密切信关，做得好下一步可以省很多事情。当然也可以给把单克隆抗体的基因偶联上绿色荧光蛋白的基因在大肠杆菌中一同表达，两者之间共价键链接，但是比较麻烦。
第四步，将用免疫荧光基团标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体进入大肠杆菌细胞中。
给把单克隆抗体的基因偶联上绿色荧光蛋白的基因在大肠杆菌中一同表达，两者之间共价键链接，首先还要要把抗一种将抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体的基因分离出来导入大肠杆菌这也是一种实验方法，不过构建基因，联入DNA载体，导入细胞，阳性克隆筛选，工作量可不小，我是不这样实验的，时效比太低。
还有其他的更简单的实验方法：直接从蛋白质水平动手。从外界导入带有荧光标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体蛋白质，这又可以有好多种办法：一种显微注射法，对实验人员的操作水平要求推高，而劳动量大，像我这样的懒人绝对不干（给钱也不干）；第二种方法让细胞内吞摄入蛋白质，然后把抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体一起拉入细胞（去查一下大肠杆菌内吞哪些蛋白质），当然要把大肠杆菌内吞蛋白质与抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体共价链接在一起。怎么连？再做个融合蛋白的基因去表达出来？那多累呀，像我这样的懒人绝对不干（给钱也不干），谁像这样实验谁就去做，反正我绝对拒绝如此实验（不当低水平劳动力），可用分子交联方法-------用有机试剂把两者用化学反应偶联到一起不就行了吗，有空间位阻，加个链接臂行了吧，比如可以先用EDC、戊二醛等试试看，去查一下与抗体工程和酶的固定化相关的Methods in Molecular Biology ，Methods in Enzymology系列的实验手册。分子交联方法当然会出很多的混合物，用层析筛选一下，在检测一下活性，适当控制和调整反应试剂和反应条件，得到阳性结果不难。荧光从哪来？给偶连蛋白质标记上能够发出荧光的有机染料分子不就行了。或者也可以直接使用量子点荧光法，量子点本身也就是靠其偶联的抗体在细胞内定位的。量子点制备与实验方法的原理与步骤可以参见Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。
第三步和第四步实际上很难说谁先谁后，我是为了说明清楚人为分开的。
第五步，单抗与来源于动物细胞的某一氧化还原酶（抗原）相互作用。
抗原与抗体相互作用并不困难，但是在细胞中要注意必须使得两者在同一个亚细胞区室中。因为这题是在大肠杆菌中，没有细胞器，也就不必再给当克隆抗体连接上进入各个封闭性的细胞器的信号肽序列，比如进入线粒体或者叶绿体或溶酶体等特异性信号肽序列。如果原问题问的是确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位，那么这步实际上就省略了；如果原问题问的是确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在原来表达它的动物细胞中的具体部位，那么给单抗的氨基端接上信号肽或者信号斑（后者不在氨基端）可能就是需要的（第六步再解释为什么即使对于真核的动物细胞也不是必须要给单抗接上信号肽和信号斑）。给单抗接上信号肽和信号斑用融合蛋白当然是可行的，但是工作量又大了，有没有更爽的试验方法？当然有！请看第六步，
第六步，确定大来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞和在原来表达它的动物细胞中的具体部位（原题没有说清楚，所以对两种细胞都要讨论）。
1.确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位。给予大肠杆菌细胞外界光源，使导入的荧光基团发出特异性波长的荧光，用荧光显微镜直接观察荧光所在细胞的亚细胞部位，并拍照可确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位。
2.确定来源于动物细胞的某一氧化还原酶在原来表达它的动物细胞内的具体部位。按第五步构成融合蛋白质当然是可以的，但是等于把第一步的工作有对抗源于动物细胞的某一氧化还原酶的基因基本上又重复了一遍，工作量大也没有太大必要。但是在氨基端共建连接上一段信号肽，用有机合成合成方法（比如用EDC催化氨基与羧基缩水构成新的肽键，虽然副反应不少，但是反应条件温和，效率高，用层析分离收获到所需产品并不难，可是信号斑在肽段中间，再用有机合成先切开再插入信号斑序列，然后还要连接，每一步都有副反应，每一步都要分离提纯，还涉及到重折叠，即使能够做成，劳动量比融合蛋白绝对不小。{:soso_e113:}那怎么办？既然困难很大，那么就另辟蹊径，从别的实验途径达到目的。做好了有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体，不再加工了；而转向加工原来表达“来源于动物细胞的某一氧化还原酶”的动物细胞本身·，将该种动物细胞粉碎，然后分级分离提纯细胞不同成分，比如离心、层析，不用太多的分离纯化，对膜性封闭细胞器还是必须能够彼此分开，因为要加以各自粉碎，膜性封闭细胞器混在一起被粉碎就不知道液相提取液的具体来源了。然后分别对于不同提取液加入有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体，进行免疫沉淀。发生沉淀后收集免疫沉淀物，因为可以事先用非变性分子筛层析测出单抗与目的酶混合物的相对分子量，再给予不同提取液加入有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗与其抗原的复合物给予外界光源，使单抗偶联的荧光染料发出特定波长的荧光，进而用荧光显微镜观测，是阳性结果的提取液是目地酶的来源的亚细胞定位处。如果免疫沉淀物中的荧光有机染料不能够有效吸收外界光源并且激发荧光，可以适当加入中性盐溶液，比如氯化钠，拆解开免疫复合物，并适当稀释。因为有荧光显微镜的直接观测，所以免疫沉淀可以做的稍微比较粗糙。实际上，还有很多种实验方法，有很多实验方法不必使用免疫荧光，可能还更加简单。{:soso_e112:}Good Luck!& &
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本帖最后由 asuka2013 于
12:46 编辑
今天，我补充了5道题与解答，都是相当有难度的问题，请考研同学根据各自需要参考与取舍。{:soso_e100:}
正好凑成了18道题，18是大吉大利的数字，衷心祝愿各位考研同学在2013年的第一个双休日（考研日）大吉大利！凯旋归来！金榜题名！
顺便说一句：我是85后，我的ID中asuka 是著名动漫“新世纪福音战士”中的主角之一“明日香”的英文表达。明日香全名：惣流·明日香·兰格雷，英文全名：SOURYU ASUKA LANGLE。{:soso_e113:}
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