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避免基因组DNA污染的半定量RT-PCR新方法
2011年第6期目录
&&&&&&本期共收录文章20篇
　　摘要：为了消除基因组DNA的污染，在逆转录引物oligo-dT5’端加上通用引物T7B结合序列，根据3’-RACE的原理，用T7B和目标基因特异性引物即可进行半定量RT-PCR分析。用该方法对转GhGAI基因的拟南芥进行表达分析，结果表明：此方法可有效避免基因组DNA污染导致的假阳性。 中国论文网 /8/view-51038.htm　　关键词： 半定量RT-PCR；新方法；转基因植株 　　中图分类号：X171 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.. 　　 　　A New Semiquantitative RT?PCR Technique to Avoid Genome DNA Contamination 　　LU Jia-ju1，CUI Bai-ming2，LIAO Wen-bin 2，YU Hai-chuan 2，PENG Ming 2 　　(1.Guizhou Institute of Subtropical Crops, Xingyi, Guizhou 562400,C 2.State Kay Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou , Hainan 571101, China) 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ: In this paper, a new semi-quantitative reverse transcription PCR technique was employed for analyzing the expression of genes, which have no intron or unknown intron. To deal with the existence of genome DNA contamination, universal primer T7B link sequence was added to oligo-dT-5'end. The reverse transcription PCR was performed by using T7B and special primer of target according to 3 'RACE theory. The expression of GhGAI gene in transgenic Arabidopsis was analyzed using this method, the results indicated that this method could effectively remove genome DNA contamination and prevent against false-positive result. 　　Key words: semi-quantitative Reverse Transcription PCR;transgenic plants 　　 　　检测和分析组织或细胞中的基因表达水平常用的方法有原位杂交[1-2]、Northern印迹杂交、RNA斑点杂交[3]、S1核酸酶和核酸酶A保护分析法等，这些方法除原位杂交比较敏感外[4]，其它的方法均需要较多的样品量，而逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction)[5]是将mRNA分子的cDNA序列进行扩增，从而为用非常少量的模板分析RNA表达提供了可能。现在RT-PCR以其灵敏度高(比杂交法高1 000～10 000倍)、专一性好、快速简单等特点，作为mRNA测定和定量日益得到大家的认可，已被广泛地用于基因工程中目的基因表达水平的检测[3]。当我们导入植物的基因无内含子或者内含子不详，那么对其表达量进行半定量RT-PCR分析时，就会出现基因组DNA的污染造成的假阳性现象。使用DNA酶消化基因组DNA可以避免DNA的污染，但是DNA酶消化过程会导致部分RNA的降解。笔者就如何有效避免RNA样品中基因组DNA污染的半定量RT-PCR新方法作一介绍：即根据3′-RACE的原理，在逆转录引物oligo-dT 5′端加上通用引物T7B结合序列，用T7B和目标基因特异性引物即可进行半定量RT-PCR分析,并避免基因组DNA污染。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 转基因植株 转化棉花GhGAI（GenBank登录号：DQ006269）基因的T2代转基因拟南芥。 　　1.1.2 试剂 Plant RNA Purification Reagent购自Invitrogen公司；Quant Reveres Transcriptase 试剂盒、HotStart Taq DNA Ploymerase均购自天根生化科技有限公司。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 引物设计 引物均利用Vector NTI软件设计。根据棉花GAI基因序列，合成GAIP1、GAIP2 和MGAIs等引物；3′-RACE起始引物T7dTN和互补引物T7B；以拟南芥Histone基因（GenBank登录号: AT4G40040）为内标，引物为MHIS3s和 MHIS3a (表1)。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　 　　 　　1.2.2 叶片总RNA提取 按照Invitrogen公司的Plant RNA Purification Reagent试剂说明书提取拟南芥叶片总RNA，具体操作步骤如下：取100 mg拟南芥新鲜叶片，用液氮研磨成粉后，快速转入1.5 mL离心管中，加0.5 mL冰冷的RNA 提取试剂，迅速混匀；室温放置5 min，12 000 r?min-1 4 ℃离心2 min，取上清液，加入0.1 mL 5 mol?L-1 NaCl，混匀后加入0.3 mL氯仿充分混匀；12 000 r?min-14 ℃离心10 min，取上清液，加入等体积异丙醇混匀后，室温放置10 min；12 000 r?min-1 4 ℃ 离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75％乙醇洗沉淀；12 000 r?min-1 室温离心1 min，弃尽上清液；干燥沉淀后溶于10～30 μL DEPC处理水，立即取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，-70 ℃保存备用。 　　1.2.3 RT-PCR 按Quant Reveres Transcriptase试剂盒说明书操作逆转录反应，其反应体系为：总RNA 1.5 μL，10×RT 缓冲液 2 μL，2.5 mmol?L-1 dNTPs 4 μL，10 μmol?L-1 T7dTN 2 μL(或Oligo(dT)18 1 μL），10 U RNA酶抑制剂，Quant Reveres Transcriptase 逆转录酶1 μL，DEPC处理过的水补至反应总体积20 μL，轻微混匀后，37 ℃保温1 h。逆转录反应结束后，每个样品管加29.82 μmol?L-1的EDTA 1.2 μL，鳌和逆转录产物中的Mg2+，便于cDNA的长期保存，同时可减小多余的Mg2+对下一步PCR反应的影响，并加78.8 μL去离子水将逆转录产物稀释到100 μL，-20 ℃保存备用。取2 μL反转录产物为模板进行PCR扩增。扩增体系为：2 μL 10×Hot Start Taq 缓冲液(含MgCl2)，10 m mol?L-1 dNTPs 0.4 μL，5′和3′端引物各10 μmol?L-1，0.5 U Hot Start Taq DNA 聚合酶，反应总体积20 μL。
　　1.2.4 RT-PCR反应条件的优化 根据HotStart Taq DNA Ploymerase使用说明，以上述合成的cDNA为模板，优化模板量及循环次数做PCR，确定最适宜的参数，建立能同时稳定扩增GAI和HIS3基因片段的半定量RT-PCR检测体系。 　　1.2.5 PCR反应产物的检测 取5 μL PCR扩增产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果用高分辩数字图像分析系统FluorChem 进行成像和光密度分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 总RNA质量及引物特异性验证 　　测定RNA样品的纯度和完整性，结果显示ODA260/ODA280值约为2.0，电泳图谱条带清晰、28 s和18 s比值约为2，证明样品的总RNA质量较好（图1）。由图2可知，分别以总RNA、Oligo(dT)18为起始引物合成的cDNA为模板，GAIP1和GAIP2引物做PCR可以扩增出与预期大小一致的条带；而MGAIs和T7B引物只有用T7dTN为起始引物合成的cDNA作模板才能扩增出与预期大小一致的条带，而用RNA作为模板则没有相应条带。说明以T7dTN反转录合成的cDNA和用引物MGAIs和T7B做RT-PCR，即可有效避免基因组DNA的污染。 　　 　　 　　 　　这是因为我们转化的GhGAI基因不含内含子，即使用Oligo(dT)18作反转录合成的cDNA，用GhGAI基因序列设计合成的GAIP1和GAIP2引物进行PCR，在提取的样品总RNA中含有微量的基因组DNA时，就能扩增出与目标条带一致的产物，很容易导致假阳性。可我们利用3′-RACE起始引物T7dTN反转录合成的cDNA，T7B互补引物和GhGAI基因同源引物MGAIs进行PCR扩增， 就可有效避免样品污染基因组DNA而造成的假阳性结果。 　　 　　 　　2.2 半定量RT-PCR模板量的确定 　　根据内标Histone基因的PCRHistone基因扩增结果确定进行PCR反应时加入的cDNA量。首先每个样品取1 μL cDNA，用MHIS3s和MHIS3a引物进行PCR反应，结果用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的量。依据此轮PCR结果调整cDNA的量进行下一轮PCR，直到每个样品的PCR扩增Histone基因产物的量一致时，确定所需加入的cDNA量模板量，据此cDNA量PCR扩增GhGAI基因，检测每个样品中GhGAI基因的表达量。 　　 　　2.3 半定量RT-PCR循环次数的确定 　　用T7dTN起始引物反转录合成的cDNA为模板，用MHIS3s/MHIS3a和MGAIs/T7B引物，分别设18，20，22，24，26，28，30个循环扩增Histone基因和GhGAI基因(图4)。结果经凝胶成像系统扫描分析，以各电泳条带的光密度值(光密度曲线峰面积)为纵坐标，循环次数为横坐标作图(图5)。如图5所示，Histone和GhGAI基因在设定的每个循环都可被检出，但在26，28和30个循环都进入平台期。因此，为保证扩增体系中目标片段的扩增均处于线性期[6-7]，故确定循环数为24。PCR 扩增条件为94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共24个循环。 　　 　　 　　3 结论与讨论 　　半定量RT-PCR检测体系必须有效去除RNA中基因组DNA污染造成的PCR反应中存在的假阳性结果[8]。本试验所转化的目的基因没有内含子，无法采用跨内含子的引物设计方法避免PCR反应中基因组DNA污染造成的假阳性结果[9]。如果用DNA酶消化基因组DNA，那么在操作的过程中又会导致RNA的降解，使最后结果不准确。因此，我们利用3′-RACE的原理，根据目标基因序列设计的特异引物和通用引物T7B进行PCR扩增，有效地避免了基因组DNA污染问题。 　　PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促反应定律，开始的循环内扩增产物呈指数累积，产物与模板量呈线性关系，半定量RT-PCR技术[1]正是利用产物与模板的这一线性关系，通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达进行定量，该技术己被广泛成功应用于检测转基因植株中基因的表达[10]。但经过一定的循环后，PCR产物不再呈指数累积而进入平台期，因此，为避免平台效应的影响，确定最合适的循环数是半定量RT-PCR方法的关键因素之一。本试验中目的基因与内参基因的扩增动态曲线表明，二者处于线性期的最佳循环次数为24，但内参基因的PCR扩增效率较高，故采用在同等条件下异管扩增目的基因。 　　为避免RNA提取、cDNA合成及PCR反应过程中存在的系统误差和人为误差。本试验除选用在植物体内稳定表达的持家基因Histone作为内参，采用反转录与PCR分开进行的两步法RT-PCR，在试验摸索阶段较一步法RT-PCR更为经济、有效。为尽量避免RNA的降解，每次提取总RNA后，立即反转录成cDNA，而且每一次反转录合成的cDNA模板可供多次PCR使用，不但有效节约成本，还缩短了试验周期，提高了试验的成功率。此外，本试验不进行RNA定量，而对持家基因Histone亮度确定模板量，从而确定转基因植株中目的基因的相对表达量，提高PCR扩增的准确性。 　　总之，本试验方法不仅可以有效避免RT-PCR反应时，基因组DNA污染造成的假阳性，也为半定量RT-PCR中模板定量提供了参考依据。 　　 　　参考文献： 　　[1] Yutaka S, Masanori T, Taka M. Abnormal cell divisions in leaf primordial caused by the expression of the rice home box gene osH1 lead to altered morphology of leaves in transgenic tobacco[J]. Molecular Genetics and Genomics,):13-22. 　　[2] Pedersen C, Zimny J, Becker D. Localization of introduced genes on the chromosomes of transgenic barley, wheat and critical by fluorescence in situ hybridization[J]. Theoretical and Applied Genetics,～7):749-757. 　　[3] 朱飞舟,陈立云,何强.转基因植株的分子检测方法概述[J].杂交水稻,):1-4. 　　[4] 胡庆宏,刘明?,栾树清,等.RT-PCR方法半定量在基因表达水平检测中的应用[J].实用临床医学,. 　　[5] Ma Y J, Costa M E, Ojeda S R .Developmental expression of the genes encoding transforming growth factor alpha and its receptor in the hypothalamus of female rhesus macaques[J]. Neuroendocrino,):346. 　　[6] Ferre F. Quantitative or semi-quantitative PCR: Reality versus myth[J]. PCR Methods Apply,):1-9. 　　[7] 苏岭,李绍戊,王荻,等.半定量RT-PCR方法检测热应激对鲫鱼肝脏中HSP70mRNA含量的影响[J].华北农学报,2010,25(增刊):100-104. 　　[8] 金凤媚,薛俊,郏艳红,等.半定量RT-PCR技术的研究及应用[J].天津农业科学,):10-13. 　　[9] Rolland V G. Semi-quantitative analysis of gene expression in cultured chondrocytes by RT-PCR[J].Methods Mol Med,):69-78. 　　[10] 陈昕,王保莉,曲东,等.小麦硫转运蛋白基因半定量RT-PCR检测方法的建立[J].西北植物学报,):309-313.
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荧光定量pcr引物设计原理是怎样的？
09-03-10 &
貌似我做的时候引物没有考虑那么多似乎只要是在保守序列里的就可以所以引物会有很多组组合。我一直以来跑PCR后 电泳也没发现带  一般是摸版或者引物的问题几率比较大
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貌似 做的时候引物没有考虑那么多似乎只要是在保守序列里的就可以所以引物会有很多组组合。 一直以来跑pcr后 电泳也没发现带  一般是摸版或者引物的问题几率比较大
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一、pcr概述1、什么是pcr    聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称pcr）又称无细胞分子克隆或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增技术。由美国科学家pe（perkin  elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的dr. mullis发明，由于pcr技术在理论和应用上的跨时代意义，因此mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。
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貌似我做的时候引物没有考虑那么多 似乎只要是在保守序列里的就可以 所以引物会有很多组组合。 我一直以来跑PCR后 电泳也没发现带 一般是摸版或者引物的问题几率比较大
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实时荧光定量PCR —一种科学准确的定量方法实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强,有效解决PCR污染问题,自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用.本文试就其定量原理,方法及参照问题作一介绍.一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.1.在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念—— Ct值.C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示).图1. Ct值的确定 2. 荧光域值(threshold)的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10 SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct值越小.利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值(如图2所示).因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.图2. 荧光定量标准曲线 4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料〔2〕.现将其原理简述如下:1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.如图3所示.图3. TaqMan 荧光探针工作原理2)SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步.二.内标在传统定量中的意义1.几种传统定量PCR方法简介〔3〕:1)内参照法:在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成.上游引物用荧光标记,下游引物不标记.在模板扩增的同时,内标也被扩增.在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板〔4〕.2)竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板.在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记).扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数〔5〕.3)PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色.常规的PCR-ELISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的〔6〕.2.内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差.同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验,所得结果有很大差异(见图4),因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量.加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性.但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量,粗略定量的方法.图4. 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定;Ct值则极具重现性三.内标对荧光定量PCR的影响 1.实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果.因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的.(见图4)2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法.2.内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著〔7,8〕.但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标.也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法.美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较,得出的结论是:内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的,而外标准曲线的定量方法是一种准确的,值得信赖的科学方法〔9〕.Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准,可实现多色荧光同时检测,但定量检测仍然采用外标准曲线的方法,而不用内标进行定量.综上所述,利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究,转基因研究,药物疗效考核,病原体检测等诸多领域〔10,11,12,13〕.
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RACE技术服务对于引物设计介绍
|基因特异性引物(GSPs)应该是：
1、23-28nt
2、50-70%GC
3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
8、引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。
9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。
11、验证基因特异性引物的对照：
单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照：(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5-12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。【RACE技术服务】
RACE技术服务对于引物设计介绍
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|基因特异性引物(GSPs)应该是：
1、23-28nt
2、50-70%GC
3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
8、引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。
9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。
11、验证基因特异性引物的对照：
单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。
利用两个GSPS进行阳性对照：(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5-12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。【RACE技术服务】
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Copyright (C) 2017 百奥斯生物 All Rights Reserved 鄂ICP备号-2那请问RACE后,引物合成回来,进行PCR时,（加UPM的体系）,PCR体系是多少啊?
_首尔云很白
跟正常PCR一样,没什么特殊的,就是把扩增引物换成UPM和RACE的特异引物就行,我们一般都用的是25ul的
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你用的是试剂盒吧？可以参考说明书里的反应体系。
好像是 有个英文说明，但看不懂。
汗。大段的英文看不懂，反应体系总该能看的懂吧？哪个公司的试剂盒？ 实在不行就按普通PCR反应体系来
扫描下载二维码RACE引物设计 - 实验交流 - 生物秀
标题: RACE引物设计
摘要: [RACE引物设计] RACE 特异引物的设计除了1、23－28nt2、50－70％GC3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2) 由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。等这些条件外，还需要检测和普通PCR引 关键词:[引物 序列 引物设计 互补 扩增]……
RACE 特异引物的设计除了
1、23－28nt
2、50－70％GC
3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
等这些条件外，还需要检测和普通PCR引物一样的那些东西吗？比如二级结构等？
另外5’RACE的GSP是不是就是在CDNA序列上找一段合适的为引物？而3’RACE是与CDNA反向互补序列？
哪位大侠能指导一下？回复就把编码链（ATG。。。。。AAAAAAAAA）序列丢到PP5里面，按正常设计PCR引物设计那样，单独设计forward和reverse两条引物就行了。因为两条引物扩增的片段可以没有重叠部分，所以不能，也不用按pair设计，分开单独搞就行。
真要算计mRNA到cDNA要互补，cDNA到引物要互补什么的会算疯的，除非你脑子足够清楚。
原则和设计普通PCR引物的差不多，没什么特殊的。设计完之后和UPM比较一下，不要过于容易形成cross-dimer。预测的产物片段不要太短，不然很容易把引物二聚体的条带切下来当产物做克隆，而实际上压根就没P出来。回复另外说一点，我当初设计引物的时候，PP5里面显示的Tm都在70度以上，但是公司送来的单子上都是在65度左右。毕竟Tm都是个理论计算值，算法不一样，结果就不一样，也很正常，就没有细想，就照以往做的按PP5的为准，用了protocol里推荐的Touch-down（或者Step-down），但是没有结果。后来只好做梯度，60度退火才有产物。所以确定Ta可能还不是很容易。回复
就把编码链（ATG。。。。。AAAAAAAAA）序列丢到PP5里面，按正常设计PCR引物设计那样，单独设计forward和reverse两条引物就行了。因为两条引物扩增的片段可以没有重叠部分，所以不能，也不用按pair设计，分开单独搞 ... 那如果仅仅只设计5’RACE的特异引物呢？回复
那如果仅仅只设计5’RACE的特异引物呢？ 那就只设计reverse的回复
那就只设计reverse的 谢谢啦
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