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MIN6细胞,胰岛细胞
MIN6细胞,胰岛细胞
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产地：美国/中国
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公司名称： 上海康朗生物科技有限公司型号：1ml/株
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（联系我时，请说明是在上看到的，谢谢！）求助如何更好进行胰岛细胞系培养?小鼠胰岛细胞系 MIN6细胞培养过程中,如何长时间保持细胞活力?感觉一般传了6-7代后就长不好了.我用的含20%FBS的1640培养液,加入1%谷氨酰胺.谢谢.
″将军灬靂
参考答案:灵感不过是“顽强的劳动而获得的奖赏”.——列宾
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MIN6细胞,胰岛细胞
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MIN6细胞,胰岛细胞&一个细胞培养物的主要优点是操纵物理化学（即，温度，pH，渗透压，O2和CO2张力）和生理环境（即，激素和营养物浓度），其中所述细胞繁殖的能力。除温度，将培养环境是由生长培养基进行控制。MIN6细胞,胰岛细胞&原代分离、培养基本操作步骤：a.腹腔注射戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，腹部喷75%酒精消毒，无菌条件下取出胸部主动脉组织；b.去除主动脉组织表面的脂肪和结缔组织，HBSS清洗2次，解剖显微镜下倒置主动脉，15ml离心管中加入3ml胶原酶消化液，37℃消化20min，消化期间每10min轻轻充分吹打细胞消化液，使细胞尽量脱落；c.MIN6细胞,胰岛细胞&用200目细胞筛滤去未消化部分组织，之后1500rpm离心5min；弃上清，沉淀细胞加3ml完全培养液重悬，d.然后，用0.1%胰酶消化组织20min，消化期间每10min轻轻充分吹打细胞消化液，使细胞尽量脱落；e.用200目细胞筛滤去未消化部分组织，之后1500rpm离心5min；弃上清，沉淀细胞加3ml完全培养液重悬f.将c和e步骤重悬培养液混匀后接种于25cm2培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养2h；最后，轻轻吸出瓶中培养基，之后往瓶中加入5ml新鲜完全培养基继续培养。MIN6细胞,胰岛细胞&而培养物的生理环境不同时定义为其物理化学环境中，更好地理解血清的组件，所必需的增殖的生长因子的鉴定，并更好地理解细胞在培养的微环境（即，细胞&-&细胞相互作用，气体的扩散，与基质相互作用）现在允许在无血清培养基中某些细胞系的培养。kl-1101&DU145(前列腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周　　　　　　　　　kl-1123kl-1102&Lncap(前列腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1103&PC-3(前列腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1104&MOLT-4(急性淋巴母细胞白血病细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-(膀胱癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1106&Raji(Burkitt's 淋巴瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1107&SCaBER(膀胱鳞癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1108&NAMALWA(Burkitt's 淋巴瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1109&T24(膀胱移行细胞癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1110&HuT78(T淋巴细胞白血病细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1111&SW-13(肾上腺皮质腺癌细胞 ).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1112&SW-13(肾上腺皮质腺癌细胞 ).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1113&Dami(巨核细胞白血病细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1114&OS-RC-2(肾癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1115&MEG-01.&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl--O [786-0](肾透明细胞腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl--O [786-0](肾透明细胞腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1118&K-562(慢性髓原白血病细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1119&K-562(慢性髓原白血病细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1120&Hce-8693(盲肠腺癌细胞(未分化)).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1121&HEL299(红白细胞白血病细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1122&CW-2(结肠腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1123&A-375 [A375](恶性黑色素瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1124&COLO-320(结肠腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-(胶质母细胞瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1126&SW480 [SW-480](结肠癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1127&SHG-44(胶质瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1128&Caco-2(结肠腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1129&Caco-2(结肠腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-(胶质瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1131&LS 174T(结肠腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1132&SK-N-MC(神经上皮瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1133&SK-N-MC(神经上皮瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1134&BxPC-3(原位胰腺腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1135&BxPC-3(原位胰腺腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1136&KP-N-NS(肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1137&AsPC-1(转移胰腺腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1138&AsPC-1(转移胰腺腺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1139&U-2 OS(骨肉瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1140&U-2 OS(骨肉瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1141&GBC-SD(胆囊癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1142&RD(恶性胚胎横纹肌瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1143&RD(恶性胚胎横纹肌瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1144&HCCC-9810(胆管细胞型肝癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1145&A-673(横纹肌瘤细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1146&SMMC-7721(肝癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1147&SMC-1(胸膜细胞瘤).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1148&QGY-7703(肝癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1149&NCI-H446 [H446](小细胞肺癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1150&QGY-7701(肝癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1151&BEL-7405(肝癌细胞).&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周kl-1152&NCI-H460 [H460](大细胞肺癌细胞0.&品牌ATCC&规格25毫升/株.&货期1-2周&
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内分泌细胞学技术
第1篇第11章
内分泌细胞学技术
内分泌细胞学技术
内分泌细胞培养的应用
探索各种内分泌细胞的功能，各种激素的作用方式及其对机体的影响是内分泌基础研究的主要目标之一，而各种激素在发挥功能的过程中大多是与相应的靶细胞结合而发挥作用。体外细胞的培养，使上述研究更加直接和有效。
【细胞培养】
细胞培养（cell culture）：是指从体内分离细胞、在体外模拟体内的环境（包括无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件下等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。培养物常为单个细胞或单一细胞群，特殊情况下可用不同组织来源的细胞共同培养。细胞培养的出现，开创了生命科学研究新的里程碑，使生命科学不再受组胚学、解剖学的局限，以活的有机体做研究对象。目前，细胞培养不仅是生命科学理论研究的重要技术方法，细胞移植和细胞治疗也逐渐应用于临床，而且日益成为生物工程和基因工程的生产手段。
一、细胞分离
细胞分离是指将细胞或细胞团从组织块中游离出来，而原已存在于体液中的细胞如血液中的细胞则不需分离，可直接纯化。一般采用机械法或酶消化法，前者指用机械手段如剪刀、玻璃注射器蕊、细胞匀浆器等将组织块变成小于2mm3的组织甚至单个的细胞或细胞团；后者指用能分散细胞外基质的酶将细胞从其支持组织中分离出来。常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、高纯度分散酶，它们又有各种不同的类型。实际应用时，应针对不同的组织来源，采用不同的类型和酶浓度。
经上述方法分离的细胞一般为多种细胞及细胞外基质的混合物，如果要得到单一细胞群，则需进一步纯化。
（一）筛网过滤法&&& 选择孔径比细胞直径稍大的不锈钢或尼龙膜网，分离后的细胞经无菌的筛网过滤，孔径比细胞大的物质便留在筛网上。该方法只能对细胞进行初步纯化，对细胞类型比较单一的组织块如除去包膜的脾脏细胞等是有效的，而对于其他细胞如胰岛等则需进一步的纯化。
（二）密度梯度离心&&& 使用不同浓度的Ficoll（含葡聚糖）形成不同的密度梯度，细胞置于Ficoll上或与它们共同组成密度梯度，在适当离心力下进行离心，吸取特定细胞层，即可分离目的细胞[1]。经密度梯度离心后的细胞已经达到了较高的纯度，为常用的一种细胞纯化方法。
（三）显微镜下直接吸取细胞或刮取细胞层&&&
为获得单克隆细胞或排除其他细胞的污染，对于体积较大（如胰岛）或有显著特征（如ALP染色阳性细胞）的细胞，可在显微镜下无菌吸（刮）取细胞，以达到纯化目的[2]。
（四）选择性培养&&& 在培养基中加入非目的细胞的特异性抑制物，使得非目的细胞不能增殖并诱发其凋亡，从而使细胞达到纯化[3]。该方法常用在杂交瘤细胞或转基因细胞的选择性培养中。
（五）流式细胞技术&&& 将细胞荧光染色（对细胞无毒，仍可存活）后，在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50~100μm的小孔并排列成单行，每个细胞依次恒速通过激光束照射区，细胞受激光照射后发出散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量。如果受检测的细胞特性与预定的细胞特性相符，则该细胞被收入到特定的容器中，从而将细胞分离[4]。
（六）共聚焦激光扫描显微镜技术& &&利用共聚焦激光扫描显微镜，在不改变培养环境及细胞生长状态的情况下，利用高能激光自动杀灭非目的细胞，存留完整活细胞亚群继续培养，从而克隆粘附细胞。
二、离体细胞的培养
（一）培养液&&& 由基本培养基及补充物所组成，对来源于体液的细胞如外周血淋巴细胞而言，选用RPMI1640培养液较好。对贴壁培养的细胞，可选用DMEM、MEM、F12、McCoy’S 5A, F10或DMEM/F12混合物。其中F12、F10较常用于成纤维细胞的培养，DMEM、MEM、McCoy’S 5A较常用于上皮细胞的培养。同一类型的基本培养基其组成成份不同，有高糖型、低糖型，有些含有酚红。对于高糖需要型细胞如胰岛培养，则选用高糖型培养液。而研究类固醇激素对细胞的影响时，应选用无酚红的培养液以排除酚红的类固醇激素样作用。补充物有动物血清、生长因子和激素等，部分生长因子与激素是醇溶性的，此时要注意培养液中的乙醇浓度不要超过0.1%（V/V），各种生长因子和激素的配制与使用方法如表1-14-1。
表1-14-1& 生长因子及激素的配制和使用
贮存温度(℃)
L-抗坏血酸
25μg/ml~100μg/ml
上皮生长因子（EGF）
成纤维细胞生长因子
氢化可的松
10-7-10-8M
动物血清常用5%~15%小牛血清或胎牛血清（FBS），必要时可用活性炭将血清中的各种生长因子、激素及免疫球蛋白等吸附去除（炭吸附血清，CS-FBS），以满足细胞培养中的特殊需要[5]。我们用0.1%BSA（牛血清白蛋白）代替CS-FBS用于肿瘤细胞的培养，效果良好[6]。同时Sigma公司有去除不同细胞因子和激素的血清替代物出售（serum replacement），它们亦能满足特殊培养中的部分需要。
（二）培养介质&&& 除血液、脾脏、胸腺等来源的细胞外，哺乳动物细胞的培养一般采用贴壁培养。将分离后的细胞加入适量培养液（占培养空间的5%~20%，V/V），置于37℃、5%CO2、95%空气及保和湿度下培养，而昆虫细胞如Sf9细胞则不能耐受37℃的高温[7]，最适培养温度为27℃。原代贴壁培养的细胞在培养的前2~3天保持不动，以保证细胞有充足的贴壁时间，过早搬动则会导致细胞不能贴壁而使培养失败；继代培养的细胞贴壁相对较快，肿瘤细胞更快，在接种的24小时内基本上已能贴壁。有些组织来源的细胞在玻璃或常规聚合材料制成的培养瓶中较难贴壁，须在瓶壁上附一层基质如鼠尾胶原等[8，9]，这样更能保证培养细胞的功能接近于体内。
三、细胞的传代
当细胞培养达到85%~95%汇合时，即可进行传代培养，用胰酶或EDTA将细胞进行消化（有些贴壁不紧的肿瘤细胞如HEK-293细胞等只需轻轻吹打而不需消化就能将细胞分散[10]），使细胞回缩呈透亮的圆形，加入冷的Hank液终止消化，离心收集细胞，按1:2至1:4将细胞分成等份继代培养。
四、培养细胞的检测
各种细胞既具有相同的特性，又有其独有的特性。本节所介绍的是各种细胞共有特性的检测。
（一）细胞形态学观察&&& 生长状态良好的细胞，镜下可见细胞透亮、轮廓欠清，胞内无异常颗粒，原代正常组织细胞常呈规律排列，而肿瘤细胞排列比较杂乱。细胞功能不良时，透光性下降，轮廓增强，胞内常出现不透明的异常颗粒及空泡、脂滴等，细胞被微生物污染时，培养基变浑浊或瓶内出现异常生长物，细胞形态发生改变，生长缓慢甚至脱落，镜下亦可见有异常活动的微生物出现。同时还可将培养液取出少许涂片，乙醇固定，Giemosa染色后油镜下观察微生物形态。如怀疑有衣原体或支原体污染，可用低张处理的嗜伊红染色观察。
（二）细胞增殖计数&&& 将消化后的细胞接种24孔板，分7组，每组3孔，培养一周。每天取出一组细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，用计数盘或细胞自动计数器计数，取3孔的平均值直至第7组结束，用座标图纸绘制成生长曲线，如图1-14-1。
（三）有丝分裂指数（mitotic index: MI）&&& 是指被测细胞群每1000个细胞中的分裂细胞数（分裂细胞/1000），用以表示细胞增殖旺盛程度[11]。因此在检测中需观察和记录群体中1000个细胞中的细胞分裂相数，即细胞分裂指数=×100。具体方法是在培养瓶中加无菌洗净的盖玻片，每日从瓶中抽出盖玻片进行固定、染色（对于悬浮培养的细胞，则取一滴细胞悬液滴片后固定），制成永久性标本。镜下观察分裂相并计数。取得逐日分裂相计数后，可绘成细胞分裂指数曲线，如图1-14-1。
（四）流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成&&& 当细胞培养至80%左右汇合时，胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，在流式细胞仪上测出细胞所处的周期相（G1、G2、S、M期）和DNA合成的周峰期，同时可测RNA含量[4]。
（五）细胞内总蛋白含量测定& &&将细胞用Triton X100-Tris缓冲液裂解，离心后取上清，用Bradford方法测上清液中蛋白质浓度，测定时用牛血清白蛋白作为标准，标准液与待测样品均用考马斯亮兰G-250染色，在紫外分光光度计590nm波长处测出它们的吸光度。根据不同蛋白浓度的标准液所对应的吸光值，分光光度计可自动得出所测样品的蛋白质浓度。
五、细胞株的建立
原代培养的正常细胞特别是内分泌细胞，其增殖的能力有限甚至有的根本不能传代。因而必须将它们变成永生性细胞，以利于进一步的研究，但同时要设法保留原有细胞的大部分功能特性。常用的方法为人工诱变，即用射线、温度、药物、病毒和化学致突物诱导细胞突变[11]。其中以病毒和化学致突物常用（所用病毒一般为基因缺陷型病毒，它们丧失了在体外感染人和动物的能力；化学致突物常为强烈致癌剂，使用时一定要加强防护），如用EB病毒可转化正常人外周血淋巴细胞，腺病毒可转化肾小管上皮细胞。
大部分细胞株的建立是直接取肿瘤组织进行分离培养，肿瘤细胞虽然为低分化细胞，但同时也具有部分分化细胞的特性，因而在研究分化细胞的某一方面的特性时，常可用某一类似的细胞株来代替，目前在内分泌方面常用的细胞株如表1-14-2。
表1-14-2& 内分泌常用细胞系
成骨肉瘤细胞系
14岁女性成骨
多倍体细胞株,能产生大量
& 胶原,能分泌ALP,具有
& 体外矿化能力
成骨肉瘤细胞系
能分泌大量ALP、合成胶
& 原能力不及MG-63
成骨肉瘤细胞系
成骨样细胞系
小鼠颅骨转化
前成骨样细胞系
骨髓基质细胞系
可分泌Ⅰ，Ⅲ型胶原，可
& 体外培养成骨
胰岛B细胞系
能对生理状态下的葡萄糖
& 刺激产生反应，并分泌
胰岛素分泌细胞株
持久性高胰岛
& 素血症的病
缺乏机能敏感性的钾通
& 道，胰岛素基因调节转
& 录因子PDXI& 缺乏
胰腺B细胞系
胰腺B细胞系
甲状腺乳头状癌细胞系
人低分化甲状
& 腺乳头状癌
甲状腺髓样癌细胞系
甲状腺滤泡状癌细胞株
甲状腺癌细胞系
未分化甲状腺
& 乳头状癌
卵巢细胞系
睾丸细胞系
肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系
卵巢癌细胞系
卵巢癌细胞系
乳腺癌细胞系
破骨前体细胞系
在适当诱导下可分化成成
& 熟破骨细胞
六、细胞冻存和复苏
某一培养物建成后，如暂不使用，可冷冻保存。细胞消化后，离心收集，用冻存液[完全培养基加5%~10%的二甲基亚砜（DMSO）]重悬细胞，使细胞数为4×106个/ml，以1ml/管装入冻存管，经程序性降温后最终放入液氮中长期保存。如果无程序降温仪，可将细胞在4℃放2小时，然后转入－70℃放12~24小时，最后快速转入液氮中保存。当要使用该细胞时则可从液氮中取出细胞，放入39℃温水中快速解冻，解冻时间不要超过1分钟。见细胞完全解冻后，便从温水中取出，尽快用缓冲液离心洗去DMSO，重新加培养液培养。
【内分泌细胞培养的应用】
一、细胞培养药物测试
新药在应用于临床之前，需进行药效检测。细胞培养能使药物与靶细胞直接接触，如防治糖尿病药物直接与胰岛接触，抗骨质疏松药物直接与成骨细胞或破骨细胞接触。有时甚至可以将药物显微注入细胞内，能使细胞较快的发生反应，避免了动物试验中药物引起靶腺反应周期长等缺点，且细胞发生的各种改变可通过多种方法检测。药物细胞测试时，被检测的药物最好为水溶性，这样便可用基本培养液作为对照。如果药物为非水溶性，应安排一组溶剂对照以排除溶剂对细胞的影响。同时必须考虑到溶剂的浓度不宜过高，否则会因为对细胞的影响太大而掩盖药物的作用。
（一）药物浓度分组&&& 体外培养的细胞所处的微环境有别于体内，对药物的耐受性也可能不同，一般选用体内生理浓度的近似值，同时向上向下拉开2~3个浓度梯度，如某一药物体内的生理浓度为10-8M，则应选用10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等进行处理，如为复方制剂或无体内生理浓度参考值，则应测出药物对该细胞的半效应量（media infective dose, ID50）[11]。方法是将药物分成不同的浓度梯度，用这些浓度的药物干预细胞，台盼蓝染色观察细胞死亡一半时的浓度，即为半效应量。然后在该浓度上下寻找精确的最佳浓度，药物试验一般每组需设3个以上平行孔/瓶，特别是要对细胞进行免疫检测和放射性分析时，平行孔/瓶最好达到5个以上。
（二）给药时间 &&&可于接种前和生长中给药，以生长中给药常用。根据不同的检测目的，生长中给药的时间不同，如测药物对细胞增殖的影响，可在增殖高峰期前2~3小时给药；检测药物对某一代谢分泌产物的影响时，可在接近该分泌产物达最高前给药，药物处理时间一般不得少于8小时，最长可与细胞培养时间同步。
（三）给药后检测 &&&给药后检测的方法较多，包括细胞增殖、信息的传递、基因的表达、酶或蛋白质的分泌等。要注意的是在检测酶或蛋白质的分泌时，要注意保持其活性，大部分操作最好在低温下进行。
二、细胞工程产品
因体外培养的细胞与机体细胞一样，能分泌出各种酶和蛋白质，因而细胞培养日益成为生物工程药物（如各种抗体）和基因工程药物的生产手段。将外源性的目的基因导入细胞，连接合适的启动子，细胞在一定的诱导条件下便能表达目的基因的产物，且在真核生物细胞中表达的产物，其活性普遍比原核生物中的要高。
三、细胞移植
因器官移植具有强烈的免疫排斥反应，因而细胞移植得到广泛的发展，而且目前的大多数基因治疗均是以细胞作为载体，将目的基因导入细胞，植入机体，导入的基因便可代替缺陷的基因发挥正常作用，有些细胞如杀伤细胞（TIL细胞）、Lark细胞等本身对癌细胞有杀伤作用[12]，将这些细胞植入机体后，便能杀死癌细胞，从而起到治疗作用。
四、胰岛细胞培养及应用
（一）胰岛的分离&&& 胰岛分离的胰腺标本一般来源于人、猪、鼠。胰腺组织最好即取即分，如暂不能分离，可将组织放4℃保存，一般来说，保存时间不宜超过18小时。
1．机械分离法&&&
胰腺经4℃肝素生理盐水清洗后切取，清除被膜、血管后，将其剪成2~3mm3大小的碎块，用XB-II型细胞悬液制备器（上海放射医学研究所制）研磨[13]，使胰岛组织变成细胞悬液。如无细胞悬液制备器，也可在玻璃匀浆器中研磨，经400目不锈钢筛网过滤后即得初胰岛。该分离方法简单，但由于过多机械操作，对细胞损伤较大。
2．胰酶消化法&&
上述胰腺剪碎后，不用匀浆或细胞悬液制备器研磨，而是加入胶原酶溶液。在37℃恒温水浴箱中振摇消化5~6分钟，将消化不完全的组织吸出，再置入稀释1倍的胶原酶溶液中消化，每次3分钟，连续4~5次，至消化完全[14]。该方法较机械分离法有所改进，但仍不能排除机械损伤。
3．导管内胶原酶灌注法&&& 该方法常用于从活体动物胰腺分离胰岛，先从低位总胆管插入一根导管，并在开口处结扎（鼠可用2号套管结扎，人胰腺可用18号套管结扎），以防止胶原酶漏入十二指肠，然后分别结扎左右肝管。处死动物后，用不同浓度的胰酶（可用I型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅹ型、Ⅺ型，胶原酶P等，1~6mg/ml）通过导管注入胰腺使其均匀扩大，然后切除胰腺，并置于冰冷容器中，加入Hank’s溶液，在37℃温育消化后，放入冷（4℃）的Hank’s溶液中。吸取液体轻轻冲洗胰腺组织，使其进一步分散成悬浮液，以50×g离心10秒钟，弃上清，反复冲洗离心两次后，通过筛网过滤，便可得到各种分散的细胞悬液[15]。该方法可避免机械操作对胰岛的损伤，分离出的胰岛存活率较高，是较普遍采用的一种分离方法。
4．全自动分离胰岛法&&& 导管内胶原酶分离胰岛虽然省去机械操作对胰岛的影响，但由于各部分胰岛从胰腺分离出来的速度不一，先分离出的胰岛不能及时从胶原酶溶液中移走，任何一种胶原酶对细胞均有毒性，且其毒性随作用时间的延长而增大，分离出的胰岛因在胶原酶溶液中消化时间过长而使其功能受到抑制。Ricord等改进了前述方法，设计出一种自动分离胰岛的方法[16]。按前述方法从导管内注入胶原酶后（胶原酶的体积大致相当于胰腺重量的2倍），将胰腺放入全自动分离器的小分离室中（如图1-14-2）。分离室由上下两个不锈钢室组成，其间用280μm孔径的不锈钢筛网隔开，分离室的总容积为300ml，下面的不锈钢室呈圆柱状，包含有两个输入口，侧壁上连一个温度探测器。该两个入口接上一个热循环器（由蛇形管放入温水中组成），热循环器与蠕动泵相连，蠕动泵的另一端接有一个循环柱，循环柱上方置有一个94μm孔径的过滤网和一个双向开关并与一装有Hank溶液的容器相连，分离上室的出口接有冷循环器（蛇形管放入冰水中组成），蛇形管的另一端通过双向开关与循环柱和收集瓶相连。下室放7个1cm直径的玻璃球，上室成圆锥形，有一个输出端口，上下室用螺丝固定，整个分离室与一个摇柄相连。当胰腺放入分离室后，在下室内加入胶原酶溶液，密闭上下室，启动摇柄，胰腺在室内振摇消化。同时Hank溶液经过滤网达到循环柱上层，然后再经过蠕动泵（40ml/分）及热循环器而达到37℃，进入下分离室，稀释下分离室中的胶原酶，并使下分离室达到37℃，消化后的液体（其中含胰岛）通过280μm孔径的&&&& 筛网进入冷循环，使得胶原酶灭活后，再流入循环柱的底层。循环柱和冷循环器均放置冰水中，从而保护胰岛，而冷的剩余消化液又可通过循环柱顶层的过滤器进入分离室中继续消化，胰岛则留在了分离柱的底层，这样整个系统就变成了一个开放的分离系统。当样品中检测到有游离出的胰岛时，关闭循环柱和热循环器，缓慢注入新的Hank’s液稀释胶原酶并降低温度继续消化，直到新的分离液中再也检测不到胰岛时止，整个分离过程只需30~60分钟，分离出的胰岛悬液贮存在新的培养瓶中。
该方法分离出的胰岛活性高，功能好，整个胰岛细胞团的结构保持较完整。因而较常用该方法分离胰岛进行异体移植。以后，该方法又不断得到完善，如扩大密闭室的容积，改善胶原酶的质量[18]。许多种胶原酶（collagenase）如I型、Ⅳ型、Ⅱ型、Ⅹ型、Ⅺ型、P型使得胰岛分离的效果越来越好。另一种新的多酶混合物——liberase[18]，又使得分离胰岛的质量大大提高，但因其价格极其昂贵，尚未广泛应用。
（二）胰岛纯化
1．转皿与碘乙酸抑制&&& 分离出的胰岛悬浮液经筛网（400~500目）过滤后尚含有大量的外分泌细胞、导管上皮细胞、成纤维细胞等，因导管上皮细胞及成纤维细胞贴壁速度较胰岛快，可把接种后的胰岛细胞培养12小时后转皿。此时胰岛细胞尚未贴壁，而导管上皮细胞及成纤维细胞已大部分贴壁，转皿后可除去部分导管上皮细胞及成纤维细胞，然后加入碘乙酸处理3~5小时，碘乙酸能抑制成纤维细胞生长，而对胰岛的影响较小（注意：碘乙酸对皮肤有强烈的腐蚀性，使用时要注意勿粘到皮肤），经该方法处理后的胰岛纯度不高，因而较少采用。
2．密度梯度离心&&&
根据胰岛B-细胞与其他细胞的比重不同而分离胰岛。用葡聚糖或商用菲可400（Ficoll-400）组成不同的密度梯度。如可用27%、23%、11%浓度的葡聚糖分层装入管中，其中置细胞悬液，经离心后可在11%与23%的浓度界面收集胰岛[19]；也可在一个200ml的离心筒中，先放入100ml密度为1.074g/cm3的Ficoll梯度分离液，然后另取40ml的Ficoll分离液与10ml的细胞悬液混合，使其密度为1.058g/cm3，轻置于1.074 g /cm3的梯度离心液上，以800×g在4℃下离心16分钟，选取第2层（约50~80ml）收集细胞[16]；或将细胞离心沉淀后用25%的Ficoll溶液重悬，置于离心管的底层，其上依次加入23%、20%和11%的Ficoll溶液，在4℃以750×g离心10分钟，在上面两层分界面收集胰岛[15]。
3．经密度梯度离心后分离的胰岛已具有较高的纯度，如需进一步纯化可用双硫腙（dithizone, DTZ）对胰岛细胞进行染色[20]。DTZ为螯合指示剂，可与铅、铜、锌等螯合，人和动物（豚鼠除外）的胰岛B细胞因含锌，DTZ染色呈猩红色，而其他胰腺细胞及非胰岛细胞不着色，故DTZ对胰岛呈特异性染色，而且经DTZ染色后的胰岛仍可培养，功能不发生改变。DTZ可用酒精或二甲基亚砜（DMSO）配制，配制方法为：DTZ 10mg溶于3ml无水乙醇（含50μl浓NH4OH），加Hank液12ml。此为储存液，临用时用Hank液（pH7.8）1:1000稀释，0.22μm滤过膜过滤后与胰岛制备物混合，室温放置10分钟。或将10mg DTZ溶于10ml DMSO，用Hank’s液（pH7.8）1:1000稀释，过滤后与胰岛制备物混合，室温放置10分钟，在相差显微镜下观察，胰岛细胞呈红色。用特制的吸管或注射器针头在显微镜下吸取胰岛，经吸取后的胰岛已具有足够的纯度。
4．使用荧光分类器或流式细胞仪分离&&& 将细胞进行荧光染色在荧光分类器下分离胰岛[21]，或预先确定胰岛的大小，用流式细胞仪分离胰岛。该两种方法因需昂贵的仪器，因而使用尚未普及。
（三）胰岛的鉴定
1．活性测定&&&
主要包括：①台盼蓝或DTZ染色：台盼蓝能穿透死细胞的细胞壁，将死活细胞区分开来，在显微镜下计数能得出分离胰岛的存活率。另外，因DTZ对胰岛染色的特异性，用上述DTZ染色方法能较快的鉴定胰岛。②活细胞荧光染色：利用吖啶橙（AO）-碘丙啶（PI）双色荧光染色鉴别死亡的细胞与活细胞[22]，AO为浸润性染料，可侵入活细胞而发出绿色荧光；PI为排斥性染料，不能进入活细胞，与死亡的或正在死亡的细胞核酸结合，发出红色荧光，其区分死活细胞的灵敏度比台盼蓝染色高。
2．胰岛细胞鉴定&&&
除用上述DTZ染色的简单染色方法外，还可用荧光标记胰岛素抗体对胰岛细胞进行免疫荧光染色鉴定。
3．胰岛功能检测
（1）胰岛素释放试验&&& 在光学显微镜的目镜上装一个标准光栅测出胰岛的直径，按表1-14-3所列方法将胰岛换算成150μm直径的当量胰岛数目（equivalent islet numbers, EIQ）[23]，接种相同当量数的胰岛，每天取上清测胰岛素的含量，7天后作胰岛素释放试验。
（2）胰岛葡萄糖灌注试验&&& 将50~100个胰岛置于含滤膜的微型滤器中进行真空抽滤灌注[24]，第一与第三小时用葡萄糖液和Krebs液灌注各1小时，于最末20分钟收集灌注液，第二小时用葡萄糖加茶碱灌注，于不同时间收集灌注液检测胰岛素含量，绘制胰岛素分泌动态图，按下述公式计算刺激指数（SI）：SI=第二小时前20分钟分泌胰岛素含量+后20分钟分泌胰岛素含量/第一小时末20分钟分泌胰岛素量+第三小时末20分钟分泌胰岛含量[19]。
表1-14-3& 不同直径级的胰岛转化150μm直径胰岛当量数的方法
胰岛的直径
转化150μm直径当量级的数量
（3）体外检测胰岛功能&&& 将分离的胰岛移植到STZ诱导的糖尿病的裸鼠体内，视其是否能逆转小鼠的糖尿病。
（四）胰岛细胞的培养&&& 胰岛分离后，经离心洗涤，常选用RPMI1640培养基培养，对于人类胰岛也可选用DMEM或F12培养，培养基中含动物血清及抗生素、葡萄糖等。如能用人类胎儿的脐带血清培养，则培养的胰岛生长更快。
（五）胰岛细胞株&&& 由于胰岛的分离技术难度较大和费用昂贵，研究者们转向建立具有B细胞特性的细胞系。早期的细胞系来源于噬齿类动物，通过放射线照射或病毒感染产生胰岛瘤而获得， 如INS-1胰岛素瘤细胞株，其特性接近正常的胰岛B细胞，胞内含有较多的胰岛素分泌颗粒，且在细胞外液加入生理浓度的葡萄糖能引起与正常胰岛细胞相似的胰岛素释放。随着转基因技术的发展，近年来多从转基因动物的胰岛细胞瘤中分离细胞株[25]，但目前尚没有完全代替胰岛B细胞功能的细胞株建成。
（六）细胞移植治疗1型糖尿病
1．胰岛移植治疗&&& 传统的胰岛素替代治疗虽然能较好地控制1型糖尿病病人的血糖，但不能有效地防止糖尿病并发症，而且长期的胰岛素注射治疗的费用也相对昂贵；整个胰腺的异体移植又因强烈的免疫排斥反应而难以在体内发挥正常功能。因而用纯化的胰岛移植治疗1型糖尿病日益受到重视并取得迅速发展。胰岛移植成败的关键有两点：一是移植后的胰岛能否在体内发挥正常的功能。分离操作本身常对胰岛造成较大的损害，致使胰岛功能下降，胰岛分离纯化的好坏直接影响到移植的成败。成功分离胰岛的标准，应该是以最快的速度分离出体积大，数量多，纯度较高，功能完整的胰岛。胰岛的表面覆盖有糖蛋白和蛋白多糖，胰岛B细胞之间也存在微血管和间隙连接，环绕胰岛表面有一层基膜，这些微细结构的良好保存能增加植入胰岛的存活率和生存时间[26]。一般来说，显微镜下观察测得直径小于50μm的胰岛不宜用于移植。胰岛分离后，在体外培养的时间不宜过长，否则，胰岛在体外培养过程中失去了包括细胞外基质（ECM）在内所组成的微环境，其功能会逐渐丧失[27]，例如，属于整合素家族成员之一的α6β1整合素就能提高胰岛细胞对血糖的敏感性，如其遭到破坏，势必影响胰岛功能。为了弥补基质损伤的影响，有学者人为给分离的胰岛细胞构造一个细胞外基质系统，首先是将细胞培养在明胶、胶原上，但效果不理想。而培养在胎牛角膜内皮细胞基质上的胰岛，基础胰岛素含量和刺激释放量均明显增加。Bosco等从培养的鼠膀胱癌804G细胞培养上清中抽提细胞基质和层粘连蛋白后[21]，制成细胞外基质，供胰岛培养，胰岛能在3个小时内变平贴壁，并向周围生长，比在普通培养瓶（48小时尚不能贴壁好）上快得多。因而发掘合适的细胞外基质供胰岛培养将得到更深入的研究。每次胰岛移植的数目也是影响移植后功能发挥的重要因素，因每个胰腺分离出的胰岛数目有限，一次完整的移植需要多个胰腺分离出的胰岛总和。如果胰岛分离后放置过久又会使功能逐渐丧失，常规的方法又难以保存胰岛。最近Charles等建立一种冷冻保存胰岛的方法，可使胰岛在低温下保存1周到1个月，而胰岛功能保持完整[28]。
胰岛移植成败的第二个关键是胰岛在体内存活时间的长短。因人的胰腺组织来源有限，用猪等大动物及大鼠的胰岛进行异种移植是必要的，与整体胰腺移植一样，异种胰岛移植仍然存在极大的免疫排斥反应，体内使用免疫抑制剂效果甚微。如果将胰岛装入一种特制的微囊，则可延长移植物的存活时间[29]。该微囊是一种半透膜，做为移植物和宿主之间的免疫屏障，它除了能排除免疫细胞及体液中的排斥物外，还能将细胞的有毒代谢产物排出，允许营养物质进入细胞和葡萄糖及胰岛素的自由扩散。这些半透膜一般用藻酸盐制成[25]，国内也有学者用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠包裹胰岛进行移植[30]，在不使用免疫抑制剂的情况下能显著的延长胰岛的存活时间。将胰岛与免疫抑制细胞共同移植，也可以降低移植物与宿主之间的免疫排斥。如胰岛移植后，再注射一种含有免疫调节分子基因CTLA4-Ig的树突细胞，它与同种异型T细胞结合后，体内延长同种异体移植的生存率[31]。另外用一些免疫因子如IL-10预先处理移植的胰岛，也可能为去除免疫排斥提供新的方法[32]。
2．非胰岛细胞移植治疗糖尿病&&& 由于胰岛的来源有限，人们设想用能发挥胰岛功能的非胰岛细胞移植治疗糖尿病。基因工程的快速发展使得这一设想成为可能，诱导胚胎干细胞发育成胰岛素分泌细胞[33]，或在一些常用的细胞株内导入胰岛素基因及相关调节基因，使得细胞既能较快增殖，又能分泌胰岛素，而且能对生理刺激如葡萄糖的刺激产生反应等[34]。由于这些细胞不受组织特异性的限制，可直接来自于患者自身的其他非胰岛组织，因而有可能较好的解决排斥反应。但是，糖尿病是一种多基因病，包括胰岛移植在内的细胞移植，目前均很难完全代替正常胰岛的功能。胰岛移植会造成体内某些基因失活，基因导入的非胰岛细胞也很难代替体内胰岛的一切功能，胰岛及相关细胞移植治疗糖尿病尚有待广泛而深入的研究。
3．胰岛移植的部位&&& 胰岛移植后的功能及寿命受移植部位的影响，移植部位常选在免疫弱反应区，即所谓的“免疫特惠部位”，如肝、肾包膜下，腹腔内、胸腺、门静脉、侧脑室等[35，36]。侧脑室移植胰岛的生存率较高，存活时间较长，其次为胸腺，但这些部位移植较难，因而以腹腔内注射及肾包膜下移植较常用。另外胰岛移植尚有逆转糖尿病并发症的可能。如高血糖症可引起甲状腺激素分泌低下，甲状腺细胞变形，胶质内甲状腺球蛋白含量减少，而胰岛移植后，可使这些改变逆转[37]。
五、成骨细胞的培养及应用
（一）骨髓诱导培养法&&& 无论是成骨细胞还是破骨细胞，都是由骨髓细胞分化而来，因而可利用骨髓细胞，加入诱导剂并在合适的基质上培养，使其向成骨细胞显型转化，从而培养出成骨细胞。这种方法培养出的细胞具有成骨细胞的大部分表型。
（二）胎儿成骨细胞培养&&& 分化的成骨细胞一般位于骨组织中，有坚固的骨组织作为保护屏障，需要相对较长时间才能分离出。胎儿时期，由于骨组织尚未发育完全，骨组织较软易操作，成破骨活动活跃，是分离成骨细胞及破骨细胞的理想时期。通常取胎儿的颅盖骨或四肢长骨，剔除筋膜及血液、骨髓等，将组织块剪碎，冲洗后即可放入培养皿置培养箱中贴壁培养，约1周后可见有细胞长出。由于胎儿骨组织较软而脆，也可直接用胶原酶消化骨组织，使细胞从骨组织中游离出来。消化常采用两步法。第一步消化游离出的细胞大多为成纤维细胞及破骨细胞；第二步消化时间长，游离出的大多为成骨细胞。选择第二步消化后的细胞悬液进行成骨细胞培养，成骨细胞为上皮样细胞，贴壁速度比成纤维细胞慢，可通过反复转皿来去除成纤维细胞。
（三）成人成骨细胞培养&&& 由于胎儿本身的发育不完全，其成骨细胞的功能还不完善，例如人胎成骨细胞表面就不表达上皮生长因子（EGF）受体。故成人的成骨细胞培养更适合骨质疏松的研究，一般取成人的髂骨、下颌骨、股骨颈等部位的松质骨进行培养[38]，本所采用消化后髂骨组织块培养法，所获得的成骨细胞纯度高，活性好。即取松质骨剪碎成2~5mm3大小，PBS猛烈振摇洗涤后，II型胶原酶消化至骨质完全变白呈蜂窝状，再将消化的骨组织贴壁培养，大约20天后细胞可满底。
（四）成骨细胞鉴定
1．形态观察&&&
在相差显微镜下观察，成骨细胞主要呈上皮样，胞核大而清晰，圆形或卵圆形，含1~2个核仁，并伸出多个突起与周围细胞相连。细胞满底后，原代培养的细胞有规律排列，可呈同心圆样向周围放射性生长。
2．ALP染色及活性测定&&& 成骨细胞来源于骨髓细胞，故含有丰富的ALP，用Gomori钙钴法对培养细胞染色，既可对培养细胞做出鉴定，又可得出培养细胞纯度。也可收集细胞，测细胞裂解液中ALP活性，根据ALP活性的高低鉴定细胞的纯度。
3．PAS染色反应：成骨细胞胞浆含丰富的基质前体成分，应用过碘酸-Shiff法细胞化学染色，呈红色阳性反应。
4．I型胶原染色&&& 成骨细胞能分泌大量的骨胶原，形成骨基质。在成骨细胞培养过程中，细胞聚集在一起形成结节，并在结节及周围分泌大量胶原。用von Gieson苦味酸酸性复红染色，可显示在结节周围产生的大量胶原呈红色（图1-14-3）。
5．1,25-(OH)2D3刺激的骨钙素测定：骨钙素由成骨细胞产生，成骨细胞膜上及细胞内均有维生素D受体，测1,25-(OH)2D3刺激后成骨细胞分泌骨钙素的变化，可特异性的鉴定成骨细胞。
（五）成骨细胞培养应用
1．抗骨质疏松药物的药效评价&&& 成骨细胞虽不位于内分泌腺体上，但可合成分泌20余种胶原与非胶原蛋白质和一些骨代谢局部调节因子，同时也受诸多激素的调节，在骨重建中生成骨基质并促进其矿化，形成新的骨质以修补破骨细胞骨吸收后留下的陷窝。导致骨质疏松的主要原因之一是成骨细胞形成新骨的能力下降，从而不能有效地修补破骨细胞骨吸收后留下的骨陷窝。在成骨细胞移植及基因治疗尚不成熟前，使用促进成骨细胞成骨的药物依然是治疗骨质疏松的主要方法。成骨细胞的体外培养，为筛选治疗骨质疏松药物及药效评价提供了一种简便而又直接的可靠方法。根据成骨细胞在骨质疏松中所起的作用，目前主要有如下指标可用于药效评价。
（1）增殖率测定&&& 成骨的强弱与成骨细胞的数目密切相关，采用3H-TDR掺入法、MTT法或考马斯亮蓝染色法均可测细胞增殖率，3H-TDR法经典但常有放射性污染；MTT法简便、快速、安全，但其误差较大。
（2）ALP活性测定&&& 成骨细胞含有丰富的碱性磷酸酶，是成纤维细胞的5~20倍。它一方面可水解有机磷酸释放出无机磷而用于羟磷灰石的形成。另一方面可分解钙盐沉着的抑制剂——焦磷酸盐而有利于成骨，成骨功能活跃时，其ALP含量增高。
（3）骨钙素测定&&& 骨钙素（osteocalcin, OC）是成骨细胞的特异性产物，为成骨细胞分化成熟的指标，反映成骨细胞的成骨功能[39]。可采用放射免疫法，RT-PCR或Northern杂交测定。体外培养的胎儿/鼠细胞及细胞株分泌骨钙素较少，用骨钙素放射免疫法难以测出，因而在药物干预前可用1,25-(OH)2D3对细胞进行预处理。放射免疫法能定量测出骨钙素分泌，因而是较常用的一种方法；RT-PCR产物电泳后通过凝胶图像分析系统测出每条带的光密度，也能比较出骨钙素的mRNA表达的差异，但进行PCR时一定要有内对照，如用β-actin引物与OC引物同管扩增[40]。Northern杂交也要用28S RNA等寡核苷酸探针再杂交而校正上样量的差异。
（4）基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的测定&&& 基质金属蛋白酶，尤其是MMP-1（I型胶原酶）、MMP-13等[41]，是降解骨基质的主要酶系，在骨质疏松的发生发展中起着重要作用[42]。它能在成骨细胞上表达，因而可作为药效评价的主要指标。可采用酶联免疫法，RT-PCR法及Western杂交法检测。
（5）护骨素（osteoprotegerin，OPG）&&& 可由成骨细胞表达，有学者认为它在调控破骨细胞的发生发展过程中起核心作用，其他的骨吸收调节因子可能部分或全部通过调节OPG的生成而发挥作用[43]。雌激素、1,25-(OH)2D3、BMP-2及许多与骨代谢相关因子如IL-6、IL-1、BGP、ALP、TNF等均可使其基因表达发生改变[44，45]。可用RT-PCR及Northern或Western杂交测定。
（6）、矿化结节计数：经β磷酸甘油诱导，成骨细胞在培养过程中可形成矿化结节，经von Kossa染色后，矿化结节呈棕黑色。在40倍光镜下结节计数，以＞200μm为标准。矿化结节形成代表了成骨细胞分化成熟、行使成骨功能的阶段，是成骨功能的形态表现。
2．组织工程材料的筛选&&& 成骨细胞培养可用于评价用生物材料制成的人工关节或其他植入骨的安全性[46]。在该生物材料上培养成骨细胞，观察细胞是否粘附良好，各项功能指标是否正常。另外，成骨细胞培养用于诊断和治疗（成骨细胞移植），已进入动物试验和临床，这些应用目前虽然有限，但相信其会得到长足发展。
六、破骨细胞培养及其应用
成年动物破骨细胞位于骨陷窝内，而且数量少，难以分离，目前所用的破骨细胞一般取材于24小时内出生的鼠或出生不满10天的猪或兔，也可用胎儿的长骨。成年动物的破骨细胞培养一般采用管状骨，如下蛋母鸡的长骨。近年来又发展了由骨髓或骨髓瘤细胞株、脾细胞诱导破骨细胞形成技术，培养出来的破骨细胞只具有破骨细胞的部分功能。
取材后将长骨纵形切开，用吸管轻轻吹打去除骨髓，手术刀轻轻地将内层骨质刮入培养液中，并用吸管吹打骨质碎粒，使细胞从骨粒中游离出来，静置30秒后转入37℃培养，30~60分钟后换液并洗去未贴壁细胞，镜下观察即可见有破骨细胞贴壁。因从每只胎鼠或其他小动物分离出的破骨细胞数目较少（1μm3组织中仅有2~3个），一次分离需要取材多只小动物。也可用胎鼠的颅盖骨做破骨细胞培养。切取薄层透明颅盖骨后，尽量除去筋膜和软骨，将其剪碎成1mm3大小的碎片，加入胶原酶消化；取第二个15分钟消化液培养。如用骨髓培养时，则需在骨髓中加诱导剂如维生素、CM-CSF（单核巨噬细胞集落刺激因子）等。骨髓可用注射器针头插入骨髓腔直接抽取。为了获得更高的转化率，可在骨髓培养中加入成骨细胞共同培养[47]。
成人的破骨细胞培养取材于髂骨等处的松质骨，将松质骨剪碎后，用胶原酶消化2~5分钟，并用吸管吹打，不锈钢网过滤并去除胶原酶后置于骨片上培养。
（一）破骨细胞的鉴定
1．形态学观察&&&
破骨细胞形态不一，刚分离出来时，大多呈不规则的圆形，贴壁后呈多角形、长条形、漏斗形、油煎蛋样，伸出多个伪足，体积大，直径约30~100μm。含有多核，清晰可见，与多核巨噬细胞难以区分。
2．TRAP及TrATPase染色反应&&& 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）为破骨细胞的特异性标志酶，应用偶氮偶联组化分析法，酶活性部位显示红色反应。以萘酚二磷酸盐为底物，偶氮副品红为显色剂，TRAP在酒石酸钾钠存在条件下将萘酚AS-BI磷酸盐水解为萘酚，AS-BI与显色剂结合在细胞胞浆内呈红色沉淀，而胞核依然清晰可见（图1-14-4）。TrATPase是破骨细胞酸性磷酸酶的同工酶，对破骨细胞也具有相对特异性[48]。细胞固定后，放入含有ATP二钠盐、硫酸镁、硝酸铅、酒石酸钾钠的Tris-马来酸缓冲液内孵育。染出来的细胞形态同TRAP染色，酶活性部位呈棕褐色颗粒样沉淀，分布于整个胞浆或胞浆的大部分，细胞核呈阴性。
3．降钙素受体测定&&& 与巨噬细胞不同，破骨细胞及其前体细胞含有丰富的降钙素受体，结合位点大于106/细胞，因而是反映破骨细胞分化的特异性指标。应用免疫细胞化学染色法经ABL试剂反应和显色反应，呈橙黄色反应，苏木精复染后核呈淡蓝色。
4．骨片吸收陷窝的观察&&& 将破骨细胞培养在薄的骨片上，骨片可来自猪或牛，其厚度为10~50μm，表面光滑且无菌处理。2~3天培养后，有活性的破骨细胞在骨片上形成明显的陷窝。扫描电镜观察，其基底留下粗糙不平的呈网状交织的胶原纤维，边界清晰，形态不规则。
5．标记基因的RNA分析&&& 碳酸酐酶II（CAII），组织蛋白酶K，基质金属蛋白酶9（MMP9）以及前面提到的降钙素受体，TRAP等均认为是破骨细胞的标记基因[49]，对细胞的RNA进行保护酶分析，可以鉴定其RNA是否表达有这些基因。
（二）破骨细胞培养应用&&& 破骨细胞培养主要用于骨质疏松抗骨吸收药物的药效评价。除促骨形成的骨质疏松防治药物外，另一类为抗骨吸收药物如雷诺昔芬（raloxifene），鲑鱼降钙素等[50]，它们进入临床前的抗骨吸收观察可通过破骨细胞培养来检测。用待检测药物对培养的破骨细胞或破骨前体细胞进行处理，然后观察以下指标的变化。
1．破骨前体细胞转化成成熟破骨细胞的能力&&& 因培养的骨髓细胞可转化为成熟的破骨细胞，某些药物加入后可抑制骨髓细胞转化成成熟破骨细胞，从而通过减少破骨细胞的数目来达到抗骨吸收的作用。通过镜下计数单位面积内的TRAP阳性细胞数，与无药物处理组对照，计算药物对破骨细胞生存的抑制率。
2．骨片吸收陷窝数&&& 骨片吸收陷窝数是反映破骨细胞功能的直接指标，药物促进或抑制破骨细胞的骨吸收，可通过光镜下或共聚焦激光扫描显微镜计数单位面积骨片上的骨陷窝数的多少来确定。要注意的是细胞接种时要保持相同数目的破骨细胞数，两组细胞的体积也要均衡。另外，因骨吸收后，大部分钙释放到培养液中，测培养液中总钙的变化，也可间接反映出骨吸收的能力。
3．破骨细胞凋亡率的分析& &&促进破骨细胞凋亡也是骨吸收抑制药物的作用机制之一，因而测定破骨细胞凋亡率可作为破骨细胞药效评价的指标。多种方法可检测细胞的凋亡，如电泳测细胞内DNA的梯形降解，共聚焦激光扫描显微镜检测细胞结构的改变，流式细胞技术，DNA末端标记，内切核酸酶活力测定，凋亡相关基因的改变等。
4．破骨细胞骨基质降解酶的测定& &&破骨细胞能分泌许多降解酶，如基质金属蛋白酶9（MMP-9）能降解明胶，层粘连蛋白[51，52]。可测定药物处理后MMP基因表达的变化而评价药物的抗骨吸收功能。
另外，破骨细胞培养也在人骨组织工程材料的筛选中起到重要作用。骨吸收与骨重建是一个互相偶联的过程，破骨细胞与成骨细胞是一个联系的整体，如成骨细胞分泌的护骨素（OPG）能抑制破骨细胞成熟与活性，成骨细胞与破骨细胞间还有可能存在一些偶联通道。目前大多数研究均是将成骨细胞与破骨细胞分开培养。这样不便于观察成破骨细胞之间的相互作用。如何使成骨细胞与破骨细胞在同一环境下共同生长良好，有待于更进一步的研究。
七、甲状腺细胞的培养
甲状腺细胞培养一般取材于甲状腺腺瘤切除时的正常甲状腺组织，仔细剥离周围血管及非甲状腺组织后，将其剪成1mm3大小的小块或切成300μm~1mm厚的薄片，无钙镁离子的溶液冲洗3~4次后，胶原酶消化，稍加离心以去除消化后的组织。观察环磷酸腺苷（cAMP）的产生、T3及甲状腺球蛋白的释放以鉴定培养的细胞。取患者的甲状腺细胞培养可以进行甲状腺刺激抗体的检测，从而有利于甲亢的诊断与鉴别诊断及指导治疗。
八、睾丸细胞培养
切除雄性动物的睾丸组织，剥离结缔组织及睾丸白膜，用眼科剪剪碎睾丸，胶原酶消化，不锈钢网过滤后即可培养。可用3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）特异性染色鉴定细胞。如将脑死亡的人睾丸分离制备睾丸细胞悬液，经短期培养后收集并移植到各种原因引起的低睾酮血症患者体内，能有效地治疗性功能减退和改善第二性征。另外因睾丸的Sertoli细胞天生具有FasL表达，它与胰岛共同移植后，可使植入的胰岛产生免疫豁免，从而延长胰岛的生存寿命[53，54]。
九、脂肪细胞培养
脂肪细胞与人的肥胖密切相关，脂肪细胞的增殖和分化失控会导致肥胖。成熟脂肪细胞失去增殖分化的潜力，因而培养的脂肪细胞一般来源于脂肪前体细胞。脂肪前体细胞在脂肪组织中终身存在，而且体外研究前脂肪细胞比研究脂肪细胞更普遍，因为前脂肪细胞培养有利于完整地认识脂肪组织的发生，增生和肥大的全过程，并且可以直接观察到各种因素对这个过程的调控，是研究脂肪细胞的理想模型。无菌取出脂肪组织，除去纤维组织及可见的血管，剪成碎片，用溶组织型胶原酶消化或直接贴壁于培养瓶培养，加入地塞米松或胰岛素诱导，则可见脂肪前体细胞转化成脂肪细胞的全过程。通过测定脂肪前体细胞分化过程的标志物——甘油磷酸脱氢酶（GPDH）动态变化，油红染色提取法测脂肪细胞内脂肪含量，观察其对地塞米松和胰岛素的反应等来鉴定细胞。利用脂肪细胞培养可直接观察各种减肥药物对脂肪细胞本身的分化、凋亡的影响，也可检测其对脂肪细胞自分泌和旁分泌激素如瘦素（leptin）的影响[55]。从而达到评价减肥药效的目的。另外，培养的脂肪细胞还可用于整形外科的脂肪细胞移植。
十、肾上腺皮质细胞、胸腺细胞和脾细胞的培养
这些细胞培养方法基本相同，无菌取出肾上腺、胸腺或脾脏后，去除其他组织，剪碎后匀浆或用注射器内蕊在筛网上研磨，经筛网过滤后的细胞浆即可用于培养。培养的细胞既可用于药效评价，探求相关疾病的发病机理，又可用于体内移植以补偿原组织的功能异常，但这些部位的免疫排斥反应通常较高，移植效果并不理想。
【参考文献】
1.Kenmochi T, Miyamoto M
,Vne S, et al. Improved quality and yield of islets isolated from human
pancreas using a two-step digestion method. &Pancreas(Abstract)& 2000;
20: 184-190.
2.Piemonti L, Bertuzzi F,
Nano R, et al. Effects of cryopreservation on in vitro and vivo long-term
function of human islet. Transplanation& -662.
3.Thonemann B, Schamalz G.
Immortalization of bovine dental papilla cells with simian virus 40 large
antigen. Arch Oral Biol& 7-869.
4.谢锦玉，等.& 现代细胞化学技术及其在中西医药中的应用. 北京：中国古籍出版社.
5.Iwasaki K, Underwood B,
Herman M, et al.Effects of antiprogestions on& the rate& of&
proliferation of& breast cancer cells.& Mol Cell Biochem& 1999;
198:141-149.
6.罗湘杭，廖二元，周后德, 等. 雌二醇对人成骨样细胞基质金属蛋白酶及其抑制因子的作用. 中华内科杂志& 2000;
4: 243-246.
7.Joshi L, Davis TR, Mattu
TS, et al. Influence of baculovirus-host cell interactions oncomplex N-linked
glycosylation of a recombinant human protein. Boitechnol Prog& 2000;
16:650-656.
8.Skopinskip, Jozwiak J ,
Lamprecht J, et al. Studies on conditions for the culture of rabbit corneal epithelium.
Klin Oczna(Abstract)& : 85-88.
9.Bucheler M, Scheffler B,
Von Foerster V, et al. Growth of human respiratory epithelium on collagen foil.
Laryngorhinootologie(Abstract)& -164.
10.Robbins AK, Horlick RA. Macrophage scavenger
receptor confers an adherent phenotype to cells in culture.
Biotechniques(Abstract) &0-244
11.鄂征. 组织培养和分子细胞学技术。北京，北京出版社1.
12.Moro D, Goy A, Nagy-Mignotte H, et al.
Immunotherapy of& cancer using cytokines. Use and perspectives in
lung oncology. Rev Mal Respir& 5-201.
13.万赤丹，陈实，陈刚等. 猪胰岛在糖尿病大鼠不同部位异种移植的实验研究. 中华器官移植杂志 1998;
4: 202-204.
14.王国栋，陈规划。胸腺内胰岛移植的实验研究. 中华器官移植杂志& 1999;
15.Sutton R, Peters M, Mcshane P, et al.
Isolation of rat pancreatic islets by injection of collagenase.
Transplantation& 9-691.
16.Ricord C, Lacy PE, Finke EH, et al.
Automated method for human pancreatic islets.Diabetes 3-420.
17.Ricord C, Socci C, Davall AM, et al.
Isolation of the elusive pig islet. Surgery& : 688-694.
18.Linetsky E, Bottino R, Lehmann R, et al.
Improved human islet isolation using a new enzyme blend liberase.
Diabetes& 20-1123.
19.董维平, 张洪德, 王煜非, 等. 胰岛移植物质量鉴定方法研究. 中华器官移植杂志& 1998;
4: 205-207.
20.Latif ZA, Noel J, Alejandro R, et al. A
simple method of staining fresh and cultured islets. Transplantation 7-830.
21.Bosco D, Meda P, Halban PA, et al.
Importance of cell-matrix interactions in rat islet β-cell secretion in vitro.& Diabetes &2000;
49: 233-243.
22.Merchant FA, Diller KR, Aggarwal SJ, et al.
Viability analysis of cryopreserved rat pancreatic islets using laser scanning
confocal microscopy.& Cryobiology& 6-252.
23.Bretzel RG, Alejandro R, Hering BJ, et al.
Clinical islet transplantation: guidelines for islet quality control.&
Trans Proc& 8-392.
24.Vandewalle B, Douillard C, Kerr Conte J, et
al. Human pancreatic islet quality control: easy assessment of metabolic
function.& Exp Clin Endocrinol Diabetes& : 214-219.
25.Efrat S. Genetically engineered pancreatic
beta-cell lines for cell therapy of diabetes.& Ann N Y Acad Sci&
26.Wolters GHJ, Vos-scheperkeuter GH, Lin HC,
et al. Different roles of class I and class II clostridium histolyticum
collagenase in rat pancreatic islet isolation.& Diabetes& 1995; 4:
27.Wang RN, Rosenberg L. Maintenance of
beta-cell function and survival following islet isolation requires
re-establishment of the islet-matrix relationship.& J Endocrinol&
; 181-190.
28.Charles K, Harlanos RC, Ching D, et al.
Storage and microencapsulation of islet for transplantation.& Cell
Transplant(Abstract)& -38.
29.Risbud M, Hardikar A, Bhonde R.
Chistosan-polyongl pyrrolidone hydrogels as candidate for islet
immunoisolation: in vitro biocompatibility evaluation.& Cell
Transplant& -31.
30.周茂华，陈东明，夏兆骥，等.& 微囊化大鼠胰岛素异种移植治疗小鼠实验性糖尿病的研究.&
中华器官移植杂志& -19.
31.O’Rourke RW, Kang SM, Lower JA, et al. A
dendritic cell line genetically modified to express CTLA4-Ig as a means to
prolong islet allograft survival.& Transplantation& 2000; 7:
32.Deol HS, Tuch BE. Effect of interleukin-10
on human anti-porcine xenogeneic cellular response in vitro.&
Transplantation& 2-119.
33.Soria B, Roche E, Berna G, et al.
Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in
streptozotocin-induced diabetic mice.& Diabetes& 7-162.
34.James PL, Stewart CE, Rotwein P.
Insulin-like growth factor binding protein-5 modulates muscle differentiation
through an insulin-like growth factor-dependent mechanism.& J Cell
Biol& : 683-693.
35.Beattie GM, Otonkoski T, Lopez AD, et al.
Functional β-cell mass after transplantation of human
fetal pancreatic cells.& differentiation of proliferation? Diabetes&
36.Karsten V, Tritschler S, Mandes K, et al.
Chemotaxis activation of peritoneal murine macrophages induced by the
transplantation of free and encapsulated pancreatic rat islets.& Cell
Transplant& -43.
37.李佐强，刘纯，何军，等.& 微囊包膜新生猪胰岛移植逆转糖尿病大鼠甲状腺形态学改变.&
中华器官移植杂志& -21.
38.Marie PJ, Lomri A, Sabbagh A, et al. Culture
and behavior of osteoblastic cells isolated from normal trabecular bone
surfaces.& In Vitro Cell Dev Biol(Abstract)& 3-380.
39.Beresford JN, Gallagher JA, Poser JW, et al.
Production of osteocalcin by human bone cells in vitro effects of 1,25-(OH)
2D3 ,24 25-(OH) 2D3, parathyroid
hormone, and glucocorticoids.& Metab Bone Dis and Rel Res (Abstract) 1984;
5: 229-234.
40.Carmeliet G, Nys G, Bouillon R. Microgravity
reduces the differentiation of human osteoblastic MG-63 cells.& J Bone
Miner Res& 6-794.
41.Tuckermann JP, Pittois K, Partridge NC, et
al. Collagenase-3 (MMP-13) and integral membrane protein 2a (Itm2a) are marker
genes of chondrogenic/osteoblastic cells in bone formation: sequential
temporal, and spatial expression of Itm2a, alkaline phosphatase, MMP-13, and
osteocalcin in the mouse.& J Bone Miner Res&& 2000;
42.Brechon JJ, Papaioannou S, Kon LW, et al. Stromelysin
(MMP-3) synthesis is up-regulation in estrogen-deficient mouse osteoblast in
vivo and in vitro.& J Bone Miner Res& 80-1890.
43.Brandstrom H, Jonsson KB, Ohlsson C, et al.
Regulation of osteoprotegerin mRNA levels by prostaglandin E2 in
human bone marrow stroma cell. &Biochem Biophys Res Commun &1998;
247: 338-341.
44.Nakashima T, Kobayashi Y, Yamasaki S, et al.
Protein expression and functional difference of membrance-bound and soluble
receptor activator of NF-kappaB ligand: modulation of the expression by
osteotropic factors and cytokines.& Biochem Biophys Res Commun :
45.Hofbauer LC, Dunstan CR, Spelsberg TC, et
al. Osteoprotegerin production by human osteoblast lineage cells is stimulated
by vitamin D, bone morphogenetic protein-2, and cytokines.& Biochem
Biophys Res Commun& : 776-781.
46.Torricelli P, Fini M, Giavaresi G, et al.
Isolation and characterization of osteoblast cultures from normal and
osteopenic sheep for biomaterials evaluation. J Biomed Mater Res& 2000;
52: 177-182.
47.Fan J, Yin W, Cao P. An experimental study
of the formation of osteoclast-like cell in rat bone marrow culture.& Chin
Med J& -58.
48.于明香，金慰芳，王洪复.& 体外培养破骨细胞的标志酶染色.& 中国骨质疏松杂志& -28.
49.Takeshita S, Kaji K, Kudo A. Identification
and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage
phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.& J Bone
Miner Res 77-1488.
50.Baylink DJ, Strong DD, Mohan S. The
diagnosis and treatment of osteoporosis: future prospects.& Mol Med
Today& 3-140.
51.Dew G, Murphy G, Stanton H, et al.
Localisation of matrix metalloproteinase and TIMP-2 in resorbing mouse bone.
Cell Tissue Res& : 385-394.
52.Clezardin P. Bone hyperresorption in bone
metastases.& Presse Med(Abstract)& 7-491.
53.Yang H, Wright JR. Co-encapsulation of
Sertoli enriched testicular cell fractions further prolongs fish-to-mouse islet
xenograft survival.& Transplantation& 5-820.
54.Korbutt GS, Suarez-Pinzon WL, Power RF, et
al. Testicular Sertoli cells exert both protective and destructive effects on
syngeneic islet grafts in nonobese diabetic mice.& Diabetologia&
55.Bornstein SR, Abu-Asab M, Glasow A, et al.
Immunohistochemical and ultrastructural localization of leptin and leptin
receptor in human white adipose tissue and differentiating human adipose cells
in primary culture.& Diabetes& 2-538.
（周后德）&&&
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