聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法_百度文库
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聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法
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高浓度琼脂糖凝胶电泳可不可以辨别30bp左右的碱基差距!自认为不可以,不过文献上有人酶切后用1.8%的琼脂糖凝胶电泳分辨出相差23bp的差异片段!是真是假?我现在就要做SSCP,片段差距24bp,由于
高浓度琼脂糖凝胶电泳可不可以辨别30bp左右的碱基差距!自认为不可以,不过文献上有人酶切后用1.8%的琼脂糖凝胶电泳分辨出相差23bp的差异片段!是真是假?我现在就要做SSCP,片段差距24bp,由于是大规模样品,请问能不能不用聚丙烯酰胺凝胶电泳做,直接通过琼脂糖凝胶电泳分辨出24bp的差异片段呢!请给出一个可行方案!谢谢···200bp和176bp ~还有一个122和99bp！能分么·多少浓度的琼脂糖凝胶··需要跑慢胶么？
你的片段在多大范围内?如果你的片段有十几K的话当然无法分辨.30个碱基的差异在1Kb范围内还是可以区分的.一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法
专利名称一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法
技术领域本发明涉及微生物菌群构成鉴定领域，尤其涉及一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法。
背景技术传统发酵酸面团，即馒头发酵剂，也称为老面、老酵头或面肥，是指上次做馒头留下来的发酵面团，以此作为主要发酵菌种，加入面粉和成面团，过夜发酵，次日在面团中添加面粉和适量碱，和面后成型，醒发蒸制馒头。传统发酵酸面团是多种微生物共生的微生态体系，是多种微生物糖化、发酵、酯化的协同作用，组织结构更趋于柔软细腻而富有弹性的口感，而且生成了醇、酯、醛、酚、酸、低分子糖、多肽、氨基酸等多种风味物质。国外面包的酸面团与我国传统发酵剂相似，但国外对于酸面团已经研究了很多年了，而我国传统发酵剂的研究，特别是微生物的研究却非常薄弱。国外对酸面团微生物的研究表明，其菌种组成与地理位置也有着很大的联系，一般是真菌，主要为酿酒酵母，起着发酵面团的作用，有些地方的酵子制作时要接种一定量的酒曲，酒曲中除了作为糖化发酵剂的霉菌外，还有丰富的酶系，酒曲具有糖化、发酵和酯化的能力，可以辅助酵母的发酵。根霉菌是霉菌中一种具有多酶系特征的霉菌，根霉能产生丰富的淀粉酶，使淀粉变为糖分，具有很好的糖化性能。它除了能分泌淀粉酶外，还能分泌酸性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等多种有机酸和乙醇等，可以在整个发酵过程中始终边糖化、边发酵连锁进行。有研究表明，在活性干酵母发酵馒头过程中，选择添加安琪甜酒曲来研究根霉菌对馒头感官品质的影响，发现使用酵母菌与根霉菌混合发酵的馒头评分最高，而酵母菌和乳酸菌混合发酵的馒头评分最低，可以看出我国传统酵子中根霉菌对馒头的品质具有一定的影响，这与西方酸面团的菌种有很大的差别。变性梯度凝胶电泳DGGE(DenaturingGradient Gel Electrophoresis)技术是由Fischer和Lerman在1979年提出并用 于检测DNA突变的电泳技术，是利用片段之间GC含量不同，在不同变性浓度梯度下解链程度不同而将不同片段分离开来。DGGE分辨度高于琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，理论上可以检测到单个核苷酸水平的差异，已被广泛的应用于分析环境微生物菌群结构、肠道及口腔中微生物菌群多样性的分析。目前，采用DGGE技术分析我国不同地区发酵酸面团中真菌菌相组成的报道并不是很多。国外面包的发酵剂即酸面团与我国馒头的老面有相似的制作原理和发酵工艺，但国外研究者已对酸面团中具有代表性的菌种及其特性研究的比较透彻，有些已应用于工业化生产，而我国有丰富的发酵剂资源，但对其认识尚处于初级阶段。因此，迫切需要揭示我国传统发酵酸面团中微生物的菌群结构及其种类，合理开发我国传统发酵食品中微生物资源。
本发明提供了一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法，用于分析发酵酸面团中真菌菌相组成和种类，具有快速简便、特异性好、灵敏度高、准确可靠的特点。—种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法，包括:(I)将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物；(2)从酶解物中提取真菌总基因组DNA ；(3)以提取的真菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的真菌通用弓丨物ITS5.8S与28S-1-GC进行第一轮PCR扩增；(4)以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用真菌通用引物ITS5.8S与28S-1进行第二轮PCR扩增；(5 )对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中真菌菌相组成。发酵酸面团可以为传统发酵酸面团， 即上次做馒头留下来的发酵面团。传统发酵酸面团中真菌种类多，先对其进行酶解后再进行PCR反应，可有效鉴定出真菌菌相组成。步骤(I)中，所述的酶解可以为:将发酵酸面团加入淀粉酶溶液中，混匀，进行酶解反应。所述的淀粉酶可以为α -淀粉酶。发酵酸面团中淀粉含量较高，在样品热处理时，淀粉易发生溶胀，包裹住发酵酸面团中的微生物，从而影响微生物总基因组DNA的提取，α -淀粉酶能有效酶解发酵酸面团中淀粉α -1, 4糖苷键，生成小分子糊精和其他低聚糖，增加面团的流动性，使酸面团中微生物充分释放于溶液中，以便有效提取全部微生物的总DNA。采用α-淀粉酶的特征是其能引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖。为了获得更好的酶解效果，所述的发酵酸面团与淀粉酶的重量比优选为0.5:1-1:1 ;更优选为 1:1。所述的酶解温度优选为60_65°C，时间优选为20_30min。该酶解条件下，淀粉酶对
发酵酸面团的水解程度合适。所述的酶解反应可以在水浴或金属浴中进行，优选在金属浴中进行。金属浴升温速度较快，保温效果好，有利于酶解反应的进行。步骤(2)中，可以采用真菌DNA试剂盒提取酸面团酶解物中的真菌总基因组DNA。真菌DNA试剂盒可以选用真菌DNA OMEGA试剂盒，提取效果较好。提取真菌总基因组DNA后，可以将DNA的浓度调整为45_55ng/uL，再进行第一轮PCR扩增；优选调整为50ng/uL。将DNA浓度调整为统一的固定值，这样可以比较菌种在不同样品内的菌量，通过DGGE指纹图谱中条带的明暗，可以半定量地分析存在于发酵酸面团中优势微生物的种类。步骤(3)中，第一轮PCR所用引物的正向引物5.8S的碱基序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物28S-1-GC为引物28S-1带上GC夹子(GC clamp)，引物28S-1的碱基序列如SEQ ID N0.2所示，GC夹子的碱基序列如SEQ ID N0.3所示。真菌通用引物5.8S与28S-1可以扩增真菌核糖体DNA可变区ITS区域，本发明选用的引物扩增片段约为350bp，可以同时鉴定酵母菌和霉菌；其中，反向引物带有GC夹子，GC夹子是指富含GC的一段DNA序列，一般为40-50个碱基对，含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，其解链温度比AT的双键要高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了 GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。所述的第一轮PCR为降落PCR (Touchdown PCR)。降落PCR是主要用于避免非特异性PCR产物的出现，确保第一个引物一模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即特异行扩增的反应物之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物在此时已经有一个几何数的起始优势，在剩余的反应中，特异产物会竞争非特异产物，特异产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。降落PCR的反应体系可以为:25μ I的反应体系组成如下:DNA模版2μ I,引物 5.8S 和 28S-1-GC 的两种引物各 0.5 μ 1，dNTPs2.5 μ 1，10Xbuffer2.5 μ 1，Ex Taq 酶
0.125 μ 1，蒸馏水 16.875 μ I。降落PCR的反应条件可以为:95°C预变性5min，然后在95°C变性30s，60°C引物复性Imin，72 °C引物延伸2min，循环20次，每循环一次，复性温度降低0.5 °C ;之后，95°C变性30s，50°C复性30s，72°C延伸2min，循环5次后72°C终延伸lOmin。由于存在于传统发酵酸面团中的真菌种类较多，为了达到每一种真菌的解链温度，采用该降落PCR反应条件，可以最大程度地获得各种真菌的PCR片段，便于DGGE分析。为了增加结果的准确性，可以在第一轮PCR扩增中分别设置阳性对照(已知真菌)和阴性对照(水)，以避免出现PCR的假阳性扩增。第一轮PCR扩增产物可以采用1.8-2%的琼脂糖凝胶电泳检验。步骤(4)中，为了使存在 于发酵酸面团中的微量真菌的DNA含量达到DGGE分析的检测限，因此，进行所述的第二轮PCR用来进一步增加真菌基因组DNA的含量。第二轮PCR所用引物为不带GC夹子的真菌通用引物ITS5.8S与28S-1。正向引物
5.8S的碱基序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物28S-1的碱基序列如SEQ ID N0.2所示。第二轮PCR的反应条件可以为:95°C预变性5min，然后在95°C变性30s，50°C引物复性30s，72°C引物延伸2min，循环4次，72°C终延伸IOmin0步骤(5)中，所述的分析可以包括如下步骤:合并第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物并纯化，然后进行变性梯度凝胶电泳分离，将得到的扩增条带进行染色、纯化、克隆测序，之后与标准菌序列比对，判定真菌种类。变性梯度凝胶电泳分辨率高，可以有效鉴定出发酵酸面团中真菌菌相组成。优选地，所述的变性梯度凝胶电泳的变性梯度为35%_65%，电泳电压为48-52V，电泳时间为12_13更优选地，电泳电压为50V，电泳时间为12h。通过试验发现，低压长时间电泳，可使不同DNA片段有效解链，达到更好的分离效果。所述的染色可以采用SYBR Green I染色。本发明采用α -淀粉酶酶解后的样品进行总基因组DNA提取，采用真菌通用引物ITS5.8S与28S-1进行两次PCR扩增，再进行DGGE凝胶电泳分离鉴定，从分子水平对传统发酵酸面团中真菌菌相组成进行了鉴定，同时能实现半定量分析，具有稳定、高效、成本低的特点，为开发我国传统发酵食品资源提供参考。
图1为本发明的技术流程图。图2为五个不同地区发酵酸面团中真菌PCR-DGGE指纹图谱。
具体实施例方式本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂盒厂商所建议的条件。实施例1按照如图1所示的技术流程进行操作，具体为:(I)取五个来自我国不同地区的传统发酵酸面团，编号为Hn-87、Sx_91、Gs_107、Hf-112和Hr-122，分别取发酵酸面团200mg于1.5mL离心管中，加入lmL20%a-淀粉酶溶液，震荡混匀。(2)将混合液置于65°C金属浴中加热酶解20min，在12000Xg条件下离心5min，
弃沉淀，取上清，得到酶解物。(3)采用真菌DNA OMEGA试剂盒提取酶解物中真菌总基因组DNA。(4) Nandrop2000检测提取的DNA的浓度，并调整DNA浓度为50ng/uL。(5)将调整后的DNA溶液进行降落PCR (Touchdown PCR,第一轮PCR)扩增；引物为带有GC夹子的真菌通用引物ITS5.8S与28S_1 ；5.8Sf:5’ -GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3’，28S_lr:5’ -TATGCTTAAGTTCAGCGGGTA-3’，GC 夹子:5’ -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCC CCGCCCG-3，。25 μ I的反应体系组成如下:DNA模板2 μ 1，引物5.8S和28S-1-GC的两种引物各
0.5 μ 1，dNTPs2.5 μ 1，10Xbuffer2.5 μ 1，Ex Taq 酶 0.125 μ 1，双蒸水 16.875 μ I。反应条件为:95°C预变性5min，然后在95°C变性30s，60°C引物复性30s，72°C引物延伸2min，循环20次，每循环一次，复性温度降低0.5°C ;之后，95°C变性30s，5(TC复性30s，72。。延伸2min，循环4次后72°C终延伸IOmin0(6)将PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检验后，将阳性结果再次进行Reconditioning PCR 反应(第二轮 PCR 扩增)，引物为不带GC夹子的真菌通用引物ITS5.8S与28S_1 ；5.8Sf:5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3’ ；28S-lr:5’-TATGCTTAAGTTCAGCGGGTA-3’ 。反应条件为:95°C预变性5min，然后在95°C变性30s，50°C引物复性30s，72°C引物延伸2min，循环4次，72°C终延伸IOmin0(7)合并步骤(5)和步骤(6)的PCR产物，并进行纯化。PCR产物纯化后，进行DGGE凝胶电泳，上样量为15μ 1，加入7μ I loading buffer，变性梯度为35%_65% (胶浓度)，50V条件下电泳12电泳结束后用SYBR Green I染色lh。(8)将DGGE胶在紫外灯下进行切割条带，并用超纯水浸没，4°C条件下过夜。(9)用不带GC夹子的引物对上述浸液进行PCR反应，进行片段验证后，进行克隆测序。(10)测序结果在NCBI上进行验证，鉴定目的微生物的种类。图2为五个不同地区发酵酸面团中真菌PCR-DGGE指纹图谱。根据克隆测序、NCBI比对，五种样品的真菌菌相组成结果见表I和表2，表明本实施例方法可以快速鉴别出发酵酸面团中的真菌菌相组成。
表IDGGE指纹图谱中条带鉴定结果
1.一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法，包括:
(1)将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物；
(2)从酶解物中提取真菌总基因组DNA；
(3)以提取的真菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的真菌通用引物ITS5.8S与28S-1-GC进行第一轮PCR扩增；
(4)以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用真菌通用引物ITS5.8S与28S-1进行第二轮PCR扩增；
(5 )对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中真菌菌相组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的淀粉酶为α-淀粉酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的发酵酸面团与淀粉酶的重量比为0.5:1-1:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的酶解温度为60-65°C，时间为20-30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取真菌总基因组DNA后，将DNA的浓度调整为45-55ng/uL，再进行第一轮PCR扩增。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的第一轮PCR为降落 PCR。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，降落PCR的反应条件:95°C预变性5min，然后在95°C变性30s，60°C引物复性lmin，72°C引物延伸2min，循环20次，每循环一次，复性温度降低0.50C ;之后，95°C变性30s，50°C复性30s，72°C延伸2min，循环5次后72。。终延伸IOmin0
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，第二轮PCR的反应条件为:95°C预变性5min，然后在95°C变性30s，50°C引物复性30s，72°C引物延伸2min，循环4次，72°C终延伸 IOmin。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的分析包括如下步骤:合并第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物并纯化，然后进行变性梯度凝胶电泳分离，将得至IJ的扩增条带进行染色、纯化、克隆测序，之后与标准菌序列比对，判定真菌种类。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的变性梯度凝胶电泳的变性梯度为35%-65%，电泳电压为48-52V，电泳时间为12_13h。
本发明公开了一种鉴定发酵酸面团中真菌菌相组成的方法，包括将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物；从酶解物中提取真菌总基因组DNA；以提取的真菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的真菌通用引物ITS5.8S与28S-1-GC进行第一轮PCR扩增；以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用真菌通用引物ITS5.8S与28S-1进行第二轮PCR扩增；对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中真菌菌相组成。本发明对发酵酸面团先进行酶解后再进行PCR扩增，然后通过变性梯度凝胶电泳分离，从分子水平对传统发酵酸面团中真菌菌相组成进行了鉴定，具有稳定、高效、成本低的特点，为开发我国传统发酵食品中微生物资源提供参考。
文档编号C12Q1/04GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者何国庆, 张国华, 柯乐芹, 杨浣漪, 刘同杰, 朱立颖, 王欣 申请人:浙江大学我的聚丙烯酰胺凝胶在空气中有微生物在其上生长,请问专业人士该微生物是以什么为碳源和氮源生长的呢?_百度作业帮
我的聚丙烯酰胺凝胶在空气中有微生物在其上生长,请问专业人士该微生物是以什么为碳源和氮源生长的呢?
我的聚丙烯酰胺凝胶在空气中有微生物在其上生长,请问专业人士该微生物是以什么为碳源和氮源生长的呢?
主要还是看微生物的种类吧.我觉得凝胶中含有多种有机物比如Acr、Tris、SDS、这些都有可能成为微生物的碳源与氮源吧?而且如果把胶置于空气中,空气中的灰尘颗粒中也是含有多种不明成分的,所以具体是哪一种就怕不好说.个人意见,仅供参考.跑凝胶电泳如何确定每个孔的上样量?就是,每个孔加的量,是不同的么,除了marker还要加其他对照么_百度作业帮
跑凝胶电泳如何确定每个孔的上样量?就是,每个孔加的量,是不同的么,除了marker还要加其他对照么
跑凝胶电泳如何确定每个孔的上样量?就是,每个孔加的量,是不同的么,除了marker还要加其他对照么
凝胶电泳每个孔的加样量都是一致的,如果不一致,需要换算,marker按照需求添加.有条件的话留一道空白的,注意别飘样就可以了.欢迎追问,
一致是同比对照么？那为什么我看别人的图，12345都不一样？
不多说，直接上图，这个做的是T-DNA鉴定你看，每个孔上10微升这样就可以看出虽然一道有一点印记但是与二道想必太弱，所以一道不是特异带最后两道是没有样的，看，本底很干净，倒数第三道是M如果每个道上样不一样的话很难区分是不是非特异，或者别的什么玩意即使不做T-DNA鉴定，这个也很重要。不留空白就不太好区分本底（这个不重要），M是按照要求上的5微升（不同牌子要求不同）这样就好计算每样品浓度是多少了（看亮度）欢迎追问，求采纳
采纳是肯定的，还得加分，就是还想问，既然上样量是一样的，怎么123456的大小不一样？
首先，虽然上样量一样，但是不代表样品内DNA浓度一样，这个和样品的制备，DNA的提取关系很大，所以，亮度不一样，正常得很，想要样品亮度一样需要先测OD，再算上样量，除了做定量PCR之外，没有那么玩的，即使是亮度一样了，也要把上样量用水调平，不然会扭曲的。