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&&&&&&&&&&&&人骨髓间充质干细胞抑制单核细胞来源的树突状细胞的成熟和功能
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的免疫调节是目前移植领域研究的新热点,其对T淋巴细胞增殖作用的抑制已得到公认,但对免疫反应的起始步骤是否有作用是目前研究的新方向。树突状细胞细胞作为最重要的抗原呈递细胞,能够显著刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖,是机体免疫反应的始动者,在免疫应答的诱导中具有独特的地位。本试验拟研究骨髓来源的间充质干细胞对单核细胞来源的树突状细胞的作用。1材料和方法1.1间充质干细胞的分离、培养和鉴定:经肝素抗凝的成人骨髓(郑州大学第一附属医院健康供者)5~10m l,与等体积Ficoll液(上海试剂厂)密度梯度离心(2 000 r/m in,20m in),收获中间单个核细胞,磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤2次(1 000 r/m in,5m in)洗去残余Ficoll液,用含15%胎牛血清(杭州四季青生物)的低糖DMEM(dulbecco's mod ific...&
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目的：间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是近年发现的来源于中胚层的一类非造血成体干细胞，具有干细胞的共性：高度自我更新和多向分化能力。由于其具有低免疫原性、促进造血重建、免疫调节等特性，成为一类理想的移植备选干细胞。MSC的免疫调节是目前移植领域研究的新热点，但其作用机制目前尚不十分明确。树突状细胞(dendritic cells，DC)是体内功能最为强大的一类抗原呈递细胞，它可以激活初始型T淋巴细胞(naive T cells)，是免疫应答的始动因素，在免疫应答中处于重要的地位。DC对造血干细胞移植后移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发生及耐受中起着双向调节作用，研究间充质干细胞对DC的作用机制对移植免疫有重大意义，将为防治异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病提供可能途径。国内外研究集中在间充质干细胞对DC亚群、成熟程度及分泌细胞因子的影响，其机制...&
(本文共50页)
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树突状细胞(dendritic cells,DC)是指具有典型树突状或伪足样突起,膜表面高表达MHC-Ⅱ类分子,能够移行到次级淋巴器官刺激初始型T细胞增殖活化,并具有一些相对特异的表面标志的一类抗原提呈细胞[1]。DC是机体功能最强有力的专职抗原提呈细胞,它能高效摄取、加工处理和提呈抗原,在启动、调控和维持免疫应答中起关键作用[2]。由于DC在免疫应答中的特殊地位,导致大量研究集中于通过调节DC来改变机体的免疫应答,达到治疗肿瘤、感染、自身免疫性疾病以及抗排斥反应等目的[3~5]。DC来源于造血干祖细胞,主要分为髓系和淋巴系DC[6]。不成熟DC主要分布于外周组织,在血液和淋巴循环中游走,有很强的摄取、加工各种外来抗原的能力,但是刺激T淋巴细胞的能力很弱;成熟后的DC则主要位于淋巴结内,向T淋巴细胞提呈摄取加工后的抗原,从而有效诱导T细胞免疫应答[7]。DC在机体内数目稀少,必须通过扩增方能满足临床应用的需要。人们已建立并完善了...&
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0引言近年来,树突状细胞在诱导高效而特异的抗肿瘤免疫中能起关键作用,是因其独特的抗原递呈功能和天然免疫佐剂功能。树突状细胞不仅能激活活化性T细胞,还能在体内外激活初始性T细胞。因此,树突状细胞被认为是最理想的肿瘤抗原载体,树突状细胞瘤苗在肿瘤免疫治疗中的应用引起人们的广泛关注。本实验通过体外实验来探讨树突状细胞的抗癌作用。1对象和方法设计:以健康志愿者为研究对象,验证性实验研究。单位:华北煤炭医学院附属医院呼吸内科。对象:实验于3-03在华北煤炭医学院完成。选取健康志愿者30例,男15例,女15例,年龄30～40岁,平均36岁,职业为教师和学生。纳入标准:经过查体、血常规、尿常规、血生化、胸片及心电图检查证实身体健康的志愿者。排除标准:既往有全身性疾病病史或经辅助检查结果异常,以及3个月内患感染性疾病痊愈者均予以排除。设计、实施、评估者:由第一作者设计,评估为第二作者,第三、四作者负责实施。采用双盲法评估,...&
(本文共3页)
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0引言树突状细胞是一种异质性细胞群,在来源、表型、成熟度及功能上表现出高度不均一性[1]。正是由于树突状细胞的异质性,它在调节机体免疫反应中起双重作用。一方面,树突状细胞在触发和调节先天性免疫反应和获得性免疫反应中起关键作用;另一方面,树突状细胞能调节T细胞反应,维持和诱导机体免疫耐受。树突状细胞的功能与其所处的发育阶段有着密切的关系[2],未成熟树突状细胞在诱导机体免疫耐受中有重要的作用。研究者利用树突状细胞能够诱导耐受的特性治疗自身免疫性疾病取得了较好的成绩,为治疗自身免疫性疾病提供了新的思路和途径。但未成熟树突状细胞诱导外周耐受的机制尚未清楚,本实验利用体外培养的树突状细胞,与T细胞共培养,通过对比未成熟树突状细胞与成熟树突状细胞自身分泌白细胞介素12的水平以及刺激T细胞分泌Th1与Th2类细胞因子偏倚的差异,进一步探讨树突状细胞在调节机体免疫应答的作用和机制,为树突状细胞诱导免疫耐受中的应用提供理论和实验的基础。1材料和...&
(本文共3页)
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近年大量研究表明动脉粥样硬化(atherosclero-sis,As)是一种慢性炎症免疫性疾病,其中外来病原体如微生物和内源性抗原如氧化型低密度脂蛋白(oxidized-lowdensity lipoprotein,ox-LDL)的识别和呈递被认为是As发生发展的关键[1]。树突状细胞(dendritic cell,DC)是人体内最强大的专职抗原呈递细胞,具有诱导原发免疫反应的独特能力,在免疫过程中起着重要的调控作用,最近研究发现它在动脉粥样硬化中具有重要的作用[2]。过氧化体增殖物激活型受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)是一类由配体激活的核转录因子,是核受体超家族的成员,包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3个亚型。其中PPARα是脂质、脂肪酸和脂蛋白代谢的重要调节因子,大量临床研究发现其配体贝特类药物能延缓As的发生发展。进一步研究还发现PPARα在...&
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树突状细胞(DC)是目前已知的最强的专职抗原递呈细胞(APC)，决定免疫反应的最终走向是激活免疫还是诱导耐受。DC广泛分布于脾脏、淋巴结、胸腺等淋巴器官以及皮肤、肝等非淋巴器官。目前对DC研究多集中在外周血DC、骨髓来源DC和脾脏DC，肝DC由于其数量稀少，功能尚不十分明确。1部位及特性肝APC包括库普弗(Kupffer)细胞、肝血窦内皮细胞(IJSEC)和肝DC等。Kupffer细胞和I矛SEC都表达MHC分子、共刺激分子和粘附分子。肝DC主要分布于门静脉管道的周围，主要以不成熟的前体细胞存在，表达MHC分子，但不表达激活T细胞所需的共刺激分子IFA一3(CDss)、ICAM一1、B7- 2等，可以分泌IL一10。与骨髓来源DC和脾以二相比，肝DC不表达共刺激分子，激活幼稚型同种异体T细胞的能力弱〔’一2〕。肝DC的不成熟状态与肝脏的特殊微环境有关。肝内非实质细胞能产生大量的IL一10和TGF一日，肝细胞也能分泌II.一10。...&
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脐带血体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究
１３１８骨髓间充质干细胞（ＢＭ―ＭＳＣｓ）是最早自骨髓中分离出的一类具有自我更新及多向分化潜能的组织干细
胞，ＢＭ―ＭＳＣｓ具有干细胞特点，存在多向分化潜能，可
以在特定实验条件下分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、肌管及神经元等多种间充质组织细胞¨，２１。ＢＭ―ＭＳＣｓ具有稳定和修复造血微环境，促进造血干细胞增殖、分化，调节淋巴细胞免疫功能，减轻移植排斥反应等生物学效应∞Ｊ，因此具有重要的临床应用价值。脐带血清中含有ＣＳＦ、ＧＭ―ＣＳＦ、Ｇ．ＣＳＦ、ＩＬ－６及ＴＮＦ等多
种细胞因子，可支持造血细胞体外生长和扩增ＨＪ。本
研究于２００７年６月～２００８年１０月在中南大学湘雅二医院血液内科分子实验室采用脐带血清外培养ＢＭ－
ＭＳＣｓ，建立了一种基于临床移植需要的体外培养人
ＢＭ。ＭＳＣｓ的培养体系，现报告如下。１材料与方法
１ ｌ主要仪器超净工作台（苏州安泰公司），细胞培养箱（ＳＨＥＬＬＡＢ），流式细胞仪（ＦＡＣＳＣａ
ｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ产品），倒置显微镜、照相机、荧光显微镜、数码相机（Ｏｌｙｍｐｕｓ），细胞培养板、细胞培养瓶（Ｃｏｒ－ｎｉｎｇ）。
ｌ ２主要试剂
Ｆｉｃｏｌｌ
Ｐａｑｕｅ细胞分离液（Ｓｔｅｍ
Ｔｅｃｈ公司）、脐带血清（由本试验室制备），ＤＭ
ＥＭ／Ｆ１２
培养基（Ｇｉｂｃｏ公司），０．２５％胰蛋白酶一０．０１％ＥＤＴＡ
（Ｇｉｂｃｏ公司）；诱导试剂：地塞米松、Ｂ一甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐、３。异丁基－１－甲基黄嘌呤（ＩＢＭＸ）、胰岛素及消炎痛均为Ｓｉｇｍａ产品；流式相关抗体：鼠抗人单
克隆抗体ＣＤ４５一ＰＥ、ＣＤ３４－ＰＥ、ＣＤ７３一ＰＥ（ＢＤ
ＰｈａｒＭｉｇｅｎ
产品）、ＣＤ３１－ｎＴＣ、ＣＤ２９一ＦＩＴＣ、ＣＤｌ０５一ＦＩＴＣ（深圳生物晶美公司），碱性磷酸酶（ＡＬＰ）染色试剂盒（上海太阳生物技术有限公司），油红Ｏ（北京鼎国生物技术有限公司）。
１ ３试验方法
１．３ １胎儿脐带血清的制备正常剖宫产手术或
平产过程中取健康胎儿离体脐带血，手术台上无菌条件下抽取脐带血（不抗凝），注入无菌玻璃瓶后置入３７℃培养箱中静置２ｈ，待血凝块完全析出后，无菌条件下在超净工作台中吸出血清移入离心管，４℃下水平离心（１０００
ｍｉｎ），弃沉淀，一２０。Ｃ保存。使用前
５６℃水浴灭活３０ｍｉｎ后，置于４。Ｃ备用。
１．３ ２骨髓ＢＭ―ＭＳＣｓ的分离培养与传代在无菌条件下于６名非恶性血液病志愿捐髓者（男女各３名，
年龄３５－４８岁，中位年龄４２岁）髂后上棘多点穿刺抽
取骨髓血４０ｍｌ，肝素抗凝，分离单核细胞（ＭＮＣ）层，用ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基混匀，洗涤２次。每份骨髓按４
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＰｈｙｓｉｃｉａｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００９，＂Ｃ０１．１１，ＮｏｌＯ
×１０６
ＭＮＣ／ｍｌ密度分别用含１０％脐带血清的ＤＭＥＭ／
Ｆ１２培养基８ＩＩｌｌ接种于２５ｃｍ２培养瓶中。３７％、５％
ＣＯ：培养箱全湿条件下培养７２ｈ，全量换液，去除血细胞及其它未贴壁成分。每３天全量换液。细胞融合达８０％以上，加入０．２５％胰蛋白酶一０．０１％ＥＤＴＡ溶液３ｍｌ消化，按ｌ：４传代。取第４代（Ｐ４）细胞进行实验。
１．３ ３细胞生长曲线测定取第４代ＢＭ―ＭＳＣｓ按１．０×１０４／ｍｌ的密度接２ｍ１种于２４孔培养板，台盼蓝拒染法计数活细胞，１次／ｄ，共８次。每２４小时吸去３
个孔的培养液，用０．２５％胰蛋白酶一０．０１％ＥＤＴＡ消化，制成悬液后计数，计算平均值。
细胞周期测定取Ｐ４ＢＭ―ＭＳＣｓ消化后用
７０％乙醇渗透，ＲＮａｓｅＡ处理，ＰＩ染色。流式细胞仪至
少计数１×１０４个细胞，应用Ｃｏｔｔｉｔ软件分析结果。
ＢＭ―ＭＳＣｓ表面抗原的检测取Ｐ４代生长
达８０％融合的贴壁细胞，用０．２５％胰蛋白酶一０．０１％
ＥＤＴＡ消化，计数后取２×１０６个细胞，分装８管，每管加入２０山荧光标记抗体ＣＤ４５一ＰＥ、ＣＤ３４一ＰＥ、ＣＤ７３．
ＰＥ、ＣＤ３１－ＦＩＴＣ、ＣＤ２９一ＦＩＴＣ、ＣＤｌ０５一ＦＩＴＣ，另设２管为空白对照，室温避光３０ｍｉｎ；用ＰＢＳ反复洗２次，加入
４００Ｉ．ｄ
ＰＢＳ混匀细胞，上流式细胞仪检测。
１ ３ ６定向诱导ＢＭ ＭＳＣｓ向成骨细胞分化的方法
与鉴定收集消化后的Ｐ４ＢＭ―ＭＳＣｓ按４×１０４／ｃｍ２接种于６孔板，待细胞融合达５０％以上后，换用含１０％
脐带血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液，加入成骨诱导体系：
地塞米松０．１Ｉｘｍｏｌ／Ｌ、１３－甘油磷酸钠１０ｍｍｏｌ／Ｌ、抗坏血酸磷酸盐５０Ｉ．Ｌｍｏｌ／Ｌ，每３ｄ全量换液，培养２周。碱性磷酸酶染色：各取培养１４ｄ的细胞爬片２张，ＰＢＳ漂
洗，按碱性磷酸酶试剂盒操作步骤进行染色。每张爬片选取随机视野，各计数２００个细胞，计算成骨细胞阳
１ ３ ７定向诱导ＢＭ―ＭＳＣｓ向脂肪细胞分化的方法
与鉴定收集消化后的Ｐ４ＢＭ―ＭＳＣｓ按２×１０４／ｃｍ２接种于６孔板，待细胞融合达５０％以上后，换用含１０％脐带血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液，加入脂肪诱导体系：
地塞米松１¨ｍｏｌ／Ｌ、人胰岛素５ｍｇ／Ｌ、ＩＢＭＸ０．５ｍｍｏｌ／
Ｌ、消炎痛１００ｐ．ｍｏｌ／Ｌ，每３ｄ全量换液，维持２周。镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况，油红Ｏ染色。随机
选择１０个非重复视野，计数脂肪细胞阳性率。
形态学观察ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ分离液分离获得的
细胞呈圆形，接种７２ｈ全量换液后，’逐渐出现贴壁细胞，残留的各种类型的血细胞６ｄ后通过完全换液逐渐除去，此时贴壁细胞呈长梭形，为单个或几个细胞的
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单核细胞的生物学特性及其应用
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&&物种在长期进化过程中已经形成了比较完善的、抵御环境中病原微生物侵袭与感染的免疫系统,并随着物种的进化而进化.具有多能干细胞特性的外周血单核细胞,在非特异性免疫和特异性免疫过程中发挥着非常重要的作用,既能消灭侵入的病原微生物,又能够对病原微生物进行加工处理,将抗原呈递给其他免疫细胞,架起了先天免疫与获得性免疫的桥梁.
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神经干细胞及其在脊髓损伤修复中的应用
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神经干细胞及其在脊髓损伤修复中的应用
创伤性脊髓损伤（SCI , spinal cozd injuzy）往往导致一系列严重的后果，例如损伤部位以下，完全或部分丧失运动及感觉功能，削弱肠道，膀胱及性功能，屈肌或伸肌痉挛，给病患造成极大的痛苦。在美国，据统计大约有200，000人患有慢性损伤性SCI，并以每年新发10，000 SCI病例的速度递增，每年用于治疗SCI的费用超过40亿美元。外伤性SCI可引起长下行运动神经及长上行感觉神经通路损毁，SCI病理特征中有2个特征性阶段：常被称为第一次损伤（首次损伤）和第二次损伤（再次损伤）。首次损伤包括脊髓局部遭受首次攻击（挫伤、撕裂），所致的出血、水肿、细胞坏死，急性炎症以及释放炎性因子、毒性自由基以及反应性胶质增生，这一阶段可持续数周，这一系列损伤最终导致损伤局部液性囊腔不断扩大，囊腔周围分布着致密的胶质瘢痕，抑制轴突再生。
近年来，一些研究表明移植神经细胞治疗急、慢性SCI具有潜在的临床应用前景。神经移植研究的目的是希望植入的神经组织能有效地整合到损伤的脊髓，代替死亡的细胞，或促进宿方轴突再生，甚至于在某些情况下使神经功能得到恢复。近来在神经干细胞研究领域的探索，发现一些诱导因子能影响神经干细胞的分化，预示着应用神经干细胞治疗多发性硬化症，Alzheimer症、Parkinson病、Huntington症，缺血性脑损伤以及创伤性脊髓损伤等多种神经系统疾病有着广阔的前景。在这篇综述中，我们将总结最近关于啮齿类动物及人类神经干细胞生物学研究进展，并讨论应用神经干细胞移植治疗脊髓损伤的独特的优点及可能性机制。1．&&神经干细胞及祖细胞的意义及特点Reynolds和Weiss于1992年首次发现在胚胎及成年中枢神经系统CNS室管膜下区存在一群具有干细胞特性、自我增殖能力的细胞群。通常干细胞是指具有多向分化潜能和增殖能力（包括自我更新和克隆性扩增）的细胞， 干细胞持续保持这些特征，直到撤去相应生长因子后才发生终末分化。神经干细胞表达中间丝蛋白nestin（神经上皮干细胞蛋白，neuroepithelial stem cell protein），而不表达神经元或胶质细胞等分化标记。在培养中，神经干细胞形成集落或聚集成大小不一的神经球（neuronsphere）。神经干细胞的分裂方式有两种：对称分裂和不对称分裂。在对称分裂情况下产生的两个子细胞均是干细胞；在不对称分裂情况下，则产生一个干细胞和一个谱系限制的祖细胞（即将终末分化的细胞）。祖细胞相对于干细胞而言，其自我更新能力和分化能力受到限制（只能分化成神经元或胶质细胞中的一种），因此通过不对称分裂中产生分化的祖细胞使干细胞池保持相对稳定。神经祖细胞表达各种不同的神经标志，如胶质祖细胞的标志是A2B5，但是神经祖细胞以及谱系限制的前体细胞仍表达少量的nestin，因此需要改进功能及分子标准以进一步区分神经干细胞和神经祖细胞。为了证实各种分化的神经细胞（包括神经元和胶质细胞）是从谱系限制的神经前体细胞或具有多向分化潜能的干细胞分化而来，人们进行了克隆分析，研究结果表明各种神经细胞由干细胞分化生成的。在克隆分析研究中，单个干细胞能克隆性扩增并形成细胞球；进而分化成表达各种相应的特异性标志的神经细胞；神经元（表达MAP-2；βⅢ-tubulin），星形胶质细胞（表达GFAP）以及少突胶质细胞（表达GalC；RIP）。2.神经干细胞在体内的定位
在发育过程中，大脑的脑室，脑室下区（SVZ）以及脊髓的中央管附近存在着神经祖细胞，并能分化成神经元和胶质细胞;在成年大脑中室管膜及室管膜下区有一群从SVZ区迁移而来，能快速持续增殖、有丝裂原活性。的未分化异原细胞群，室管膜下区细胞群沿侧脑室排列，主要表达新生的中间丝nestin和一些表皮生长因子受体（EGFR），后者是体外分离培养神经细胞球所必需的。从室管膜下区分离得到的神经干细胞，在体内是一群“静息”的干细胞群，而在体外培养中，能持续分裂并形成神经球，具有自我增殖，自我更新，以及终末分化为神经元和胶质细胞的能力，这些研究结果有力地证明了神经干细胞分布于室管膜下区。体内实验表明，脑室间分布的碱性纤维生长因子（bFGF；FGF-2）和表皮生长因子（EGF）对SVZ区祖细胞显示不同效应，在侧脑室侧壁上，SVZ区的神经祖细胞经朝向头侧的迁徙途径，最终到达嗅脑形成中间神经元。只有FGF-2能使嗅脑中的新生神经元得以增殖，而EGF的作用是减少嗅脑中的神经元数目，使星形胶质细胞生成得以增加，成年大鼠脑内室管膜及室管膜下区细胞高表达FGF-2和FGFR1 mRNA及其蛋白质，表明成年SVZ区产生及分泌的FGF通过生自分泌及旁分泌作用于神经干细胞、祖细胞，因而FGF-2的中和抗体能阻断神经发生，因而表明FGF-2在正常CNS发育过程中是必需的营养因子。
近来有证据表明位于成年CNS中侧脑室及中央脑水管（central canal）的室管膜细胞是神经干细胞，此类细胞能增殖，表达nestin，其中大约有6%DiL标记的纤毛室管膜细胞能增殖形成神经球，并在血清的作用下分化成神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。脊髓损伤后，nestin阳性的室管膜细胞增殖，迁移到损伤部位周围分化成星形胶质细胞，形成胶质瘢痕。而Doetsh等发现，室管膜下区有一组神经前体细胞又称为B型细胞（type B cell）能在体外培养中形成具有多向潜能的神经干细胞球。此类细胞表达GFAP，在体内生成不成熟前体细胞及神经母细胞,在嗅脑中分化成神经元在体外培养中增殖形成多能神经球等特性，表明这种室管膜下区的星形胶质细胞也是神经干细胞。究竟是由室管膜细胞产生室管膜下区的神经球形成细胞，或者室管膜层及SVZ区本来就存在着两种独立的干细胞群，迄今为止尚无定论。3.神经干细胞在体外的特征
体外研究为神经干细胞存在于胚胎及成年CNS中提供了许多令人信服的证据。通常情况下，从发育及成年脑区可分离得到EGF反应性神经球，而从发育及成年的脊髓中可分离获得FGF-2反应性神经球，且这两种因子具有协同效应。Reynolds和Weiss发现，从胚胎期纹状体（临近侧脑室壁）分离到的神经干细胞能在EGF的刺激下增殖，形成表达nestin的神经球，这些细胞一旦失去EGF营养作用并生长于粘性表面上，则立刻分化成神经元，表达两种纹状体神经递质：GABA（γ-氨基丁酸；γ-aminobutyric acid）和P物质（substance P）。克隆分析表明，纹状体的EGF反应性细胞经过一系列传代，所形成的一级和二级神经球仍具有分化成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。Ciccolini和Svendsen发现，胚胎纹状体细胞在体外最初与FGF-2共培养（而非EGF），产生的细胞既对FGF-2有反应性，也对EGF有反应性。Shihabuddin等证明，FGF-2对成年脊髓干细胞而言具有丝裂原的作用，并在体外培养中为之提供足够的营养。实验表明，在FGF-2的营养作用下，从脊髓的颈、胸、腰、骶四部分离得到干细胞能表达中间丝蛋白Vimentin，并具有分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。
有趣的是，神经干细胞的多向分化能力比先前设想的更强。例如：神经干细胞植入射线照射的受者脊髓后，能生成造血细胞包括髓系和淋巴系细胞以及早期造血细胞前体。这一里程碑似的研究证明了某种外源信号（epigenetic signals）激活了基因内在程序（genetic programs）从而赋予了神经干细胞的多能性。此外，从胚胎纹状体分离所得的EGF反应性神经球中有一小部分（1%-3%）表达小胶质细胞MAC-1表明小胶质细胞并不完全是由单核细胞系产生，也有小部分是由神经干细胞转化而来。另外细胞与细胞间的接触也能直接引起神经干细胞向不同方向分化，神经干细胞若处于高密度培养条件下，可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，若处于低密度培养条件下，则主要分化成平滑肌细胞，表达平滑肌肌动蛋白（SMA）、碱性Calponin（bCALP）或SM22，后两者是平滑肌特异性标志。4．神经干细胞表达中间丝蛋白nestin
nestin，一种新近发现的Ⅵ型中间丝蛋白质，无论在体内还是在体外都是鉴别神经干细胞的有用标志。原位杂交研究表明在神经管形成中nestin mRNA沿尾侧向头侧顺序表达，它的表达起始于E10.5天胚胎大鼠中，并持续表达到E15.5天及出生当天（P0）发育端脑的脑区/SVZ区和小脑。尽管nestin免疫反应性主要表达于增殖的神经上皮细胞，但nestin阳性细胞群中仍包括骨骼肌细胞、内皮细胞、室管膜细胞、人原始CNS肿瘤如胶质瘤和原始神经外胚层肿瘤（PNETs）以及反应性星形胶质细胞。estin免疫反应性，在体内定位于胚胎及成年SVZ区的神经干细胞，主要是由室管膜及室管膜下区细胞表达。尽管nestin蛋白分布在这些细胞的胞浆中，但其mRNA主要在胞膜下区（subcellulas level）表达，而转录发生在神经上皮细胞突触小结的软膜上。在分化过程中，nestin的表达量迅速下降，而其他中间丝蛋白基因如internexin，神经丝（neurofilament,NF）以及GFAP等基因迅速上调，表明细胞骨架的重塑过程与干细胞分化成神经元及胶质细胞有关。尽管在分化过程中nestin的表达量下降，但谱系限制的前体细胞仍表达少量的nestin，表明前体细胞是干细胞与各种终末分化的神经细胞之间的过度状态。这些发现再次说明鉴别神经干细胞未分化状态的不同阶段实非易事。另外中间丝Vimentin尽管在神经干细胞中有所表达，但因为它也表达于其他各种细胞，故不将其作为神经干细胞的特异性标志。5．神经干细胞的分子生物学特性近来，一些研究小组致力于研究各种生长因子及其受体在调节神经干细胞的生活、生长以及其分化中的作用。一般而言，在FGF或EGF存在的条件下，神经干细胞都能存活增殖，并保持未分化状态。然而，从CNS不同部位分离所得的不同来源的神经干细胞对FGF或EGF的依赖性，反应性也是不同的。例如从大脑不同区域分离得到的神经球，只对EGF具有反应性，从而在体外存活生长，尽管FGF对之有协同效应。与此相反，从胚胎及成年脊髓中分离得到的神经干细胞依赖于FGF而存活生长，低剂量FGF对神经干细胞而言是种存活因子，而高剂量FGF则显示丝裂原活性。另外，在神经干细胞培养液中加入蛋白多糖肝素能增强FGF-2的作用，这可能是因为肝素能与FGF受体交联，或者改变FGF的稳定性或功能。在各类子代细胞产生过程中，FGF同样显示剂量依赖关系，低剂量FGF促使神经元的生成，而高剂量的FGF则主要促使胶质细胞产生。迄今为止，至少发现有10种FGF同种型（isoform），它们表达于CNS的不同阶段。其中，FGF-2在神经管关闭后即刻表达，而FGF-1的表达紧随其后。运用RT-PCR方法检测EGF、FGF及其受体在脊髓神经干细胞和祖细胞上的表达情况，发现胚胎发育E10.5的脊髓其神经上皮细胞中检测到FGF-1，FGF-2和EGF，其中FGF对于脊髓神经干细胞存活、增殖是必需的，而EGF则在此期间不发挥作用（它仅对脑来源神经干细胞有营养作用）。EGF受体（EGFR）是一种氨基酸激酶受体，该受体可在大鼠的胚脑和新生鼠纹状体来源的神经干细胞中检测到，在成年大鼠大脑的不同部位如皮层和纹状体中也能检测到该受体的存在，但在胚胎脊髓来源的神经干细胞中检测不到EGFR的存在，这也间接说明这些细胞对EGF无反应性是因为缺乏EGFR的表达。FGF信号传导是由具有酪氨酸激酶活性的FGF受体(FGFR)完成的。现以发现的4种FGFR同种型（FGFR1-4）以及许多剪接变异体，显示很强的同源性。这些同种型（isoform）表明不同受体与配体的亲和力不同，且在传导FGF信号时可能激活不同的细胞内第二信号途径。用相似的方法也得到了FGFR在干细胞、神经元及胶质细胞中的表达图谱。脊髓干细胞表达的FGFR主要是FGFR-1，2，3，4，特别是它们的ⅢC型，其中FGFR-4是脊髓干细胞独特表达的。与之相反，PDGFR同种型的表达则见于皮层EGF依赖的神经球，从而可能诱导神经元前体细胞的形成。
神经特异性转录因子Mash-1（一种碱性螺旋-环-螺旋型蛋白，basic helix-loop-helix，bHLH）和编码同源蛋白（encode a homeobox protein）的Prox-1都表达于增殖细胞群，因而可作为鉴别增殖细胞与自我更新的干细胞的标志。在诱导神经干细胞向谱系限制的祖细胞转化过程中，这两种转录因子发生表达，在干细胞退出自我更新模式，分化成神经元和胶质细胞前，于前体细胞中短暂表达Mash-1和Prox-1。Mash-1作为干细胞分化的阳性调节因子（positive regulator），下调nestin表达、上调Prox-1表达以及可能影响其它目的基因的表达，这一系列变化成为干细胞分化的第一步。
Musashi-1是一种RNA结合蛋白，表达于发育时期以及成年啮齿动物室管膜下区神经干细胞中，Musashi-1及其在人类组织中的同系物MSI1（Musashi homolog 1）在神经干细胞中大量表达，可能在转录后水平调节干细胞基因的表达。6．人神经干细胞的分离和体外增殖
人神经干细胞的分离具有很重要的临床价值，干细胞移植可能促进组织再生，替代损伤丢失的细胞，因此干细胞治疗为多种神经疾患提供了新的机遇。已有报道，从人胚胎前脑分离出神经干细胞，进行体外培养，这些细胞能在含有EGF和FGF-2的营养液中进行体外扩增。但有别于啮齿类神经球的培养，人神经干细胞的存活与增殖的必须依赖于这两种生长因子的协同作用；若EGF，FGF-2与另外一些因子，例如白血病抑制因子（LIF），睫状神经营养因子（CNTF），IL-6细胞因子家族成员等在体外培养啮齿类干细胞过程中不需要的一些因子，联合使用比仅使用EGF和FGF-2更能促进人干细胞的增殖及体外扩增。人神经干细胞也表达中间丝nestin，也具有自我更新及分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。有报道显示，从早期妊娠（first-trimester）胚胎前脑中分离得到的人神经干细胞在体外培养中一直保持这些能力至少一年以上。
胚泡来源细胞是神经干细胞的另一种来源。这些细胞作为全能胚胎干细胞（ES细胞）可在体外增殖。ES细胞经诱导可成为谱系限制的前体细胞，选择性表达报告基因如Lac Z（编码β-半乳糖苷酶）或GFP（绿色荧光蛋白），产生纯化的神经干细胞群、前体细胞群或者分化成各类神经细胞，诱导纯化后的干细胞群能在体外增殖成神经球，用于移植治疗。7．神经干细胞移植治疗优势
相对于各类神经细胞移植而言，应用神经干细胞移植，拥有几个独特的优势，为神经移植提供了新的机遇和希望。具有增殖能力的神经干细胞群能在CNS特定区域中分化成具有相应表型的各种神经细胞，并可能重建联接，因此应用神经干细胞进行CNS移植可能是一种较为理想的移植治疗方法。通过克隆性扩增，多次传代、分离EGF和/或FGF-2反应性神经球或单个细胞，使干细胞不断自我更新，产生足够量的移植细胞。在体外长期培养中，生长因子的持续性刺激并不减少或改变干细胞对其它生长因子的反应性或分化能力，而神经干细胞经体外增殖，一旦被植入CNS，并不影响其进入细胞周期。
需要强调的是任何具有潜能的移植治疗方法，病患的安全问题必须加以考虑。在动物研究中，已有干细胞移植方面的尝试，但无论将干细胞注入正常CNS，还是注入损伤的CNS，都未见有细胞发生癌变的报道。干细胞之所以呈现低致癌性，是因为干细胞移植入体内后，发生终未分化生成神经元和/或胶质细胞，从而使植入体内的干细胞不象在体外具有快速增殖的能力，因此尽管CNS损伤能诱导损伤局部干细胞或移植干细胞增殖（检测到Brdu掺入和nestin-IR阳性），干细胞仍显示低致瘤性。由此可见，虽然体外扩增的初级干细胞仍有瘤化潜能，但相对永生性神经干细胞系而言，仍不失为一种较为安全，更为合适的临床移植物。另外，在神经移植研究中，宿主对移植物的炎性反应是另一个值得考虑的研究的问题，为了防止宿主对啮齿类和人干细胞移植物发生免疫排斥，近年研究者更多选择自身神经干细胞经体外增殖后再进行自身移植的方法进行研究。
由于神经元和胶质细胞的生成和替换功能皆依赖于干细胞，因此在处理复杂的神经损伤和疾病过程中，可能只有干细胞才具有迁移、分化的能力。干细胞移植后，能整合入宿主组织并保持稳定，在局部微环境的刺激下相应地改变其表型，提示移植后的干细胞可能根据不同类别的损伤或疾病，反应性地选择某种组织特异性的分化途径进一步分化。无论宿主的神经通路是正常的，还是损伤的，无论宿主处于发育期，还是已成年，整合入宿主的神经干细胞并不破坏该神经通路，并且在宿主CNS中没有明显的移植物-宿主细胞交界面，同时植入的神经干细胞可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。由于移植入宿主的供者细胞类似于宿主细胞，可能重建损失的神经通路，因此，干细胞疗法可作为一种行之有效的神经细胞替代法。移植入体内的干细胞分化趋势受到几个因素的影响，包括植入时细胞所处的发育阶段以及宿主失的是哪一类神经细胞。干细胞可根据不同的情况，“转换”分化方向及补偿损失的某种特定细胞。基因修饰的神经干细胞能使神经递质或神经营养因子恢复到正常水平，从而达到应用其他基因修饰细胞所无法达到的效果。相对于已经分化的细胞如纤维母细胞而言，神经干细胞更易被修饰以用于先体外后体内的基因疗法（ex vivo gene therapy）。经修饰的干细胞不仅能产生营养因子以影响宿主细胞的生长存活，而且神经干细胞衍化的祖细胞能通过自分泌或旁分泌机制接受该营养因子的刺激，从而引导移植细胞向某种特定类型的细胞分化。8．神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用
神经移植已成为临床上治疗SCI中最有希望的方法之一。在脊髓移植研究中，人们已大量尝试将神经干细胞及非神经细胞移植入SCI动物模型以期启动轴突再生，穿越损伤空洞，恢复神经功能。已用于移植的组织或细胞包括周围神经段，Schwann细胞，嗅觉成鞘胶质细胞（olfactory ensheathing glial cell），纤维母细胞，激活的巨噬细胞（stimulated maerophages），小胶质细胞以及胚胎脊髓组织。此外，还有结合使用上述细胞的其他疗法，包括（1）使用肾上腺皮质激素如甲基强的松龙（methylprednisolone） (2)先体外后体内的基因治疗（exvivogene therapy）（3）脊髓内植入输送营养因子的微泵 （4）使用能降解或封闭轴突生长抑制因子的酶或中和性抗体近年来，人们逐渐采用神经干细胞及其祖细胞进行移植研究，Liu等报道，通过先体外后体内的转基因技术（exvivo gene transfer approach）,使神经干细胞表达NT-3，随后将此类细胞植入正常脊髓的T8段中，表达Lac-Z的小脑神经干细胞系C17（由逆转录病毒V-myc 转导而成）过度表达全长人NT-3的cDNA。X-gal组化染色可显示分泌NT-3的干细胞在宿主脊髓中存活及整合的情况，通过形态学及表型标志MAP-2，GFAP和RIP的检测，发现分泌NT-3的干细胞能分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。植入的干细胞也能从植入的部位迁移1cm左右，提示脊髓的修复使从植入部位开始向头尾两侧延伸的。目前，有关脊髓损伤后采用神经干细胞移植方面的报道还较为少见，在最近的已项研究中，胚胎神经干细胞被植入正常及损伤的成年大鼠脊髓中，预先用Bradu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷，一种S相标志)标记增殖的细胞，移植后，随即可检测到大量干细胞存活。在伴随体重减轻的损伤中，干细胞被直接注射到损伤空洞中或损伤中心的头尾两侧。一个月后，发现细胞分化或GFAP阳性的星形胶质细胞或仍保留nestin阳性,却未发现神经元或少突胶质细胞.这一结果提示神经干细胞的分化趋势可能受到植入局部特定微环境的较大影响,而先前生长因子诱导干细胞分化成神经元或胶质细胞可能是修复损伤的关键所在。(? prior growth factor…)将具有EGF或FGF-2依赖性的脊髓神经球植入部分半横断损伤部位，发现干细胞仍具有多向分化潜能，能形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。通过宿主来源的5羟色胺以及降钙素基因相关片段（CGRP）（—positive axon?）渗透发现干细胞移植物是随意生长的。McDonald等发现，将向神经分化的胚胎干细胞（ES Cell）注射到损伤的大鼠脊髓中，Brdu标记的供者细胞移植后仍能存活，提示干细胞和/或干细胞分化细胞可在损伤部位存活；组织学分析显示植入细胞衍化的细胞至少能存活5周，并能分化成少突胶质细胞（约43%）、星形胶质细胞（约占19%）和神经元（约占8%）,并能从损伤边缘迁移大约8mm左右。用BBB运动速率标准进行步态分析显示ES细胞移植的大鼠，其后肢恢复支撑体重及部分恢复协调功能，而这些改善对照组中是完全没有的。9．神经干细胞在脊髓损伤中的作用：潜在的修复机制
干细胞移植到脊髓内为SCI治疗提供了一个全新的、有潜能的发展方向。但发生SCI后干细胞通过何种机制进行解剖结构及功能上的修复？从一些移植成功的例子推测，神经干细胞或干细胞衍化的祖细胞修复SCI可能通过以下几种机制：（1）在宿主神经元和干细胞来源的神经元之间形成突触连接；（2）提供神经轴突生长的适宜底物；（3）分泌所需的营养因子；（4）使脱髓鞘或新生的轴突重新髓鞘化。干细胞移植可能通过突触连接（神经元搭桥）使活化的轴突再生。在损伤的脊髓中，在干细胞分化成的神经元间形成的神经元桥可能提供一种连接穿越脊髓损伤的头尾两侧，因此重建功能性连接并导致神经学功能的恢复。同时神经元分化使大量神经元间搭桥成为可能，干细胞来源的少突胶质或少突胶质祖细胞可能为脱髓鞘及再生的突触提供重新髓鞘化干细胞分化必须依赖于内在（未明）的程序和外来的信号包括神经营养及生长因子、细胞因子、胞外基质分子、细胞粘附分子、细胞与细胞间的接触和神经的退化情况。在脊髓损伤的动物模型中，植入的干细胞对移植部位及周围产生的大量细胞胞膜外和/或胞膜相关信号有反应性，这使人们清楚地认识到，尽管干细胞能整合入损伤的CNS并恢复丧失的神经功能，但初次损伤和再次损伤中一系列变化如中粒细胞性及巨噬细胞浸润、神经元和胶质细胞死亡以及胶质瘢痕的形成可能改变植入细胞的分化趋势，因此在SCI模型中神经干细胞在移植后的命运必须得以深入彻底地了解。尽管人们在发育和成年哺乳动物CNS中发现有多能的神经干细胞存在，但是它们并不主动替代损失的神经细胞。外伤性SCI后，某特定的神经细胞及神经通路的损失成为损伤修复的主要障碍，只有针对性的临床处理才能加以克服，因此SCI治疗策略主要集中于以下几点：（1）防止损伤引起的神经细胞和轴突退化；（2）通过细胞移植和神经营养因子支持，促进轴突再生；（3）促进重新髓鞘化及恢复正常的轴突传导功能；（4）在宿主脊髓的目的细胞与再生的轴突之间形成突触。神经干细胞可能是完成上述每一项工作的理想工具，而干细胞移植结合其他治疗方法，可能修复损伤的神经通路、替代损失的神经细胞，从而恢复SCI后丧失的神经学功能。
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