油田采出液中硝酸盐还原菌的分离培养及对硫酸盐还原菌的抑制研究
油田采出液中硝酸盐还原菌的分离培养及对硫酸盐还原菌的抑制研究
摘要:对绥中36—1油井B区油井采出液中的细菌进行分离培养及初步鉴定，纯化出了一株生长旺盛、硝酸盐还原能力强的硝酸盐还原菌(Nitrate—ReducingBacteria，NaB)菌株B92—1，对其进行了常规鉴定及16S&rRNA分析，并进行了该菌株对富集的硫酸盐还原菌(Sulfate—Reducing&Bacteria，SRB)的竞争性抑制实验。研究结果表明仅仅投加硝酸盐、亚硝酸盐作为电子受体，对其中硝酸盐还原菌的激活作用以及产抑制硫化物产生的能力有限，而同时加入分离自采出液的NRB则对硫酸盐还原菌的生长和产硫化物活性都产生了明显的抑制，并且亚硝酸盐的抑菌效果优于硝酸盐。
关键词:硝酸盐还原菌;&硫酸盐还原菌;&限制性片段长度多态性;&硝酸盐;&亚硝酸盐;&油田&竞争性抑制
随接多年的地下水或地表水的注人，油田水中的固体溶解物会被渐渐稀释，许多油田水中也含有硫化物(H2S和HS-)，这是硫酸盐还原菌或其他和硫化物有关的细菌造成的。在石油生产过程中硫化物是有害的，因为它们有毒性、腐蚀性，还能产生不能溶解的硫铁化合物，后者将导致油田渗透性的降低。代表性的控制SRB的生物杀灭剂有氯、溴、乙醛、胺及季磷盐&。而这些化学制品也是有
毒的、昂贵而且效率低下。
目前生物抑制SRB的方法越来越成为研究的重点，在抑制SRB数量和活性的各种方法中，利用硝酸盐还原微生物的生物竞争抑制技术最为有效。该技术主要是向地层导入低浓度的硝酸盐／亚硝酸盐成分，它将更容易更积极地替代硫酸盐成为电子受体，这可以促使天然存在于油层中的NRB迅速增生扩散，并在与SRB竞争生存空间和基质时，NRB优先选择使用油层中的基质，因此可阻止SRB获得所需要的营养物，从而控制SRB的代谢活性。该技术可应用于大范围的上游作业中：储层、采油井和注水井、管道、储气藏、采出水地面设备等范围。用硝酸盐控制下水道及其他废水中的H&S多年前就被人们熟知了，而且仍然具有商业价值&&。Jenne—man等人&与Jack等人&论证了在富含硫化物的油田盐水中加入硝酸盐也能去除其中的硫化物，这归功于本源的硝酸盐还原菌。Reinsel等人&在一个砂岩柱中加人North&Sea油田中取得的水，其中含有本源的细菌，同时注入低浓度的硝酸盐或亚硝酸盐(0．57&mmol到0．71&mmo1)，观测到硫化物浓度降低。
本实验以从绥中36—1油田采出水中筛选到的SRB和NRB为目的菌，考察两者之间的共生和竞争抑制关系，以及添加营养物质的种类和浓度对SRB数量及产H2S活性的影响。为该油田进一步开发无污染、低成本、长效新颖的SRB防治技术提供理论基础。
1&材料与方法
1．1&培养基
1．1．1&基础分离培养基
选用油田产液作为基质，lL产液中添加以下无机盐成分：2．5&g&NaC1，0．5&g&K2HPO4，0．5&gNH4H2PO4，0．5&g(NH4)2SO4·7H2O，0．1&g&MgSO4·7H2O，1．5&g&KNO3，调节pH为8．0。分装于SEBC瓶中，添加1．5％&琼脂。用蒸汽压力灭菌器于121℃灭菌20&min。用于硝酸盐还原菌的初步筛选。
1．1．2&CSB培养基
按照Diane&G等人的配方&，溶于油田产液水中或溶于暗处放置一周以上陈海水中。用于硝酸盐还原菌的分离纯化与富集培养。
1．1．3&SRB选择培养基
按照Diane&G等人的配方，1&L暗处放置一周以上的陈海水，每2O&mL体系加入0．1&g铁屑。
1．1．4&修正的CSB培养基
在CSB培养基的基础上进行了修正，用于抑菌实验。
1．2&分离菌株的初步鉴定
1．2．1&细胞形态学分析
根据菌落形态(包括单菌落大小、形状、颜色等)及革兰氏染色结果对菌株进行分类。
1．2．2&对分离环境总DNA及菌株进行16SrRNA基因分析及RFLP分析
DNA提取纯化采用Wizard&Genomic&DNA&Purifi．cation&Kit。菌株16SrRNA基因片断的PCR扩增：利用细菌通用引物&8F：5&一AGA&GTF&TGA&TCCTGG&CTC&AG-&3&。1492R：5&一CGG&CTA&CCT&TGTTAC&GAC&TT-3(由上海生工生物技术有限公司合成)。
1．3&抑菌试验
1．3．1&试验设计
纯化的NRB接种于CSB培养基，富集的SRB接种于PGC培养基，培养五天后按1：1的比例接种于含有100&mL修正的CSB培养基的培养瓶中进行抑菌试验，共4组，分别为：(1)硝酸盐+NRB；(2)硝酸盐；(3)亚硝酸盐+NRB；(4)亚硝酸盐。一组空白，只加入SRB。每种处理3个平行，体系加入0．5&g铁屑，实验温度为40℃&。
1．3．2&硫酸盐浓度分析
使用美国戴安Dx一120型离子色谱仪定期监测试验样品中硫酸根的浓度变化.
1．3．3&SRB与NRB计数
SRB菌数的测定采用美国石油协会推荐的“三管平行绝迹稀释法”计数，即MPN法M。37℃&下培养7&d，根据各管的颜色变化计数。NRB计数采用本实验室改进的MPN计数法。
1．4&实验方法
1．4．1&细菌的富集培养
在20&mL西林瓶中加入15&mL培养基，加2&mL液体石蜡密封隔绝氧气，盖上聚丁烯橡胶塞及铝盖，湿热灭菌(121℃灭菌(20-30)min)，取采出的水样1&mL接种，在30℃分别恒温培养(7-2O)d(硝酸盐还原菌富集时间稍长)，以此西林瓶中的培养物作为菌种，在相同条件下进行二次转接培养。
1．4．2&硝酸盐还原菌的分离纯化和菌株筛选
取富集培养后的菌液，进行反硝化作用测试，具有反硝化作用的菌液进行适当的稀释，吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度菌液适量，接人已经制备的CSB固体培养基中，放人厌氧盒培养，重复这一过程，直至显微镜观察菌体形态和菌落形态一致，确定为纯菌。
1．4．3&可抑制H2s产生的硝酸盐还原菌株的筛选
取同样生长量的硝酸盐还原菌和SRB同时接种于修正的CSB培养基中，按比例加入1％&的硫酸亚铁铵溶液，30℃培养10&d，选出仅产生及少量或不产生黑色沉淀的硝酸盐还原菌。
1．4．4&分离菌株的形态观察
(1)将分离到的菌株进行简单染色一碱性美蓝染色和革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌株的形态
(2)将菌株的扫描电镜观察样品送至中科院海洋所电镜室。
1．4．5&系统发育分析
NRB菌株的初步鉴定：利用限制性内切酶Hha&I和Msp&I对NRB菌株的16S&rRNA基因片断扩增产物进行限制性酶切分型(酶切反应按试剂盒说明书进行)。16S&rRNA基因片断核苷酸序列测序由国家人类基因组南方研究中心进行。通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行序列比对，并利用其“Tree”功能分析与NRB代表菌株1&6S&rDNA部分序列相似性最高的参比菌株，在此基础上对代表菌株进行初步鉴定。
2&结果与讨论
2．1&NRB的纯化培养
基础分离培养基中长出的菌落，挑单菌落置于CSB液体培养基中培养，具有硝酸盐还原性的再置于CSB固体培养基中划线，长出的单菌落再次划线，如此三次，认为具有硝酸盐还原性的纯菌株。
2．2&菌种鉴定及分子生物学分析
2．2．1&NRB菌种鉴定
从油田B区B9井水样分离挑选一株硝酸盐活性强、生长旺盛的NRB菌株进行抑菌实验并进行菌种鉴定，命名为B9&2一l。菌落圆形，乳白色，直径1&mm左右，经鉴定为革兰氏染色阴性。
2．2．2&16SrDNA及RFLP分析
以B9井为代表，进行了油田水样的细菌多样性分析。并对B92—1从分子生物学上进行了鉴定。对B9井细菌建库，总共选取了96个序列进行双酶切，酶切图谱相同的选择一个为代表进行测序，总共选择了32个OTUs。
RFLP分析发现，B9井细菌中有29％&的16SrRNA基因克隆与加拿大某油田较低温度的生产井水中发现的细菌类似。另有14％&的克隆与德国某地不含有机碳源的矿物质水中的细菌类似，属于伯克氏菌科(Burkholderiaceae)。以上两者均属于&一变形菌门(β一Proteobacteria)。8％&的克隆属于假单胞细菌科(Pseudomonadaceae)，与洛杉矶28000年历史的沥青样本中的克隆相近。36％&的克隆属于r一变形菌门(r&—Proteobacteria)，与西南太平洋深海沉积物中发现的细菌相近。另外有13％&的克隆，代表为B3、B75，根据网上对比的序列并结合文献，B3较接近于发生树中β&一Proteobacteria类的序列，而B75较接近r—Proteobacteria中的，但建树后无法归人各类中，可能还是由于序列差别相对较大，且目前并没有文章对其进行较准确的报道。
对菌株B9&2—1测序分析发现，其与天然矿物质水中分离的Uncultured&Limnobacter&sp．cloneD—l5及I一1有高度同源性，D—l5及I一1都为硫氧化细菌，D一15与I一1的相似度达到99％&，认为属于伯克氏菌科(Burkholderiaceae)。
2．3&抑菌实验结果与讨论
2．3．1&添加NRB及硝酸盐或亚硝酸盐配方中硫
酸盐浓度的变化情况从图中可以看出，各处理对SRB对硫酸盐的还原都有一定的抑制作用。处理3(投加NRB与亚硝酸钠)抑制时间最长，效果最明显，第10&d硫酸根含量仍然在1．5&g／L左右，说明NRB与亚硝酸钠的投入对SRB的活性起到了很好地抑制效果；其次是处理4(投加亚硝酸钠)与处理1(投加NRB与硝酸钠)，72&d内硫酸根浓度变化不大，随后浓度降低较快。处理4表明亚硝酸盐对SRB有直接的抑制作用，Nemati等的培养试验表明，单独使用4&mmol／L的亚硝酸盐可以很好地抑制SRB产生H2S，这与试验得到的结论基本相符。处理1表明同时投加NRB与硝酸钠有一定的抑制作用，这与仅仅添加相同浓度的亚硝酸盐效果相当。处理2(仅投加L硝酸钠)具有一定的抑制效果，前期由于其提高了介质的PH值，改变了SRB生长的酸性环境，抑制了其生长，但随着SRB的生长介质酸化，碱度改变为适于SRB生长的酸性环境，SRB从而加速生长，抑制作用逐渐消失。
2．3．2&各实验配方对SRB数量的影响
添加一定浓度的硝酸盐或亚硝酸盐，在10&d内可以很好地抑制介质中SRB的生长，其SRB数量较空白处理明显降低，最大相差6个数量级，并且加入NRB的效果更明显；亚硝酸盐的效果比硝酸盐效果更明显，一直到第10&d还相差4个数量级；添加少量的钼酸盐具有明显的抑制SRB数量的作用，添加后的SRB浓度始终维持在103一1O5之间。虽然各抑菌配方均能降低SRB的数目，但是并没有完全杀死SRB，而是通过NRB与其进行营养源的竞争或者直接抑制其代谢。因此，持续投加NRB、硝酸盐／亚硝酸盐及钼酸盐，完全可以抑制SRB的代谢活性，抑制H2S产生，解决SRB生长繁殖造成的污染问题。
对绥中36-1油田采出水进行了SRB的富集与NRB的分离纯化，筛选出一株反硝化能力较强的菌株B92—1。理化分析及生长特性分析表明，富集的SRB全部为革兰氏阴性菌，具有很强的硫酸盐还原能力，能产生大量的H2S。反硝化菌株B92—1，能很好的抑制SRB产生H2S，其为革兰氏阴性菌，短杆状，无芽孢，菌体较小。
以分离出菌株B92～l的B9井为例进行了细菌多样性分析，RFLP分析发现，B9井细菌中有43％&的16S&rRNA基因克隆属于&β一变形菌门(β一Proteobacteria)。8％的克隆属于假单胞细菌科(Pseudom0nadaceae)。36％&的克隆属于r一变形菌门(r—Proteobacteria)。另外有13％&的克隆，较接近于发生树中β一Proteobacteria类或r—Proteobacteria，但建树后无法归入各类中，可能还是由于序列差别相对较大，且目前并没有文章对其进行较准确的报道。对富集的SRB建库，总共选取了96个序列进行双酶切，酶切图谱相同的选择一个为代表进行测序，总共选择了20个OTUs，RFLP分析结果表明，其中比例最高的为脱硫弧菌目(desulfomicrobiaceae)，有9个代表与其序列相似，文献中提到其为硫酸盐还原微生物。3个代表性序列与土壤中发现的假单胞菌属(pseudomonas-cluster)相似。3个代表序列与矿物质水中伯克氏菌科(burkholderiaceae)相似。5个代表与断裂玄武岩含水层中发现的无胆甾浆菌目(Acholeplasmatales)相似。
试验结果表明，NRB对SRB的生长和硫酸盐还原具有一定的抑制作用，在添加硝酸盐和亚硝酸盐等NRB营养物的条件下，NRB对SRB的还原硫酸盐有较好的抑制作用。而同等浓度的亚硝酸盐的抑制作用要好于硝酸盐的作用，还较硝酸盐更能明显降低SRB的菌数。
联系人：宋先生 电话
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高效硫酸盐还原菌的选育、鉴定及其硫酸盐转化性能研究
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密 级硕士学位论文硫酸盐还原菌的分类鉴定及抑制规律研究
学位申请人 刘
学科专业: 应用化学
指导教师: 刘宏芳 教授
答辩日期: 2012 年 1 月 9 日 A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirementsfor the Degree of Master of Engineering
Characterization and Identification of SRB and its
Control MethodCandidate: Liu
Applied Chemistry
Supervisor :Prof. Liu HongfangHuazhong University of Science and Technology
Wuhan 430074, P. R. China
January, 2012独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研
究成果。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集
体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中
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华中科技大学硕士学位论文
硫酸盐还原菌(SRB)是造成材料失效的有害菌之一,我国由 SRB 造成的损失
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的敏感性不同,且长期使用固定的杀菌剂易
正在加载中，请稍后...油田硫酸盐还原菌的分离鉴定
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