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HLA-B40交叉反应组血清学与高分辨度DNA分型的比较研究
来源：青年人()&更新时间： 17:52:02 &【字体： 】
【摘要】目的　比较研究中国汉族人群HLA?B40交叉反应组血清学分型与高分辨度DNA分型结果。方法　研究样本199份，包括血清学分型B40组阳性样本177份、可疑阳性12份和阴性对照10份。同时对血清学分型和高分辨度顺序特异引物聚合酶链反应(PCR－SSP)DNA分型进行比较。结果　DNA分型成功率99.5％，总耗时5小时，特异性和敏感性好，可准确分辨出B40组10个等位基因。血清学分型成功率99.4％，总耗时2小时，总误差20个，误差率11.2％。检出中国汉族人群B40组各等位基因所占比例：B60为67.4％、B61为20.8％、B％、B％。结论　高分辨度PCR?SSP方法用于HLA－B40组分型比血清学分型更加精确，适合于临床应用。　　【关键词】组织相容抗原，B40　聚合酶链反应　血清学分型
A comparison of serological and high resolution DNA methods for HLA－B40 cross? reactive groups typing
TAN Jianming, TANG Xiaoda, GU Wentao, et al. Renal transplant center, Shanghai First People's Hospital,Shanghai 350025
【Abstract】 Objective　To compare the high－resolution DNA typing method witd serological method for HLA－B40 cross－reactive groups (CREG) typing in Chinese population. Methods　A total of 199 consecutive samples were entered into the study, including 177 identified serologically as B40 CREG positive, 12 ambiguous and 10 negative controls. Double? blind typing for HLA－B40 CREG was carried out using PCR－SSP high－resolution DNA typing and serological one－step monoclonal antibody technique, respectively. Results　In 3 of the samples serological typing could not be performed owing to poor cell viability, while in 1 PCR－SSP typing could not be done owing to poor DNA. Among samples that were successfully typed by botd methods, all alleles of HLA－B40 CREG could be accurately distinguished by PCR－SSP.It was proved that PCR－SSP was a high－sensitivity and high specificity technique. However, serology showed 11.2％ misassignments. The overall time for serological typing was 2 hours, and for DNA typing, 5 hours. The percentages of HLA B40 CREG alleles in Chinese population were 67.4％ for B60, 20.8％ for B61, 9.6％ for B4801 and 2.2％ for B4005. Conclusion　High resolution PCR－SSP typing for HLA－B40 CREG could be used in routine clinical practice witd a greater precision than serology. 【Key words】 Histocompatibility antigens,B40 Polymerase chain reaction Serology typing
　　传统的血清学分型方法是HLA－Ⅰ类抗原分型的主要方法。但HLA－B40交叉反应组(简称B40组)之间存在着广泛的交叉反应，缺乏单价特异性抗血清,使血清学分型常常出现技术上的困难,直接影响器官移植组织配型的临床应用。为探讨血清学对B40组分型的准确性和存在的问题,我们在建立顺序特异引物聚合酶链反应(PCR－SSP)方法行HLA－B40组高分辨度DNA分型的基础上，对512例移植供、受者Ⅰ类抗原血清学分型中B40组阳性和可疑样本189份进行单盲比较研究,报告如下。
材料和方法
1　样本　①标准DNA10份,由美国加州大学(UCLA)组织配型中心提供,包括B,B4801、B4802纯合子6份和杂合子4份。②临床样本199份，来源于512例等待移植的供、受者，其中Ⅰ类抗原血清学分型B40阳性样本177份,非B40阳性、但部分B40反应孔可疑阳性12份,B40阴性样本10份。　　样本处理:采集肝素抗凝血5ml，分离淋巴细胞，编号。一份由本中心移植免疫室专人进行血清学分型，另一份由本中心分子生物学实验室专人进行DNA分型。
2　分型方法2.1　血清学分型方法:采用标准微量淋巴细胞毒技术，分型板为美国莱姆德公司单克隆抗体板，按Lee等[1]报道的一步法分型。2.2　DNA分型方法:根据1995年公布的HLA－Ⅰ类核苷酸序列[2]，设计合成B40组特异性引物13个和内源性阳性对照引物2个，组成8个引物混合物PCR反应，建立一步法PCR－SSP高分辨度B40组DNA分型方法[3]。主要步骤为：反应总量25μl，包括0.75×PCR缓冲液，镁离子1.5mmol、dNTP200μmol、Taq酶0.5U(均为美国PE公司原装产品)、相对体积分数为3％DMSO，2～3μmol特异引物和0.1μmol对照引物、50～100ng模板DNA。在PE9600型扩增仪上，95℃30秒、65℃45秒、72℃45秒，5个循环；95℃30秒、60℃50秒、72℃50秒，20个循环，继续95℃30秒、55℃1分钟、72℃2分钟，5个循环。取扩增产物10μl在20g/L琼脂糖凝胶上电泳25分钟，紫外光下观察结果(预实验在美国UCLA组织配型中心完成)。根据表1反应格局，可分辨出B4001(B60)、B4002、B4003、B4004、B4006(B61)、B4005、B4007、B4801、B4802、B7及B7DT。
表1　HLA－B40组PCR?SSP分型引物混合物组成、扩增产物大小与特异性
产物大小(bp)
B4801、B7DT
B、B4006、B4007
B4001、B4007
B4003、B4802
1　标准DNA分型结果10份由UCLA配型中心采用DNA分型方法确认的B40组标准DNA，采用本方法分型全部获得成功，分型结果与UCLA分型结果完全相同。所有等位基因特异性扩增产物片段大小与表1预期值相同，见图1。
M:分子量标志；条带1～8:阳性扩增产物；N:阴性对照图1　HLA－B40组高分辨度PCR－SSP分型阳性扩增产物
2　临床样本分型结果对512例移植供、受者进行Ⅰ类（A，B）血清学分型，509例成功，成功率99.4％；3例失败，其中1例为白血病进展期，于缓解期重复分型成功，另2例为供者淋巴细胞死亡过多；总耗时2小时。出现B40组阳性182个，177份，包括B40阳性29个、B60阳性122个、B61阳性18个、B48阳性9个和B4005阳性4个。另有12份非B40阳性，但血清板6孔B40反应孔中有1～2孔阳性。　　199份样本高分辨度DNA分型，1份因腹腔血模板DNA质量问题未获成功，改用脾细胞重提DNA后获得成功，其他均一次分型成功。总耗时5小时；10份样本，5次重复实验，重复率100％；10份样本DNA(纯合子8份，杂合子2份)送UCLA配型中心双盲验证，其分型结果完全相同。总计199份临床样本中，177份血清学B40组阳性样本，DNA分型证实有7份不含B40组位点，其中1份血清学为B60纯合子，DNA分型为B60/B61杂合子，见图2。12份血清学B40组1～2孔阳性者，DNA分型证实2份为B40组阳性(1份血清学分型B35纯合子，DNA分型为B35/B4801杂合子,见图3；另1份血清学分型为B62/B46，DNA分型为B62/B4801)。10份血清学B40阴性者，DNA分型均为阴性。实际DNA分型证实B40组阳性178个、172份样本；实际检出中国汉族人群B40组等位基因包括B、B4801以及B60/B61(1份)、B60/B4801(4份)和B61/B4801(1份)杂合子3种，未检出B4802。各等位基因在B40组（178个）中所占频率为B60为67.4％、B61为20.8％、B％、B％。
M:分子量标志；阳性带2，3，4，7，DNA分型B60/B61；N：阴性对照图2　血清学分型为B60纯合子的样本DNA分型为B60/B61杂合子
M:分子量标记；阳性条带1，7，DNA分型B4801；N：阴性对照图3血清学分型为B35纯合子的样本DNA分型为B35/B4801杂合子
3　同步比较血清学和DNA方法对B40组等位基因的分型结果DNA分型成功率99.5％，总耗时5小时，特异性和敏感性好。血清学成功率99.4％，总耗时2小时，特异性90.7％。血清学对B40组分型总误差20个、误差率11.2％(20/178)，具体误差结果与DNA结果比较详见表2。
表2　HLA－B40组血清学分型与DNA分型结果比较
血清学分型
阳性标本数
DNA分型结果（阳性标本数）
＊1例血清学分型为B60纯合子，DNA分型为B60/B61杂合子
　　人类主要组织相容性复合体Ⅰ类分子HLA?B40交叉反应组包括B和B4801、B4802等，其分型研究在HLA?B抗原乃至整个HLA分型中占有重要位置。其重要性表现在：①无论白种人群还是非白种人群，尤其是东方人，B40组在B抗原中频率最高。本组512例汉族人血清学B抗原分型中，出现B40组阳性182个、177份，占34.6％；DNA分型证实B40组阳性178个、172份，占33.6％。由于三分之一的汉族人群中存在B40组等位基因，因此，B40组的准确分型具有重要价值。②B40组等位基因之间存在着序列共享现象和高度的同源性，至今缺乏单价特异性抗血清用于B40组分型。使基于血清学水平的B40组之间出现广泛的交叉反应，各亚型的准确分辨常常出现技术上的困难，甚至无法分辨，往往只能依据抗原的人群种族和地域分布频率的高低来判断[4]，如美国Traytype公司的分型板通过4孔多价血清的反应格局来区别B40组亚型。目前最好的分型板——美国莱姆德公司的单克隆抗体板也是通过6孔多价抗体来判断B40组亚型。因此，B40组抗血清质量的好坏是衡量血清学分型试剂质量的重要指标，B40组分辨率的高低是衡量各种HLA分型方法优劣的重要依据。③HLA的分型研究是免疫遗传学和器官移植组织配型检测的基本手段之一，具有重要的临床应用价值。在免疫遗传学和人类遗传学基础研究中，总希望HLA分型越细越好，但从临床角度，尤其是尸体移植，过细的基因分型增加了寻找供体的难度，限制了实际应用价值，因而认为临床配型并无必要都进行基因分型。　　本项研究首次比较分析我国汉族人群HLA－B40交叉反应组血清学分型和高分辨度DNA分型的结果。显示：DNA分型的分辨度高、特异性强、结果精确可靠，但分型时间较长，尤其是对整个Ⅰ类抗原的分型，技术较为复杂，临床实际应用尚有一定难度。血清学分型有一定的误差，对部分亚型的准确分辨有一定的困难。但整体比较，血清学分型与DNA分型结果有较高的相符率，且分型简捷，可同时完成Ⅰ类抗原的分型，作为筛选移植供、受者，尤其是大样本量筛选异基因骨髓移植供者，具有临床实用价值，仍然是目前器官移植组织配型的主要方法。血清学对B40组分型的误差主要表现在：①由于交叉反应，使部分亚型的判断出现错误，部分亚型甚至无法分辨出来。本组有29例血清学只能分辨为B40，而无法进一步确认其亚型，有12份血清学B60和2份B61实际上分型错误。②部分血清学纯合子，实际上存在另一个B40组位点。如本组出现1例血清学B60纯合子，DNA分型证实为B60/B61杂合子；1例血清学B35纯合子，DNA分型证实为B35/B4801杂合子。因此，对于B40组血清学分型出现困难、亚型分辨不清以及空白位点，有必要采用DNA分型作进一步确认，以求作出准确的分型。
本课题受国家卫生部科研基金（962289）和中国博士后科研基金资助
作者单位：谭建明　唐孝达　丁言德　谢桐　（上海市第一人民医院肾移植中心　200080）　　　　　顾文涛　（美国加州大学组织配型中心）
　1　Lee JH, Lias M, Deng CT, et al. A one－step monoclonal antibody typing procedure that simplifies HLA class Ⅰ and class Ⅱ typing. Tissue Antigens, －42.　2　Arnett KL, Parham P. HLA class Ⅰ nucleotide sequence, 1995. Tissue Antigens, －257. 　3　Bunce M, Fanning GS, Welsh KI. Comprehensive, serologically equivalent DNA typing for HLA－B by PCR using sequence－specific primers (PCR－SSP). Tissue Antigens, －90. 　4　Lee KW, Kim YS. Serologic ambiguity and allelic frequency of the HLA－B40 family in the Korean population. Tissue Antigens, －388.
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免疫学绪论
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免疫组化是应用基本原理抗体反应即抗原与抗体特异性结合的原理通过化学反应使的酶显色来确定组织细胞内抗原多肽和对其进行定位定性及定量的研究称为(immunohistochemistry)或(immunocytochemistry)
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性免疫组织化学正是利用了这一原理先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来以此作为抗原或半抗原通过免疫动物后获得特异性的抗体再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质由于抗原与抗体的复合物是无色的因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性定位或定量的研究[1]免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为法免疫酶法免疫铁蛋白法免疫金法及放射免疫自显影法等
这些常用免疫组织化学方法的原理如下
1. 免疫荧光细胞化学技术
将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.
2. 免疫酶细胞化学技术
是目前免疫组织化学研究中最常用的技术基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用然后加入酶的底物生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒通过光镜或电镜对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究
3. 免疫胶体金技术
就是用胶体金标记一抗二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子如葡萄球菌A蛋白等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性定位或定量研究由于胶体金的电子密度高多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究[1]实验所用主要为组织标本和标本两大类前者包括病理切片和组织芯片和后者包括组织印片细胞爬片和细胞涂片
其中石蜡切片是制作组织标本最常用最基本的方法对于组织形态保存好且能作有利于各种染色对照观察还能长期存档供回顾性研究石蜡切片制作过程对组织内暴露有一定的影响但可进行是免疫组化中首选的组织标本制作方法免疫组化实验中常用的抗体为和多克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体应用细胞融合免疫动物制备多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后从动物血中所获得的免疫血清是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物根据的不同分为荧光法免疫酶标法亲和组织化学法后者是以一种物质对某种组织成分具有高度为基础的检测方法这种方法敏感性更高有利于微量抗原抗体在细胞或水平的定位其中抗生物素染色法最常用一 免疫组化SP法操作步骤
1 切片常规脱蜡至水如需抗原修复可在此步后进行
2.缓冲液洗 3min/2 次
3. 为了降低内源性造成的非特异性背景染色将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟
4. 缓冲液洗 5min/2 次
5. 滴加 Ultra V Block
在下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色
注孵育不要超过 10 分钟否则会导致特异性染色降低如果一抗的中含有 5 － 10% 正常羊血清这一步可以省略
6. 缓冲液洗 5min/2 次
7. 滴加一抗工作液 37 ℃ 1 － 2 小时具体孵育时间和温度由试验者最终决定
8. 缓冲液洗 5min/2 次
滴加 Primary Antibody Enhancer在下孵育 20 分钟
10 缓冲液洗 5min/2 次
11 滴加 HRP Polymer酶标二抗 在下孵育 30 分钟
注HRP Polymer 对光敏感应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中
12 缓冲液洗 5min/2 次
13 向 1ml DAB Plus Substrate 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen 或 AEC Plus Chromogen混匀后滴加到切片上孵育 3 － 15 分钟具体时间由染色深浅决定
14 自来水充分冲洗复染脱水透明封片⑴石蜡切片脱蜡至水
⑵ 3%H 2 O2 室温孵育 5-10 分钟以消除内源性过氧化物酶的活性
⑶蒸馏水冲洗 PBS 浸泡 5 分钟 x2 如需抗原修复可在此步后进行
⑷ 5-10% 正常山羊血清PBS 稀释封闭室温孵育 10 分钟倾去血清勿洗滴加 一抗 工作液 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜
⑸ PBS 冲洗 5 分钟 x3 次
⑹滴加适量 生物素标记二抗 工作液 37 ℃ 孵育 10-30 分钟
⑺ PBS 冲洗 5 分钟 x3 次
⑻滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液 37 ℃ 孵育 10-30 分钟
⑼ PBS 冲洗 5 分钟 x3 次
⑽显色 3-15 分钟DAB 或 NBT/BCIP
⑾自来水充分冲洗复染脱水透明封片冰冻切片 4-8μm 室温放置 30 分钟后入 4 ℃丙酮固定 10分钟PBS洗5分钟x3用过氧化氢孵育5-10分钟消除内源性过氧化物酶的活性<img title="免疫组化染色IHC" style="float:" picsrc="3bc6f750a8c2a6" data-layout="right" width="422" height="336" url="http://c./baike/s%3D220/sign=f30e924cba49b337c086e66/fb510fd9f9d72aa045.jpg" compressw="220" compressh="175" useredit="1" />从实验结果而言服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析图片的确定与选取相关数据的提供上述工作是免疫组化工作的重点内容只有严格的实验设计标准的实验操作专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求这点对于形式为腹水上清培养液之类的抗体显得更为重要关于上述服务内容应该在实验开始前由双方明确一般而言客户方实验前应提出需要什么样的结果与分析例如是简要还是详细的描述实验结果需要实验数据否图片的数量与规格等如果为双盲试验或有第三方参与则事先申明近年来随着技术的发展和各种特异性抗体的出现使许多疑难肿瘤得到了明确诊断在常规肿瘤病理诊断中5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的诊断尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时准确率可达50%-75%
免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面
⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断
⑵确定转移性恶性肿瘤的原发部位
⑶对某类肿瘤进行进一步的病理分型
⑷软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的分类因其种类多组织形态相像有时难以区分其组织来源应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的
⑸发现微小转移灶有助于临床治疗方案的确定包括手术范围的确定
⑹为临床提供治疗方案的选择在镜检前可以通过相关资料查询抗体的表达部位细胞间质细胞浆细胞核以及在其中的多个部位表达如MPO抗体表达在细胞膜细胞浆核膜细胞核上和表达组织如VWF抗体在血管壁上表达呈现环形
在显微镜下观察时先在4倍镜下查找组织及其范围然后查看整个组织确定阳性产物的表达部位然后将阳性产物表达部位置于视野正中央换高倍镜观察细胞凋亡原理正常凋亡细胞通过检测凋亡细胞DNA片段进行染色正常的人为造成凋亡的细胞很少能够被染色以复染便于从形态学上分辨评估正常细胞和凋亡细胞
首先确定目标凋亡细胞的组织部位如眼球组织由于玻璃体结构内没有细胞核因此看不到凋亡在整个组织的最外面有单层视网膜细胞因此只能在最边缘查看凋亡细胞的阳性产物HEMassonONisslMallory等染色方法很少有掉片现象免疫组化和细胞凋亡检测我们采用专门购买的由于整个实验流程比较长在实验过程中产生掉片是很正常的现象对于容易掉片的组织如脑组织皮肤组织等掉片有时候是不可避免的做过病理实验的人都知道实验看似容易但真想把它做好还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验我从事病理实验已有6年多了在这段时间里我做过许许多多病理相关实验刚开始啥也不懂一味按照网上操作流程来做但做的结果往往并不是十分理想最终结果未能达到预期的效果经过一段时间的浏览和学习从一些在论坛内学习请教并结合实践操作我经历了初级查找资料和摸索方法中级问题求助和不断总结高级难题解答和经验分享这三个阶段也学到了不少知识积累了很多宝贵经验与大家一起分享下从我接触的很多本科生和研究生中发现他们的确是免疫组化新手他们只注重如何做和最终的结果但对为什么这样做不太感兴趣他们常按照网上所说的方法摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了结果不求上进更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了当然免疫组化对于我来说做过很多但也不能说什么都会只不过我做的多了失败多了和思考多了可能比新手多了解一些其中的诀窍拿来与大家进行分享此外我个人经验不可能面面俱到还需要更多有经验的高手一起分享纠正和补充在这里我需要感谢中华病理网丁香通小木虫论坛给我很大的帮助还有上海舜田生物技术人员老师给我实验很多指导和帮助让我受益匪浅1其实免疫组化我个人感觉方法和操作都不是很难关键是结果出现异常时该如何去解决我认为首先需要掌握好免疫组化实验的原理知道每一个操作步骤的目的这样你才能大胆地去改革和纠正一些错误的步骤如抗体孵育条件主要是抗体浓度温度时间这三者一般是相互成反比的其中浓度是最重要的先决条件温度决定反应的速度时间决定反应的量比如温度有4℃37℃我推荐4℃最佳反应最温和背景较浅而37℃反应速度较快时间较短室温我不太提倡除非你每次都把环境温度控制在一定的范围否则尽量选择前两者
2定位和定性是免疫组化最大的优势相比于其他蛋白检测方法免疫组化具有定位较直接准确定性灵敏度高是定位检测分析首选方法尤其对于有些的转位研究十分有用
3免疫组化结果的前提是高质量的染色切片免疫组化结果也能定量分析但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下分析最为准确这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件
4免疫组化实验一定要设置阳性和阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应其余步骤均一致前者是排除方法和实验系统有无问题后者是排除有无一抗外的非特异性染色
5免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片我发现许多研究生把网上或者说明书摸索的反应条件浓度方法步骤重复运用于同一性质的切片和同一种抗体做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法更换一种抗体后居然连二抗的种属来源都拿错了失败往往促进你去思考试验原理和过程成功有时也让自己很自傲
6免疫组化的应用广泛是当前实验研究的最重要方法之一如今发论文时明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难加一些形态学数据或图片老外十分欢迎可能是怕你学术造假吧当然也不能做假阳性或假阴性结果
7实验方法需要动手和动脑经过了反复的动手和动脑把理论原理运用于实践在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决最终把理论与实践融会贯通必要时去各大论坛或者一些知名公司寻求帮助个人感觉上海舜田生物技术支持不错服务质量也很好
下面先介绍下免疫组化的概念和常用方法以便让大家对免疫组化更深入地理解和掌握
概念和常用方法介绍
用标记的抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性定位或定量研究这种技术称为免疫组织化学immunohistochemistry技术或immunocytochemistry技术
根据和化学显色原理组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合再利用一抗与标记生物素等的二抗进行反应前者再用标记辣根HRP或AKP等的抗生物素如链霉等结合最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量
1按标记物质的种类如酶主要有和碱性磷酸酶胶体金等可分为免疫荧光法放射免疫法免疫酶标法和免疫金银法等
2按染色步骤可分为直接法又称一步法和间接法二步三步或多步法与直接法相比间接法的灵敏度提高了许多
3按结合方式可分为抗原-抗体结合如过氧化物酶-抗过氧化物酶PAP法亲和连接如素-生物素-过氧化物酶复合物ABC法链霉菌-过氧化物酶连结SP法等其中SP法是比较常用的方法聚合物链接如即用型二步法此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测
4目前几种常用免疫组化方法简单介绍
1免疫荧光方法
是最早建立的免疫组织化学技术它利用抗原抗体特异性结合的原理先将已知抗体标上以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原在荧光显微镜下观察当抗原抗体复合物中的受激发光的照射后即会发出一定的荧光从而可确定组织中某种抗原的定位进而还可进行定量分析由于免疫荧光技术特异性强灵敏度高快速简便所以在临床病理诊断检验中应用较广
2免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后于60年代发展起来的技术基本原理是先以的抗体与组织或细胞作用然后加入酶的底物生成有色的不溶性产物或具有一定的颗粒通过光镜或电镜对和细胞内的各种抗原成分进行定位研究是目前最常用的技术该方法与免疫荧光技术相比的主要优点是定位准确对比度好染色标本可长期保存适合于光电镜研究等免疫酶标方法的发展非常迅速已经衍生出了多种标记方法且随着方法的不断改进和创新其特异性和灵敏度都在不断提高使用也越来越方便目前在病理诊断中广为使用的有ABC法SP三步法即用型二步法检测系统等
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为胶体金是指金的它能迅速而稳定地吸附蛋白对蛋白的生物学活性则没有明显的影响因此用金标记一抗二抗或其他能结合免疫球蛋白的分子如葡萄球菌A蛋白)等作为就能对组织或细胞内的抗原进行定性定位甚至定量研究由于胶体金有不同大小的颗粒且胶体金的高所以特别适合于的单标记或由于胶体金本身呈淡至深红色因此也适合进行光镜观察如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察
5被检测的物质
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原如蛋白质酶激素核酸及病原体等都可用相应的抗体进行检测
免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性因此免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示如角蛋白keratin显示上皮成分显示淋巴细胞成分只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应
在应用免疫组化的起始阶段由于技术上的限制只有直接法间接法等敏感性不高的技术那时的抗体只能稀释几倍几十倍现在由于ABC法或SP三步法的出现使抗体稀释上千倍上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合这样高敏感性的抗体抗原反应使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作
3定位准确形态与功能相结合
该技术通过及呈色反应可在组织和细胞中进行抗原的准确定位因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察这样就可以进行形态与功能相结合的研究对病理学领域开展深入研究是十分有意义的
7从蛋白水平检测角度免疫组化技术与Western blottingELISA的异同
1Western blotting
蛋白质也是利用抗体抗原反应原理结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法与免疫组化技术相比定量可能更加准确当然Western blotting也可定性和定位通过提取膜蛋白或核蛋白胞浆蛋白分别检测其中抗原含量进而间接反映它们的定位但敏感性远远低于免疫组化技术
酶联免疫吸附试验也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测与免疫组化技术相比定量最准确是分泌性蛋白检测首选方法之一
下面介绍下免疫组化方法的具体实验流程步骤
实验流程简介
一SP三步法
1石蜡切片常规脱蜡至水
2)0.3%或3%H2O2去离子水无色液体孵育10-30分钟以灭活内源性过氧化物酶活性
3蒸馏水冲洗PBS浸泡5分钟
4候选步骤采用抗原修复建议30分钟内4次中火酶修复方法自然冷却再用3分钟×3次.
5血清封闭室温15-30分钟尽可能与二抗来源一致倾去勿洗
6滴加适当比例稀释的一抗37℃孵育2~3小时或4℃过夜最好复温PBS冲洗3分钟×5次
7滴加生物素标记的二抗室温或37℃孵育30分钟-1h
8)PBS冲洗3分钟×5次
9滴加SP链霉亲和素-过氧化物酶室温或37℃孵育30分钟-1h10)PBS冲洗3分钟×5次
11显色DAB等
12自来水充分冲洗
13可进行复染脱水透明
14选择适当的封片剂封片
二即用型二步法
1脱蜡水化组织切片
2根据所应用的一抗的特殊要求对组织切片进行预处理
3)0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟以阻断内源性过氧化物酶PBS或TBS冲洗
4滴加一抗室温或37℃孵育30~60分钟或4℃过夜PBS或TBS浸洗3分钟×5次
5滴加enhangcer增强剂37℃30minPBS或TBS浸洗3分钟×5次
6滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体室温/37℃孵育30分钟-1hPBS/TBS冲洗3分钟×5次
7应用DAB溶液显色
8蒸馏水冲洗复染脱水透明封片
三免疫荧光技术略
1酶免疫组化的关键环节
固定的目的是①防止标本从玻片上脱落
②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果
③固定的标本易于保存固定剂的选择一般用4%但睾丸组织眼可能要选用Bouins液或mDF液效果较好
2脱水石蜡包埋和制片
脱水用梯度乙醇由低到高充分脱水对组织要完全切片时刀片要干净和锋利否则容易裂片和脱片等
3脱蜡和水化
这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应脱蜡可以先60℃20min然后立即1-3分别10min这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的但当天制好的切片一般先60℃3-4h水化用梯度乙醇由高到低若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全而产生非特异性背景着色
由于组织中部分抗原在或固定过程中发生了蛋白之间交联及的封闭作用从而失去抗原性通过抗原修复使得细胞内抗原决定族重新暴露提高抗原常用的修复方法从强到弱一般分为三种高压修复微波修复胰酶修复修复液也分为若干种具体的可以查阅相关资料大量的中性的高pH的等我们实验室一般用微波修复中火6min*4次效果不错注意微波修复后自然冷却30min左右只要你觉得修复液的温度达室温即可
目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应一般用Triton X-100蛋白酶k等通透液如Triton X-100可以溶解细胞核膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内故在细胞免疫组化时尤为推荐使用这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合在免疫组织化学&10um厚切片和中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂在膜上打孔同时也是一种去污剂一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可而前者终浓度是0.5%-1%石蜡切片4um左右可以不通透因为细胞已经被切开了
6灭活内源性过氧化物酶和生物素
在传统的ABC法和SP法中免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰必须用和素等进行灭活灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点可以10min左右而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间一般10~30min用甲醇配置过氧化氢比或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用过氧化氢孵育时间过长易引起脱片现用现配配好后4℃避光保存不过现在已有第二代即用型免疫组化试剂盒避免内源性生物素的干扰推荐使用
组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合造成后续结果的假阳性封闭血清一般是和二抗同一来源的血清中动物自身的抗体预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合也可以用小牛血清BSA羊血清等但不能与一抗来源一致一般室温10-30min但也要防止封闭过度
8一抗和二抗浓度和孵育时间
一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要包括孵育时间温度和抗体浓度一抗孵育温度有几种4℃37℃其中4℃效果最佳孵育时间这与温度抗体浓度有关一般37℃1-2h而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min具体条件还要摸索
二抗孵育条件二抗一般室温或37℃30min-1h具体时间需要摸索而浓度一般有工作液若是浓缩液还要摸索浓度但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下然后去摸索一抗浓度和孵育时间建议一抗反应在4℃最佳反应温和但时间最好超过16~24h
其实许多实验室抗体就用一般PBS即可但专用的抗体中除PBS成份外还加了防腐剂BSA稳定剂等组份对抗体的多次回收利用较好正因为这种原因我一直用国产的专用抗体一段时间在更换新抗体时实验结果出现了阴性结果提示可能一抗没有结合最后从抗体浓度和孵育时间封闭时间等原因排除后发现是新抗体稀释液的PH值而使不佳终而出现假阴性结果
10切片清洗浸洗冲洗和漂洗
为了防止一抗二抗等试剂残留而引起非特异性染色所以适当地加强清洗延长时间和增多次数尤为重要我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均为5次*5min
注意①单独冲洗防止交叉反应造成污染
②温柔冲洗防止切片的脱落我喜欢用浸洗方式
③冲洗的时间要足够才能彻底洗去结合的物质
④PBS的PH和离子强度的使用和要求这方面我有惨痛教训当时我买的抗体稀释液结果背景一片黄未见特异性染色建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M中性及弱碱性条件PH7-8有利于免疫复合物的形成而酸性条件则有利于分解低离子强度有利于免疫复合物的形成而高离子强度则有利于分解
11)DAB显色
背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定DAB显色时间不是固定的主要由显微镜下控制显色时间到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗DAB显色时间很短如几秒或几十秒就出现很深的棕褐色这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间此外若很短时间就出现背景很深还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全需要延长封闭时间DAB显色时间很长如超过十几分钟才出现阳性染色一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短最好一抗4℃过夜另一方面就是封闭时间过长
目的是形成细胞轮廓从而更好地对目标蛋白进行定位经常用复染胞核染料注意复染时间要看当时的室温溶液的新旧目标抗原的定位等情况一般数秒-数分钟胞浆蛋白可以适当时间长一点而胞核蛋白则要短不过这个如果染色不理想可以补救的方法是染色深则分化时间稍长些即可染色浅则再置于中染色即可盐酸酒精是分化氨水是返兰作用不同片子复染完后流水振洗然后置于盐酸酒精秒一定动作要快后拿出流水振洗在放入氨水中返兰即可
为了长期保存我们一般用中性树胶等封片避免产生气泡方法是直接在组织上滴一滴封片液然后一手拿住盖片某一拐角而另一手拿对面的那个拐角接近封片液近端的拐角先降低直至接触到液体时为止当发现液体接触面在不断弥散时则可以缓慢降低另一拐角这样一般不会产生气泡
2免疫荧光方法中的重要环节
1冰冻切片制备
建议用新鲜组织否则组织细胞内部结构破坏易使抗原弥散选用干净锋利的刀片组织一定要冷冻适度等防止裂片和脱片严重
2组织切片固定
切好片风干后立即用冰等进行固定5-10min尤其要较长时间保存的白片一定要及时固定和适当保存
为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合需要在一抗孵育前先用血清与二抗来源一致封闭减弱背景着色血清封闭的时间是可以调整的一般10-30min
4一抗孵育条件
在免疫组化反应中最重要包括孵育时间和抗体浓度一抗孵育温度有几种4℃室温37℃其中4℃效果最佳孵育时间这与温度抗体浓度有关一般37℃1-2h而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min具体条件还要摸索
5二抗孵育条件
二抗一般室温或37℃30min-1h具体时间需要摸索而浓度一般有工作液若是浓缩液还要摸索浓度切记要避但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下然后去摸索一抗浓度和孵育时间最后标记的二抗随着保存时间的延长可能后有大量的游离荧光素残留需要注意配制时小包装和并进行适当的离心
目的是形成细胞轮廓从而更好对目标蛋白进行定位一般常用DAPI复染
为了长期保存我们一般用缓冲甘油等封片此外还有专门的抗荧光萃灭封片液避免产生气泡方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液然后一手拿住盖片某一拐角而另一手拿对面的那个拐角接近封片液近端的拐角先降低直至接触到液体时为止当发现液体接触面在不断弥散时则可以缓慢降低另一拐角这样一般不会产生气泡
为了防止一抗二抗等试剂残留而引起非特异性染色所以适当地加强清洗延长时间和增多次数尤为重要我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均为5次*5min
⑴单独冲洗防止交叉反应造成污染
⑵温柔冲洗防止切片的脱落我喜欢用浸洗方式
⑶冲洗的时间要足够才能彻底洗去结合的物质
⑷PBS的PH和离子强度的使用和要求这方面我有惨痛教训当时我买的抗体稀释液偏酸结果背景一片黄未见特异性染色建议pH在7.4-7.6浓度是0.01M中性及弱碱性条件pH7-8有利于免疫复合物的形成而酸性条件则有利于分解低离子强度有利于免疫复合物的形成而高离子强度则有利于分解
有条件的话最好立即拍照若不能及时拍照也要封好片和用指甲油封固保持避光和湿度使用显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作不要随意改变程序应在暗室中进行检查防止紫外线对眼睛的损害在调整光源时应戴上防护眼镜检查时间每次以1~2h为宜超过90min超高压汞灯发光强度逐渐下降荧光减弱标本受紫外线照射3~5min后荧光也明显减弱或褪色激发光长时间的照射会发生荧光的衰减和现象所以最多不得超过2~3h荧光显微镜光源寿命有限标本应集中检查以节省时间保护光源天热时应加电扇散热降温新换灯泡应从开始就记录使用时间灯熄灭后欲再启用时须待灯光充分冷却后才能点燃一天中应避免数次点燃光源关闭汞灯至少在开启15-30分钟后标本染色后立即观察因时间久了会逐渐减弱若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存可延缓减弱时间防止封裱剂蒸发使用的玻片等载体都必须厚度均匀无明显的自发荧光如果使用油镜还必须保证镜油为无荧光镜油电源最好装稳压器否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命也会影响镜检的效果
3免疫组化和免疫荧光结果分析见第一场试验讲座
案例一 DAB染色后切片着色一片黄/背景深
背景奥运会期间我们课题组研究生都在实验室做实验许多从北京购买的试剂买不到对我们的许多实验产生了很大的影响我以前一直用中杉金桥的SP三步法染色试剂盒效果不错在奥运会期间我准备做同批实验分不同批次酶免疫组化实验第一批组化实验结果很好抗体浓度感觉比较合适Santa Cruz公司1200等做第二批时发现封闭血清不够了为了保证实验顺利进行我又从福州迈新顶了一个SP试剂盒同时抗体也不够了我又重新从博士德公司买了一小瓶10ml从第二批实验开始组化实验结果一直显示强背景着色染色很难辨别后来我将标本拿到上海舜田生物去做做了效果很不错于是我就请教了他们公司从事病理30多年经验的老师她告诉我应该如何去分析和解决问题很快我就找到了思路结果问题终于解决了
问题及其解答产生组织切片非特异性染色的原因有哪些如何解决
1抗体孵育时间过长抗体浓度高易增加背景着色这可通过缩短一抗/二抗孵育时间稀释抗体来控制这是最重要的一条
2一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色建议试用看看
3内源性过氧化物酶和生物素在肝脏肾脏等组织含量很高含血细胞多的组织需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色
4非特异性组分与抗体结合这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果
5 DAB孵育时间过长或浓度过高
6 PBS冲洗不充分残留抗体结果增强着色在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要
7标本染色过程中经常出现干片这容易增强非特异性着色
我的实际解决方案以上的分析可能对于初学者还是不容易的下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享交流和讨论
1首先排除抗体孵育条件一般来说着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的由于用SP法已经做出来过一次且效果不错因此对于同样组织的同一抗原进行分析这种因素可以先排除
2其次DAB孵育时间是否太长做出来那一次我是孵育8min后来也是8-10min我单独做了一次实验来排除该因素结果孵育25min时先出现背景而特异性染色较浅故这不符合常理一般先出现特异性染色然后随着时间的延长会出现非特异性背景着色
3最后血清封闭的问题以前我一般孵育15-30min所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h其它条件同做出来的那一次结果也一样背景着色很深
4此外我在改进的同时也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数甚至完全参照说明书来进行操作我以前一般一抗4℃过夜且室温复温45min二抗37℃30minSP反应37℃ 30min以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果我冷静地分析了一下整个实验流程与第一次做出来相比只有两个地方做了改动因血清不够而更换了不同厂家因抗体用完而重新买了抗体稀释液
5我用PBS替代一抗我以前还回收抗体自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂其它步骤和组织切片完全与第一次做出来的一致包括血清也是老内剩余的一点奇迹出现了结果很好因为抗原抗体反应除温度抗原/抗体浓度外然后就是pH值于是我测了新抗体老抗体稀释液和PBS的pH值结果是前者偏酸性&60而后两者均在75左右
6看来主要祸根是抗体的pH值出问题了于是我又用PBS替代抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化结果还是没有做出来背景很深这真把我搞惨了难道还有什么原因吗通过仔细分析一抗一定是结合上去了老SP试剂盒结果很好问题是二抗没有结合上去也不对因为最后背景很深这说明二抗可能也结合上去了DAB孵育时间现在只用15min也是背景深而特异性染色浅那我又怀疑封闭血清了
7我做了两张切片一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清其余试剂二抗SP均用新试剂盒提供的结果是前一张效果很好而后一张能够看到特异性染色但背景太深拍照效果不佳看来封闭血清也是罪会祸首之一结果分析显示抗体的PH值偏低和封闭血清的失效导致了我的免疫组化结果的不佳望大家在以后的组化实验中也要注意这两个不太引人注意的关键问题惨痛的教训值得引以为鉴
案例二DAB染色后切片着色呈阴性结果
背景其实免疫组化在DAB染色后一般有四种情况阳性染色效果很好阴性染色非特异性染色很深阴阳脸染色不均匀而阴性染色是许多初学者经常遇到的头疼问题我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化听说步骤不难跟我后面做了几次之后就自己开始做了连续做了三次结果均是阴性染色很扫兴不知是什么原因导致的后来我还是请教了上海舜田生物老师她免费提供给我我很大的帮助解决问题的思路也逐步清晰
问题及其解答免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些
1抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误不知抗体是进口的还是国产的工作液怎么这么高也没能做出阳性结果另外不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果抗原抗体反应有前带和后带效应必须摸索最佳浓度
2抗原修复不全对于固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位以利于与抗体结合建议微波修复用高火4次*6min试试有人做过实验这是最佳的时间和次数若不行还可高压修复
3组织切片本身这种抗原含量低
4血清封闭时间过长
5DAB孵育时间过短
6细胞通透不全抗体未能充分进入胞内参与反应
7开始做免疫组化我建议你一定要首先做个阳性对排除抗体等外的方法问题
我的实际解决方案
1首先排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体
⑴抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度一般切片室温保存超过3-6个月可能切片内的抗原丢失很严重有文献支持此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证蜡块需要低温保存
⑵石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭这需要通过抗原修复来充分暴露从而增加抗原抗体结合反应提高阳性率我一般用6min*4次中火微波抗原修复用枸橼酸钠缓冲液
⑶组织切片中本身抗原含量的多少这方面我有教训的我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定用1200一抗效果很好但我用1200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测几乎呈阴性后来证实是因为两者抗原含量相差甚远则一抗也要适当提高浓度
2其次检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适
⑴一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果因为灵敏度低但好一抗的species reactivity中无检测组织的种属这是比较常见的错误一抗选择rat而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果
⑵抗体孵育时间过短容易导致阴性结果一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min二抗我一般37℃30min我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书
⑶抗体浓度过低这是阴性结果的最可能原因必须提高我一般初次做一种新抗体喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次然后决定是向高还是低方向摸索一般先决定二抗的浓度工作液就好办了直接滴加重点摸索一抗的最适浓度注意免疫反应中存在前带和后带效应这提示不是浓度越高阳性率就越高反之亦然
⑷重要原因排除之后也不要忽视抗体的质量原装抗体一般比较稳定效果较好而进口分装次之工作液可能要注意质量问题
3同时DAB的孵育时间可能要适当延长在镜下观察有时可延长至30min但一般3-10min最好此时背景也较浅否则说明抗体浓度不合适
4最后血清封闭时间也可相应缩短一般10-30min但这个时间可以调整封闭主要是降低切片的总体背景着色
5此外细胞通透也不可忽视许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透因为切片时可能已经把细胞切开了但对于胞核蛋白建议还是通透一下促进抗体等试剂充分进入参与反应
6以上原因都是针对实际中常见原因来进行分析的前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题还有抗体的pH值过低等其它原因的干扰总之要想把免疫组化做好可能每一个环节都很重要但也存在主次之分出现问题了需要通过先排除主要的再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在
案例三石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果
背景因实验需要于日初次做肝脏组织ZO-1一种胞膜蛋白蛋白免疫荧光染色以前我对酶免疫组化非常熟悉在丁香园子内也有不少置顶贴和精华帖但免疫荧光一直还没做过原理知道但细节不太了解我先用石蜡切片做了5次结果一直不理想表现为未见特异性强染色近几日在舜田生物老师的帮助下我又切了冰冻切片做了2次终于基本成功了在这个过程中我对免疫荧光染色技术有了全新的认识而前些天发出免疫荧光求助贴回复的很少所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论不妥之处敬请指正有人会问酶免疫组化做的好好的为何要做免疫荧光其实这也是我以前思考的难题现在我认为可能胞膜蛋白含量不高用普通免疫免疫组化可能做不出来需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测我是看许多外文文献都是这样做的因此选择免疫荧光染色
问题及其解答如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色
1非特异性染色产生原因及其解决方案
⑴游离残留在二抗中一部分未与蛋白质结合形成了聚合物和衍化物而不能被透析除去二抗配置时用透析法或层析法分离标记的二抗和游离的二抗购买高质量高纯度的二抗
⑵抗体以外的血清蛋白与结合形成荧光素脲蛋白可与组织成分结合
⑶组织抗原封闭不全除去检查的抗原以外组织中还可能存在类属抗原如Forssman氏抗原可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合延长血清封闭时间
⑷从组织中难于提纯抗原性物质所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体以致容易混淆
⑸抗体分子上标记的分子太多这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色
⑹不纯标本固定不当等
⑺一抗和二抗孵育条件和浓度不合适调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳
⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分增加清洗次数和延长清洗时间
2阴性染色产生的原因有
⑴一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥
⑵提前衰退质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项
⑶血清封闭时间过长
⑷抗体PH值不合适影响
⑸组织切片不平裂片或脱片很严重易引起大块阴性着色
⑹组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散易引起本来表达的部位阴性染色或弱着色
⑺荧光显微镜不会使用激发波长选择错误
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