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【求助】QPCR，DNA做模板，不加模板的阴性对照扩增的ct值和怎么和加模板的差不多？
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这个帖子发布于3年零252天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
最近做Q-PCR, 模板用的基因组DNA，目的是检测家族性帕金森病parkin基因的exon dosage杂合突变。但是做标准曲线总是绘的乱七八糟，做了不加模板的阴性对照，结果ct值和加了模板的ct值差不多，琼脂糖跑胶阴性对照的亮度和其他孔p的亮度一样的。肯定是DNA污染了，但是我换了新的水，枪头用的灭菌的，阴性对照的孔先加样并盖上盖子，然后再做其他加模板的孔。其他试剂mix也用过新打开的也没用。大家有没有做过这方面的，是不是DNA污染太容易了，顺便提一下，我们实验室用基因组DNA做PCR的特别多，是不是环境啊，枪什么的都被污染了，还有什么好办法吗？买DNA free的枪头会不会好一点呢？
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你查一下是不是引物浓度的问题。
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双石104 你查一下是不是引物浓度的问题。应该不是吧，扩出来的都是目的，而不是引物二聚体，引物量是根据mix说明书来的。
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梦飞翔荣 最近做Q-PCR, 模板用的基因组DNA，目的是检测家族性帕金森病parkin基因的exon dosage杂合突变。但是做标准曲线总是绘的乱七八糟，做了不加模板的阴性对照，结果ct值和加了模板的ct值差不多，琼脂糖跑胶阴性对照的亮度和其他孔p的亮度一样的。肯定是DNA污染了，但是我换了新的水，枪头用的灭菌的，阴性对照的孔先加样并盖上盖子，然后再做其他加模板的孔。其他试剂mix也用过新打开的也没用。大家有没有做过这方面的，是不是DNA污染太容易了，顺便提一下，我们实验室用基因组DNA做PCR的特别多，是不是环境啊，枪什么的都被污染了，还有什么好办法吗？买DNA free的枪头会不会好一点呢？还是考虑污染了。dna其实也不是那么容易污染的。不过一旦污染有时候又很讨厌可以考虑买更高级别的枪头。枪也是有可能有气溶胶污染的，可以试着拆一下枪用水和酒精做清洗。另外还可以考虑换个地方做实验，全部都用新的试剂，包括重新订引物等。
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reyesa 还是考虑污染了。dna其实也不是那么容易污染的。不过一旦污染有时候又很讨厌可以考虑买更高级别的枪头。枪也是有可能有气溶胶污染的，可以试着拆一下枪用水和酒精做清洗。另外还可以考虑换个地方做实验，全部都用新的试剂，包括重新订引物等。恩，我试试，谢谢啦
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觉得还是气溶胶污染的可能性更大一些。这种污染是最讨厌的。要么最近一段时间都不要做QPCR了，不太现实是吧？那就只能买一些专门去除DNA污染的喷剂，整个实验室（包括桌面，空气中）中都喷一些，过几天后，所有东西都换掉，再试试。另外，如非必须，强烈建议扩完QPCR后不要打开封膜，这种PCR产物的污染是导致气溶胶污染的最大原因。
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后来发现是引物污染了，而且是公司原因。
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梦飞翔荣 后来发现是引物污染了，而且是公司原因。 怎么发现的，最近也要开始做QPCR，可以交流下吗
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在下次做实验时考虑加入UDG酶，看看结果会不会好些
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后来发现是引物污染了，而且是公司原因。 我也想问问楼主怎么发现的。。。
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后来发现是引物污染了，而且是公司原因。
怎么发现的？
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所有用到的试剂跑一下凝胶电泳就知道啦啊。。。看条带大小啥的。。。
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如何鉴定一种DNA样本中的不同样本类型所占百分比
现在遇到一个技术难点，举个例子就是我混合两种不同的质粒A和B，质粒之间只存在一个点的差别，我用定量的方式确定两种质粒的浓度，然后进行混合，混合方式为A/(A+B)=5%，这里的百分比是浓度比。现在问题来了，对于混合后的样本，我想鉴定它到底是不是按我预想的混合成5%了，有什么方法吗？希望大神能够解答，谢谢
southern的话是如何做到定量的啊，我需要精确定量到5%，这个能实现吗？
我的模板是已经混合好的，想通过一种方式直接将混合物中两种组分都精确定量。你说的A引物检测B,B引物检测A我不太能理解，从结合效率上，这样两种引物对于单碱基突变模板的Ct变化最大在3左右，当然这是我自己做的不算定义，然后只有引物不同的话也无法收到两条扩增曲线啊，望深度指导。
以下都是乱想的：
1.酶切试试呢，在突变点上找个酶切位点，别的地方再找一个，做双酶切，无突变的就成线性一条带，有突变的变成两条，再用quality one 算下浓度（双酶切是因为都变成线性化的状态比较好吧）
这就是我当初的设想，酶切后混合样本，然后红色和绿色引物组能分别检测其中的一种，由于两种质粒都被酶切成线性的，所以互相之间没有干扰，即使是混合以后，之后就可以按照Ct值大概的换算一下，但是实际情况是，即便是酶切结束了，也不能避免交叉检测为阴性，很蛋疼。
未命名.JPG
不是只有一个点突变吗？怎么画成这个图的？而且即使你要用到QPCR，两对引物是不能直接进行比较的，扩增效率和产物长度不同，真要进行比较，理论上要用绝对定量，或者双标准曲线法
这个难度就比较大了，这玩意可以确定拷贝数，但技术要求比较高
是只有一个突变，然后向通过两种酶切把两种分开，上面是酶切示意图，我也觉得是不能直接比较，但实在是没啥好方法了，当然这个也没成功，哈哈
绝对定量是找个标准品分别对比吗？双标准曲线法不太能理解
恩恩，这个我也稍微看了一下，感觉定量手段和荧光PCR差不太多，而且我这个整体只有一个点不一样，剩下的都一样，估计也没法用电泳给他们两个跑开
双标准曲线是我自己想的，我觉得通过标准曲线得到准确的扩增效率，通过校正(1+E)^CT后再除以扩增片段长度，也可以得到相同的效果，当然两个引物需要手动设置相同的阈值
这种的我也试过，甚至试过通过最后的峰高、Ct值、扩增效率去推算初始模板量，不过感觉出入还是挺大的。
我想两种质粒的话一个点突变的区别，通过定量得到浓度然后去混合，这种混合结果应该是普遍被认可是正确的吧，如果是可以考虑说服上层不进行验证了，毕竟Qpcr也不一定能达到这种检测精度。
我也有过这种需求，所以当初也想了一些办法，最后还是放弃了，我是发现了某基因的两种转录本，也是SNP的差别，想确定他们之间拷贝数的比值
看来这个目前还是空白啊，我翻了好多文献也没看见，感觉要拿诺贝尔奖了:D
我也有这样的问题，不知道测序可不可以呢，或者飞行质谱？这也是从华大客服那问来的，希望多交流
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【求助】GAPDH的溶解曲线很差，CT值很高，是怎么回事啊？
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这个帖子发布于3年零11天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
以前用的大鼠的细胞，GAPDH溶解和扩增都很好，这次用的是脊髓，GAPDH扩增曲线和熔解曲线在下面，CT值31多，怎么回事啊？和RNA提纯有关系吗？用的是ABI 7500，两步法，退火62度32秒。需要怎么改进啊？
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这是改为三步法以后跑出的结果。出现了引物二聚体是吗？ct 27左右。条件是：95度15min，95度10s，55度30s，72度32s，40个循环。请教一下，还要怎么改进才能消除双峰呢？谢谢！
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我的也和你的一样啊。。。
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你提RNA测纯度吗？感觉RNA降解了。模板质量不高啊。
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我前几天做了大鼠的肺组织，也是GAPDH值很高，25多，老师说如果定量PCR结果CT值&20，很有可能是cDNA降解了，所以我要重新逆转录试试看，暂时因为试剂没到，还没重做
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Ct值在15-30之间应该都可以的，出现双峰最好是重新设计一对引物，也可以提高退火温度试试，能不能把你的出现双峰的引物发给我看看？
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【求助】real time PCR，溶解曲线较好，结果跑胶较好，但是ct值太高，是何原因？
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丁香园中级站友
这个帖子发布于4年零237天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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最近做IL 17 Q pcr的表达遇到了难题，请求帮助。参考文献设计的引物，溶解曲线的TM值在85，单峰，特异性好，重复性好。QPCR的产物拿去电泳，条带清晰，表达较好，符合目的片段的大小。唯一的缺憾是CT值在33~35之间。并且cDNA模板同时进行beta actin的扩增，ct值均在20以下，说明cDNA模板没有问题。1.为什么ct值很高，而跑出的胶条带却很强？如何降低CT值？2.用普通PCR层扩增30循环，无果；而扩增40循环，目标条带亮。说明扩增确实是从30多循环开始的。但是这么高的CT值如何做标准曲线？没有标准曲线的话，这样的结果（ct》30）可以信服么？
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b-act Ct值比较低，不一定说明目的基因Ct值就很低吧。做的是Taqman , or Sybrgreen ? 是否目的基因水平本身就很低？看看ABI的官方解释：问题：
A band is seen on the gel but the analysis does not show any curves. 原因： 1、Wrong settings on the machine. 2、The wrong channel filter was chosen for the fluorophore being used. 3、The machine may be incapable of measuring that dye as well as the reference dye. 4、The light source (Halogen lamp or laser) is not working properly. 见：
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freecell edited on
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freecell b-act Ct值比较低，不一定说明目的基因Ct值就很低吧。做的是Taqman , or Sybrgreen ? 是否目的基因水平本身就很低？看看ABI的官方解释：问题：
A band is seen on the gel but the analysis does not show any curves. 原因： 1、Wrong settings on the machine. 2、The wrong channel filter was chosen for the fluorophore being used. 3、The machine may be incapable of measuring that dye as well as the reference dye. 4、The light source (Halogen lamp or laser) is not working properly. 见： 谢谢freecell！！我用beta actin的目的就是验证操作或是仪器等问题，比如RNA提取是否不合格等，但是actin的结果和我之前的其它实验的ct值比较接近，首先排除了cDNA模板的事情，或许是否也能排除仪器设置的原因?多次重复实验过后，我也怀疑IL17是否本身就表达过低呢？但是这个值也是从疾病模型动物组织获得的，没有用正常动物。不知道ct值在33~35之间的值是否可信？ct值这么高，标准曲线是做不出来的，这样的结果可信么？（溶解曲线和电泳结果都非常好，尤其是电泳结果非常亮，我都想做普通的RT-PCR半定量算了）
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我做的是SYBGREEN，求指点。已经设计N对引物了，跑胶都很好，就是ct值一直30以上，头一次遇到这样的情况。
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我觉得很正常没有问题，actin没有问题，溶解曲线也正常，就是说明本来表达量在这种动物这种细胞中就低一些。如果不放心的话，可以补充以下实验作辅助说明：需要有阳性对照，找个本来就表达比较高的动物或细胞 （对你的实验来说，可能WT动物模型组比较好，如果表达量比较好的话），同样条件同样作qPCR，同时做标准曲线验证说明引物和计算都没有问题；另外Ct在33-35的话，也可以考虑作标准曲线，2倍稀释，5个浓度， 另外如果可能的话，加大上样量；还有就是在计算Ct的时候，可以适当调整threshold，可以把Ct整体降低一点（根据actin, 别讲太多，保持actin在15以上就好），不过意义不大，也就是看着好看而以总之根据你的描述，试验没有什么问题，放心继续就是~~~供参考！祝好运！
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SmallDonkey 我觉得很正常没有问题，actin没有问题，溶解曲线也正常，就是说明本来表达量在这种动物这种细胞中就低一些。如果不放心的话，可以补充以下实验作辅助说明：需要有阳性对照，找个本来就表达比较高的动物或细胞 （对你的实验来说，可能WT动物模型组比较好，如果表达量比较好的话），同样条件同样作qPCR，同时做标准曲线验证说明引物和计算都没有问题；另外Ct在33-35的话，也可以考虑作标准曲线，2倍稀释，5个浓度， 另外如果可能的话，加大上样量；还有就是在计算Ct的时候，可以适当调整threshold，可以把Ct整体降低一点（根据actin, 别讲太多，保持actin在15以上就好），不过意义不大，也就是看着好看而以总之根据你的描述，试验没有什么问题，放心继续就是~~~供参考！祝好运！哎呀，居然在这遇见你了！我正在线等啊。。。你们这样的高手来帮我，我就心里有底了。。。明天我按照你说的几个方面去逐一试试！谢啦，我可以安睡了！代问你家小美女和大美女好啊！！
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想问下, 我以前做的,对于这种排除其他原因ct值在三十以上的做q-pcr副孔差异会很大,最后结果还是没法看, 这个怎么处理呀
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