非酒精性脂肪肝动物模型研究纂要[1]90
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非酒精性脂肪肝动物模型研究纂要[1]90
第23卷第4期；2005年4月；中医药学刊；CHINESEARCHIVESOFTRADITI；Vol.23No.4Apr.,2005；文章编号:05)04-0；非酒精性脂肪肝动物模型研究纂要；杨英昕1,毕秀丽2指导:朱培庭1教授；(11上海中医药大学附属龙华医院,上海20003；关键词:非酒精脂肪肝;实验研究；中图分类号:R26619
第23卷　第4期2005年4月中　医　药　学　刊CHINESE　ARCHIVES　OF　TRADITIONAL　CHINESE　MEDICINEVol.23No.4Apr.,2005文章编号:05)04-0647-05非酒精性脂肪肝动物模型研究纂要杨英昕1,毕秀丽2　指导:朱培庭1教授(11上海中医药大学附属龙华医院,上海沈阳药科大学,辽宁沈阳110016)　　关键词:非酒精脂肪肝;实验研究中图分类号:R26619　　文献标识码:B　　脂肪肝病理上主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化三种类型(阶段),临床上则有酒精性脂肪性肝病(AFLD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)之分。为了阐明疾病的发病机制、筛选有效的防治措施,除了通过临床研究对人类患者直接观察外,采用动物模型开展实验研究已成为科研攻关不可缺少的手段。兹介绍如下。1　营养性脂肪肝模型111　大　鼠　大鼠大多为二级(清洁级)动物,根据造模饲料不同又分为:高脂饲料诱发肥胖、高脂血症性脂肪肝　常用高脂饲料的组成有以下几种:范建高等[1]用1%胆固醇、5%猪油、10%玉米油,大鼠自由饮水和进食。食用该高脂饲料3个月时出现轻度肝脂肪变性,体重显著高于正常组。6个月时脂肪肝进展为中度,但未出现肝纤维化,肝组织内甘油三酯的含量显著高于正常对照组。配方中添加玉米油是因为它是一种多不饱和脂肪酸,易发生过氧化反应产生含氢的自由基和醛类等产物,而醛类等可与谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性部位结合,减少对自由基的清除,加重脂质过氧化损伤。此模型的缺点是造模时间长,病变轻。王志平等[2]与此相同的基础饲料基础上加1%胆固醇,5%猪油110%玉米油,连续饲喂4～6周龄,体重为180～200g雄性SD大鼠,8周后在形态学上和血浆中检测的TG、TC,肝组织中TG含量明显增高,造模成功。钟岚,范建高等[3～6]用普通基础饲料加2%胆固醇、10%猪油给雄性SD大鼠食用,12周后。其体重较正常组超重20%以上、肝指数(肝湿重/体重×100%)均显著高于正常组,出现高胆固醇血症,血清转氨酶显著升高。肝脏脂质过氧化损伤增强,但无胰岛素抵抗。肝病理学示在10周时轻度脂肪肝,而无炎症、坏死,故继续高脂饮食。至12周时,出现程度不同的弥漫性肝细胞脂肪变性,且100%存在小叶内炎症,80%出现汇管区炎症。还有汇管区变性及点状坏死或坏死灶,甚至部分坏死灶融合成片,并有2例出现碎屑样坏死,肝组织炎症细胞浸润以单核细胞、淋巴细胞为主,并有一些中性粒细胞浸润,但未见肝纤维化。免疫组化示CYPIIE1表达增强。祁培宏等[7]含5%乳清酸、10%胆固醇、20%猪油、1%蛋黄粉的脂肪乳剂,大鼠灌胃,每次1mL/100g体重,每天1次、用药4周后验证造模成功。肝细胞出现中至重度的脂肪变性,肝指数(肝湿重/体重)、血清TG、TCH、肝脏TG、TCH。血清和肝脏脂质过氧化反应均显著高于正常。该模型与人类肥胖症合并高脂血症性脂肪性肝炎极为相似,其特点为:①体重明显增加;②血清TCH和FFA升高;肝功能转氨酶明显升高,白蛋白、球蛋白基本正常;③肝组织学呈大泡性脂肪变,伴有小叶和汇管区炎症,甚至碎屑样坏死。高脂肪饲料中加入诱发脂肪肝药物　加入甲基硫氧嘧啶　李文彪等[8]用高脂饲料(配制:10%猪油+2%胆固醇+012%甲基硫氧嘧啶+普通饲料至100g)喂养Wis2tar大鼠持续8周,大鼠的血清转氨酶(ALT、AST)显著增博士课题网络高,白蛋白及白/球蛋白比值无显著差异,模型组所有大鼠均出现肝组织不同程度的脂肪浸润(大部分肝脏外观呈黄红或黄白色),且100%存在小叶内炎症,75%存在汇管区炎症、变性及点状坏死,但未见肝纤维化及硬化结节。脂肪变细胞以中央静脉周围较明显,呈极度肿胀,体积较正常肝细胞明显增大,胞浆内充满大量脂肪空泡,肝窦狭窄。马晚燕用[9]高脂调料(8613%基础饲料,115%胆固醇,7%猪油,012%丙基硫氧嘧啶,5%蛋黄粉)喂养,健康纯系体重(150～200)gWistar雄性大鼠,每日1次按l0mL/kg剂量灌服52°白酒连续8周。造模组大鼠共死亡5只。成功地复制了与人类脂肪肝病因、病理特征极为相似的以慢性脂肪肝、脂肪性肝炎为主要病理表现的大鼠脂肪肝动物模型。脂肪肝因脂质过氧化而致MDA增加,引起膜流动性降低,肝细胞微粒体、线粒体损伤,以致脂肪酸p氧化减少,肝细胞脂肪代谢、能量转换及酒精代谢障碍,从而形成恶性循环加重肝损伤。加入胆盐　刘英宏等[10]用高脂饲料(基础饲料93175%,猪油5%,胆固醇1%,胆盐0125%)喂养健康Wistar雄性大鼠9周。肝细胞核固缩,胞浆内脂滴增多。中医药　647学刊细胞器分布不均、糖原减少、窦界面微绒毛受损,肝窦内质细胞肿胀、胞质疏松,胞膜受损。孙桂菊等[11]用高脂饲料(9318%基础饲料、1%胆固醇、5%猪油、012%胆盐)喂养体重200～250g雄性wistar大鼠连续60d,血清甘油三酯和胆固醇的含量均增高、而高密度脂蛋白胆固醇的收稿日期:作者简介:杨英昕(1970-),男,2003级博士研究生。中　医　药　学　刊含量则下降。肝脏整体略显肿大,呈不同程度的浅黄色,质地较软,肝脏病理切片HE染色镜下观、肝细胞可见典型脂肪变性。该组动物肝脏脂肪变性中度和重度占80%、轻度变性占20%。杨牧祥等[12]用高脂饲料即胆固2005年第23卷致。郑新梅[18]用鹌鹑按配制而成的高脂饲料:基础饲料8819%,猪油10%,胆固醇1%,丙基硫氧嘧啶011%。喂服10d。第11d起,除空白组外,其余各组灌胃给药,共30d。高脂饮食引起鹌鹑的高血脂,血脂水平上降低TG、TC、LDL升高,降低LDL、VLDL/LDL。鹌鹑肝脏组织细胞醇115%,10%猪油,胆盐015%,基础饲料88%对体重180～200g健康雄性SD大鼠高脂血症性脂肪肝模型,其图象分析结果亦显示,肝细胞的脂肪变增加并且脂变细胞面积也有扩大。2　药物中毒性脂肪肝模型211　四环素脂肪肝动物模型　孙创斌[19]用小鼠,ip213g/kg?d四环素共4d。可造成四环素脂肪肝动物模血浆和肝组织中TxB2和6-Keto-PGF1的含量及TxB2和6-Keto-PGF1比值均较正常组明显增高,说明TxB2和6-Keto-PGF1。的平衡破坏,介导了高脂血症性脂肪肝肝脏的损伤过程。闫明等[13]用高脂高胆固醇饲料(猪油5%、胆固醇115%、猪胆盐015%、基础饲料97%)喂养雄性wistar大鼠3个月后,血清TC、TG显著升高;组织学为轻中度脂肪肝改变。人们发现在大鼠一生中喂玉米、棉子、大豆油比喂牛油、猪油产生更多的心脏损伤1说明C18:2并非具有既住所说的保护作用。本研究中模型组C18:2明显高于对照组,也从另一个角度说明,不饱和脂肪酸不一定具有人们常说的肝脏保护作用,甚至还可加重肝脏的损伤。高胆固醇和高脂饮食,加入少量胆酸盐,可增加胆固醇的吸收,如再加入甲状腺抑制药甲基硫氧嘧啶或丙基硫氧嘧啶可进一步诱发高脂血症。大鼠对高脂肪和高胆固醇有耐受性,对外源性胆固醇的吸收率为40%,较难形成斑块,所以饲料中除胆固醇外,需加入胆酸钠或甲基硫氧嘧啶[14]。112　兔　范建高等[15]用普通饲料加胆固醇、10%猪油。家兔食用该饲料4周时,血脂即已升高。18周后。其体重、肝指数显著高于正常对照组,血甘油三酯(TG)和胆固醇(TCH)显著高于正常,高密度脂蛋白(HDL)和转氨酶呈升高趋势,白蛋白/球蛋白比值呈下降趋势,但与正常组相比无显著差异。肝匀浆TG轻度增加,TCH显著增加。病理学改变为升主动脉粥样斑块明显,肝脏出现弥漫性肝细胞泡沫样变。肝细胞肿胀,界限不清,肝窦狭窄,病变以中央静脉周围最为明显,伴汇管区少量淋巴细胞浸润,胶原染色未见纤维化。动脉粥样硬化和肝脂变的复制率达100%,肝脂、血脂均显著升高。兔对外源性胆固醇的吸收率为75%～90%,对高脂的清除能力低(兔静脉注入胆固醇后脂血症可持续3～4d,大鼠仅为12h),只要给予高脂饲料,不必附加其他因素,3～4个月即可形成动物模型。但动物寿命短,抵抗力差,容易继发感染而死亡,同时兔为食草动物,其脂代谢与人体脂代谢差异较大[16]。中医药　648学刊113　鹌　鹑　张红锋[17]用高脂饲料(基础饲料中拌入1%胆固醇和14%猪油)饲养体重(105±5)g雌雄兼有鹌鹑,2个月以后,不仅观察到血清总胆固醇(Tch)和甘油三酯(TG)水平的升高和动脉壁上的AS斑块,而且观察到肝细胞的脂肪变性,脂滴在细胞质内大量积累,并把细胞核挤到细胞边缘1表现为脂肪肝症状。在鹌鹑动物模型上观察到的脂肪肝现象,与在家兔或大鼠等哺乳类动物的高脂模型上观察到的变化以及位置的变化基本一型。四环素致脂肪肝的可能机理是四环素抑制体内蛋白质合成,特别是肝的载脂蛋白合成。使肝内VLDL分泌发生障碍,从而使肝内TG蓄积所致。其抑制蛋白质作用机制可能通过抑制肝细胞线粒体DNA复制或干扰DNA转录,使mRNA合成减少,从而使mRNA翻译成载脂蛋白的量减少。通过抑制肝内TG的转运及肝细胞线粒体对脂肪酸的β-氧化,从而诱发肝细胞脂肪变性。其病理表现为肝细胞脂肪变性程度显著,有明显核偏移、脂滴多为小滴,弥漫性小泡性脂肪变。以中央静脉周围最为明显、极度肿胀呈圆形,细胞核明显偏移、体积较正常明显增加、胞浆内充满大量脂肪空泡,酷似泡沫细胞、界限不清,肝窦狭窄,但血脂TG、TC未见升高。212　四氯化碳脂肪肝动物模型　阎明[20]用药物性脂肪肝模型组在平衡饮食的基础上,给予400g/L四氯化碳(以橄榄油溶解)1mL/kg腹腔皮下注射体重在190～210g之间雄性Wistar大鼠,每周两次,共3周。对照组给予相同体积的无菌生理盐水皮下注射共3周。四氯化碳性脂肪肝肝脏肉眼见体积增大,颜色呈黄褐色,与周围组织粘连严重,光镜下观察,可见中央静脉周围肝细胞广泛气球样变性,但在病变细胞之间尚存在正常的肝脏组织。可能机理是四氯化碳可以明显抑制血清以及肝脏内HLDL,LDL的活性,血清中TG的含量增加,同时血清及肝组织内MDA含量增加的幅度明显高于酒精性脂肪肝组,说明四氯化碳引起的脂质过氧化反应更加严重。213　乙硫氨酸脂肪肝动物模型　孙蓉用[21]雄性wistar大鼠灌胃给予乙硫氨酸0125g/kg后48h,血中TG显著降低,肝内TG含量均显著升高。病理表现为肝细胞肥大,肝窦消失。肝细胞核旁胞浆空壳,部分形成明显脂滴,偶见炎细胞浸润,无明显坏死及纤维化。乙硫氨酸引起的肝脏病变主要是脂肪变性。可能机理是乙硫氨酸的化学结构与甲硫氨酸相似,甲硫氨酸为体内甲基转换的供体,乙硫氨酸与之竞争,取代甲基而提供乙基,使肝脏蛋白质合成发生障碍,生成的RNA和蛋白质含有乙基而非甲基基团。由于蛋白质合成发生障碍,担负将甘油三酯转运出肝脏的载体脂蛋白的复合物生成减少,结果甘油三酯蓄积于肝脏,引起脂肪肝。乙硫氨酸造成急性肝脂肪蓄积,可见肝甘油三酯升高。而血清甘油三酯、磷脂、胆固醇、胆固醇酯、脂蛋白、葡萄糖降低,血浆蛋白减少。同时血浆胆红素适当升高,肝分泌胆汁减少,血清酶轻度升高[22]。3　高脂肪饮食加药物中毒脂肪肝模型　第4期杨英昕等:非酒精性脂肪肝动物模型研究纂要流直流电,通电时间为20s;以同法处理下丘脑腹内侧核非损伤对照组(shsm),但无电流通过。实验前两组大鼠的体重没有差别,VMH损伤1周后,VMH损伤组大鼠体重明显高于其对照组。VMH损伤组的血清胰岛素水平明显高于shsm组,两组血糖、甘油三酯及总胆固醇水平无差别。与对照组比,VMH肥胖大鼠肝脏甘油三酯含量及其合成相关酶如苹果酸酶,葡萄糖6磷酸脱氢酶G6PDH和磷酸酰磷酸水解酶PAP活性均明显增高。提示肝脏脂质合成增加;肝脏中甘油三酯的含量明显增加,是对照组的约118倍,这与肝脏中以上酶的活性增加是311　应用四氯化碳　邹强等[23]用以含5%脂肪的混合基础饲料(95%的基础饲料加5%的猪油)喂养兔龄7～8个月,体重215～310kg,雌雄各半。健康家兔24只。喂养期间,每周第l天插胃管灌注50%的四氯化碳石蜡油溶液5mL,共4周。灌胃后,兔进食很少,为保证其存活,添加部分青菜叶喂养。在给予四氯化碳灌胃后的2～3天内,兔精神萎靡,活动减少,进食量明显下降,以后几天状态慢慢恢复;随着四氯化碳灌胃次数的增多,兔的一般状况越来越差,皮毛蓬乱无光泽,体重减轻。作者选择四氯化碳中毒的方法建立脂肪肝动物模型是因为:(1)四氯博士课题网络化碳是建立脂肪肝动物模型研究中最常采用的化学药一致的。在病理学上,VMH损伤性肥胖大鼠肝脏也表现物,价格便宜,来源丰富;(2)四氯化碳可以通过吸入、肌出明显的脂肪肝特征。下丘脑腹内侧核损伤性肥胖大鼠肉或静脉注射、胃内给药等多种途径对肝脏产生作用:也发生脂肪肝。(3)四氯化碳作用效果明确,在肝脏中它通过过氧化作5　离体脂肪肝细胞模型用,阻断载脂蛋白的合成,使脂肪在肝内沉积1作者用小张红锋[28]以人正常离体肝细胞株L02为实验材料,剂量多次给药的方式,这样减小了对动物的中毒作用,提采用含有016%酒精、10μg/mL软脂酸或5μg/mL软脂酸高了实验动物的存活率(本研究个实验动物的存活率达和016%乙醇的1640培养基长期培养肝细胞(6d),使肝85%),并逐步增加四氯化碳的毒性作用。同时用含少量细胞代谢紊乱,产生明显的甘油三酯累积,脂滴数量明显脂肪的饲料喂养实验组动物,提供部分外源性脂肪,以加增多和YGT(Y-谷氨酰转肽酶)泄漏增加等现象。在人快、加重脂肪肝的形成。病理学见脂肪肝的分级表现为体内,肝中YGT的活力较高,当肝细胞膜受损时,会大量从轻度到重度的趋势,均匀分布。在组织学切片上脂滴释放出来,使血清中YGT的活力升高。在透射电镜下观占肝脏单位体积的百分比,即vP值,代表肝脏中脂滴占察到正常肝细胞,肝细胞体积较小,其内线粒体小而多,肝脏单位体积的百分比,用以反映肝组织中的脂肪含量。嵴完整且较多,少见脂滴出现。轻度损伤肝细胞,核位于vP值与病理学对脂肪肝的分级结果相比,两者比较接细胞中央;线粒体较多,其体积比正常细胞稍大,嵴数也近。符合率达8715%。马骏[24]用高脂低蛋白玉米粉饲较多,细胞内有少量小脂滴存在。中度损伤肝细胞,核仍料(7915%玉米粉加20%猪油加015%胆固醇),饲养体重处于细胞近中央处,可见大量脂滴积累,细胞内线粒体数180～220g,雌雄各半Wistar大鼠,第3周以纯玉米粉以纯量较少,其内嵴数减少。重度损伤肝细胞,可见细胞内线四氯化碳5mL/kg,以后以40%四氯化碳橄榄油溶液粒体肿大,嵴数更少;细胞内出现了较多体积很大的脂3mL/kg,在大鼠背部皮下注射,每周2次,共3周。大鼠滴,细胞核被挤到边上,形成明显的印戒状损伤细胞。这血清中TG、TC含量,HDL-C含量,肝指数、血清Y-GT些现象与人类及实验动物脂肪肝的表型特征很相符,且含量升高。用公认去脂药物洛伐他汀,脂必妥处理,可使上述症状明312　应用四环素　赵文霞用[27]高脂饲料(84%基础饲显减轻。这种细胞水平上的实验性脂肪肝与动物水平的料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇)喂养雄性,体重实验性脂肪肝具有基本一致的病理表象,实验还发现,分150±10gSD大鼠,并于造模第1天腹腔注射四环素别用含有酒精、软脂酸或两者混合物的培养基培养正常15mg/100g鼠重,其后每6天1次腹腔注射四环素11mg/肝细胞6天以后,对细胞进行传代培养,并继续同样的损100g鼠重,计6次。模型组大鼠呈中度、重度肝细胞脂肪伤处理,此时再传代的细胞分裂生长十分缓慢,细胞边缘变,病变以中央静脉周围最为明显,肝细胞明显肿胀呈圆不清晰,细胞逐渐裂解,无法再延续生长。且各组细胞内形,细胞核被挤向一边,胞浆内充满大量脂肪空泡,脂滴积累的甘油三酯量比传代前显著增高。结果显示,低浓大小不等,甚者有融合为大脂滴,界限不清,肝室变窄,少度的酒精和软脂酸长期作用于正常肝细胞会产生不断累数可见有肝细胞碎屑样坏死和炎细胞浸润,但未见有纤积的损伤效果,而且可能会形成类似脂肪肝后的继发症维化改变。肝细胞素排列紊乱,胞浆脂滴大量沉积,线粒状。体明显肿胀或出现碎裂、坏死,肝星状细胞和库普弗细胞6　小　结数增多。611　现代研究认为,脂肪肝的病因和发病机制主要有　4　物理刺激性脂肪肝模型①进入肝内的脂肪酸(FFA)过多,TG的合成超过将其转Gruffal[28]薛长勇[27]用15W龄SD雌性大鼠,体重运出肝脏的能力;②肝内脂肪酸β-氧化障碍,肝内脂肪(300±20)g,所用饲料为标准大鼠饲料,含能量15127KJ/酸利用减少,TG合成增多;③极低密度脂蛋白(VLDL)合g(蛋白质2111%,脂肪617%,糖类5511%,维生素混合物成障碍,肝脏合成的内源性TG不能运出肝脏;④肝脏合1%,灰分5%,无机盐混合物315%,半胱氨酸5%,氯化成FFA能力增加及脂蛋白代谢酶的活性下降。由于脂胆碱216%)。丘脑腹内侧核(VMH)损伤性肥胖模型的肪肝的发病机制尚未完全清楚,但从目前的研究来看,造方法,电解电极插入坐标是:耳中线前612mm,正中缝两成TG大量堆积的原因不外乎两个:一是肝脏TG输出相侧各016mm,前囱腹外侧916mm。在电极上导入2mA恒对不足,二是肝脏TG输出绝对不足。前者是由于进入中医药　649学刊中　医　药　学　刊肝脏的血液中FFA增多或肝脏自身合成FFA增多,加速肝脏合成TG所致,后者多与载脂蛋白的合成不足β,-氧化作用减弱等有关。尽管引起脂肪肝病因和发病机制不完全相同。但在其病理改变及演变过程均有许多相似之处,均可因脂变的肝细胞体积增大,互相挤压并压迫肝血窦造成肝细胞缺血,或FFA的细胞毒性及药物、毒物的直接肝细胞损害作用,使脂肪肝由单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化或肝硬化发展。612　脂肪肝的实验研究也可分为整体和离体两种实验方法　理想的动物模型应是:①与人类疾病特征相似;②病变有一定发展过程,与人类发病过程接近;③形成率高,死亡率低,重复性好;④造模方法简便易行。但离体实验目前仅在脂肪肝的基础研究中使用。张红锋已成功地用酒精、软脂酸诱导造成离体人肝细胞的脂肪变性模型,而体外实验治疗学中药药效研究尚未见报道。目前抗脂肪肝药效学研究多采用与发病机制相关的整体动物模型进行。脂肪肝的实验动物常选用二级动物大鼠、小鼠和家兔。大鼠易造成酒精及非酒精性脂肪肝模型,而且饲养及给药方便,是最常用的动物。且多用雄性,因为雄性受激素影响小,形成模型更有说服力。进入肝内FFA过多为主的脂肪肝模型　可选用高脂饲料诱发肥胖、高脂血症脂肪肝模型,该模型是目前最常用的外源性FFA摄入过多脂肪肝模型,还有高脂、高热量诱发脂肪肝模型、高脂血症脂肪肝模型等。肝脏VLDL合成及分泌障碍为主的脂肪肝模型　可选用四环素脂肪肝模型脂肪肝模型,它们主要引起肝脏急性脂变,以肝脏TG增高为主。抑制脂肪酸β氧化的脂肪肝模型　可选用四氯化碳脂肪肝模型、酒精性脂肪肝模型等。复合因素造成的脂肪肝模型可选用高脂、酒精性脂肪肝模型等。所选用的客观指标主要为:肝脏脂质的直接测定。不论何种病因引起的脂肪肝其特异性指标即肝脂的堆积,堆积的肝脂同时还是脂肪性肝病发展的一个重要因素,故肝脂是诊断脂肪肝的关键性指标,病理检查是金标准。在治疗脂肪肝药物疗效评价的实验研究中,测定肝脂简便易行,故选用降低肝脂作为评价指标较以降血脂为指标更为合理,肝脂的测定可以通过组织学及化学的方法进行。与酒精性脂肪肝模型比较　与单纯高脂饮食组尽管其脂肪肝程度重于低脂酒精组,但肝内并无胶原纤维沉积1肝胶原蛋白含量基本正常、提示脂肪肝是否合并肝纤维化可能与其病因有关。酒精肝病组即使高脂饮食,造模3个月时也只出现脂肪肝,至6个月时才并存肝纤维化,但尚未发展为肝硬化;而四氯化碳组造模6周即有脂肪肝和肝纤维化,部分大鼠发生肝硬化,表明致病因素是否导致脂肪肝和肝纤维化、肝硬化主要与其强度及作用时间有关。在酒精和四氯化碳性肝损伤中,脂肪肝与肝纤维化可能是同一病因的两种不同的病理学改变[31]。用高脂饮食制造动物脂肪肝模型,体内脂类含量增加,脂肪分解释放FFA增加,血中FFA含量增加;当肝细2005年第23卷胞摄取过多的FFA,超过了线粒体对FFA的氧化能力,促使其合成TG增加,TG与肝细胞粗面内质网合成的apB及其他物质结合成极低密度脂蛋白(VLDL)而分泌入血。故血中TG、Tch、VLDL增高;当肝细胞内TG合成的速度过快,超过了肝脏合成VLDL的速度,肝内TG蓄积达到一定程度,即形成脂肪肝。目前发现FFA具有很强的细胞毒性,它可损害细胞膜、线粒体和溶酶体膜等,引起细胞器损害,使线粒体和微粒体氧化功能降低,肝脏脂肪氧化减少,而且能明显地加强细胞因子的毒性,导致肝实质细胞脂肪变性、坏死。影响模型的因素　禽类动物比哺乳动物更易发生脂肪肝,而且以鸡、鹅最为敏感,重型鸡比轻型鸡对脂肪肝更敏感,笼养比平养更易发生脂肪肝;高温环境使脂肪肝加重。激素影响:雌激素浓度升高可导致肝脏脂肪沉积增多;注射肾上腺素和根皮素可导致动物脂肪肝,甲状腺素在脂肪肝发生中起重要调节作用,饲喂碘化干酪素可降低肝脂含量;前列腺素可能有降低脂肪肝的作用。613　存在的问题对实验中动物每组的数量(样本数)在正式实验前并没有进行统计分析确定。应该在预实验时确定样本均数和标准差,再用统计软件或公式确定每组的只数。否则就造成要么样本数过多,要么过少。在实验中造模成功后,用药并去除导致疾病因素治疗组能否恢复正常未见报道。参考文献:[1]　范建高.肝内脂肪和脂质过氧化与肝纤维化关系的实验研究.中华内科杂志,):808～871[2]　王志平.大鼠高脂饮食性脂肪肝模型血浆和肝脏脂质含量变化[J].山西医科大学学报,):131～132[3]　钟岚.肥胖、高脂血症性脂肪性肝型的建立[J].实验动物科学与管理,):16～20.[4]　钟岚.非酒精性脂肪性肝炎动物模型的建立[J].中华实用医学,):3～6[5]　钟岚.降脂复肝方防治非酒精性脂肪性肝炎的实验研究[J].中华肝脏病杂志,)[6]　范建高,曾民德.非酒精性脂肪性肝炎发病机制及其防治实验研究[J].医学研究通讯,):25～26[7]　祁培宏.消脂保肝饮抗大鼠脂肪肝作用的研究[J].中西医结合肝病杂志,):33～35[8]　李文彪.清源调脂胶囊治疗高脂血症性脂肪肝实验研究[J].中西医结合肝病杂志,):159～161[9]　马晚燕.肝脂消煎剂对脂肪肝大鼠肝微粒体膜流动性及心肌黄酶、丙二醛的作用[J].中国中西医结合消化杂志,):284～286[10]　刘英宏.脂肝消胶囊治疗脂肪肝的实验研究[J].中国中医药科技,):269[11]　孙桂菊.降肝脂口服液降低血脂和防治脂肪肝的动物试验研究[J].预防医学情报杂志,)208～211[12]　杨牧样.脂肝泰胶囊对高脂血症性脂肪肝大鼠血浆及肝组织血栓素B2和6-酮-前列腺素Fla含量的影响[J].中国医药学报,):341～343[13]　闫明.高脂血症性脂肪肝大鼠血清游离脂肪酸的变化及意义[J],):6～7[14]　李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海科学技术出版社,[15]　范建高.普伐他丁.维生素E卡托普利.对家兔高血质症动脉粥样硬化和脂肪肝形成的影响.上海医学.):709～711中医药　650学刊第23卷　第4期2005年4月中　医　药　学　刊CHINESE　ARCHIVES　OF　TRADITIONAL　CHINESE　MEDICINEVol.23No.4Apr.,2005文章编号:05)04-0651-03五种祛风湿类中药对小鼠T淋巴细胞的影响研究林　力,王　耘,王春梅,乔延江(北京中医药大学中药学院,北京100102)　　摘　要:目的:应用小鼠体外T淋巴细胞模型,对几种常见祛风湿类中药进行体外实验研究。方法:无菌分离小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,与待测药物预孵1小时,加入刀豆蛋白A刺激剂继续培养,总计培养72小时后收获细胞,进行MTT染色,以酶标仪进行测定。结果:放线菌酮对T细胞有强的抑制作用,其IC50为mol/L,五种祛风湿类药材对小鼠T淋巴细胞均有一定的抑制作用,其中五加皮的抑制作用最强。结论:可以把应用ConA诱导的T淋巴细胞作为药物抗炎活性筛选的一种模型。关键词:MTT;放线菌酮;T淋巴细胞;祛风湿类中药中图分类号:R-05　　文献标识码:B　　淋巴细胞是人体最主要的免疫细胞,它在人体的免疫方面起着重要的作用。其中的T细胞主要中介细胞免疫功能,抑制其过度增殖可用于某些自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。有研究发现T细2]胞在风湿性关节炎的病理环节中起着重要的作用[1、,国内已有学者[3]研究其对淋巴细胞的影响,但尚未见到用MTT法对其进行测定。由于MTT法具有简便、快速、经济等特点,因此本文应用已建立的MTT法测定条件,对放线菌酮及五种祛风湿类中药进行测定,计算出其IC50,为应用体外实验筛选抗炎药物建立一种方便、快速的方法。1　仪器和试药　111　实验动物　近交系小鼠C57BL/6,清洁级,体重(20±2)g,由北京维通利华动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXX(京)。112　试验用药　放线菌酮:Amresco0947。中药:独活、防己、川乌、秦艽、五加皮五味中药购自北京阜通金象大药房和北京一元堂益生堂药店。113　试验仪器　MCO175二氧化碳细胞培养箱(日本Sanyo),SpectrumMAX190酶标仪(美国MD),NikonTS100倒置显微镜。114　主要试剂　RPMI1640培养基和硫酸链霉素购自GIBCOBRL;胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司();刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)购自美国SMTT,二甲基亚砜(DMSO),HEPES,二巯基乙醇和氨苄青霉素购自Amresco。2　方法与结果211　药物制备　阳性药放线菌酮　将样品用PBS缓冲液溶解,配制成10-2mol/L的工作溶液,依次稀释使浓度μ为10-3到10-7mol/L,经0122m的微孔滤膜滤过,4℃保存备用。待筛中药　将独活、防己、川乌、秦艽、五加皮五味中药于40℃干燥后粉碎,分别取各种药材细粉510g,置于100mL锥形瓶中,加入70%乙醇50mL,超声提取30min,滤过液减压干燥至恒重。将所得浸膏溶于DMSO中,配成相当于药材20mg/mL的储备液,试验时用不含血清的1640培养液依次稀释成系列所需浓度,即得试验用药液。212　淋巴细胞悬液的制备　无菌摘取小鼠脾脏,除去血液和脂肪,在细胞筛网上碾磨,并用RPMI1640完全培养基冲洗,冲洗液并入试管中,离心10min(1500r/min,),吸去上清液,并调整细胞密度成2、4、6、8、10、20和30×[16]　徐叔云.药理实验方法学[M].人民卫生出版社,[17]　张红锋.茶多酚对高脂鹌鹑的血脂和肝细胞贮脂水平的影响[J].中国药学杂志,):342～346[18]　郑新梅.脂肝康胶套对高血脂朗鹃血脂影响的研究[J].中医药学刊,～632[19]　孙创斌.去脂软肝丸对四环素致小鼠脂肪肝模型肝脂的影响[J].云南中医学院学报,)1～4[20]　阎明.非诺贝特治疗酒精性与药物性脂肪肝的实验研究[J].中华肝脏病杂志,):86～89[21]　孙蓉.脂肝清颗粒对脂肪肝模型大鼠的影响[J].中药新药与临床药理,):313～316事中药活性筛选和中药制剂分析方面的研究。[22]　李仅奎.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,]　邹强.适于影像学定量诊断研究的脂肪肝动物模型的建立[J].临床放射学杂志,):727～729[24]　马骏.疏肝化脂胶囊降血脂作用研究[J].中药药理与临床,):42～43[25]　赵文霞.化痰方,肝脾方抗大鼠脂肪肝模型作用机制的比较研究[J].河南中医学院学报,):18～20[26]　GruffalD,PiotC,parisonoffourmethodsforisolatinglargemRNA:apolipoproteinBmRNAinbovineandratlivers[J].AnalBiochem,):77[27]　薛长勇.下丘脑腹内侧核损伤大鼠脂肪肝形成机制探讨[J].营养学报,):58～61[28]　张红锋.乙醇和软脂酸诱导的脂肪肝离体细胞模型[J].华东师范大学学报(自然科学报),～94中医药　651学刊收稿日期:作者简介:林力(1976-),男,山东蓬莱人,博士研究生,主要从包含各类专业文献、文学作品欣赏、行业资料、各类资格考试、专业论文、生活休闲娱乐、幼儿教育、小学教育、非酒精性脂肪肝动物模型研究纂要[1]90等内容。
　1.2 氧应激及脂质过氧化损伤与 NAFLD 氧应激与脂质过氧化是非酒精性脂肪肝...动物模型是研究人类疾病的重要手段,目前非酒精性脂肪肝 的动物模型, 国内外已有... 　非酒精性脂肪肝的临床研究进展 【关键词】 非酒精...有人 对 26 例 NASH 患者肝活检随访 1～9 年,...[31]给大鼠高脂饮食 12 周复制 NASH 模型,治疗 ... 　非酒精性脂肪肝治疗指南_医药卫生_专业资料。非酒精...在参考国内外最新研究成果和相关诊疗共识的基础上[4...鉴于肝组织学诊断难以获得,NAFLD 工作定义为:(1)... 　谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic 南通市中医 院心血管内科倪卫兵 simple fatty liver, NAFL) 、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝 硬化和肝细胞癌[1-... 　类肝素酶在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中的表达及 意义 【摘要】目的: 研究类肝素酶在非酒精脂肪肝大鼠模型肝脏组 织中的表达,以探讨类肝素酶在非酒精性脂肪... 　非酒精性脂肪肝病因各异,肥胖、糖尿病是主要病因,营养 不良性脂肪肝仅流行于经济落后地区,其他原因有化合物中毒、妊娠 急性脂肪肝、Reye 综合征等[1]。随着我国... 　一、概论 1、非酒精性脂肪性肝病的命名和定义 2002...全国脂肪 肝和酒精性肝病研究学组成立,并起草了《...CC 患者平均年龄较 NASH 大 10 岁,脂肪肝动物模型... 　龙源期刊网 .cn 大鼠非酒精性脂肪肝中 UCP2 动态表达研究 作者:吴琼 夏旋 邹秀兰 来源:《中国医药科学》2013 年第 16 期 [摘要] 目的...