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硕士论文--海洋真菌绮丽穗霉Spicaria+elegans胞外多糖的分离与鉴定.pdf71页
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计拯峙一一一一一
研究生学位论文
海洋真菌绮丽穗霉胞外多糖的分离与鉴定
王捱云数授
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论文普僻荆呈曼生量且三尽 鱼立§笙垒且
中国海洋大学海洋真菌绮丽穗霉 ,号鲷, 胞外多糖的
分离与鉴定
海洋微生物是筛选和发现抗肿瘤药物先导化合物的重要资源。分离自青岛胶
州湾海泥的真菌绮丽穗霉 刮的次级代谢产物显示海虾致死活性,
并对细胞显示了细胞毒活性。在分析发酵液时发现其中存在大量的胞外
多糖成分.本文从中分离纯化得到胞外多糖,并对其进行单糖组成、结构和
生物活性的初步研究.
发酵液经脱脂脱色、浓缩后进行醇沉,得到胞外多糖粗品,采用超滤膜分离
法和凝胶柱层析法进行纯化,得到胞外多糖。采用高效凝胶渗透色谱法
测得的分子量为
.运用,, /,以
及高碘酸氧化、降解分析,对的结构进行了分析鉴定。薄层色谱法和
气相色谱法分析表明,是由甘露糖构成的均多糖,即甘露聚糖。红外光谱显
示,为弘甘露糖特征吸收;显示,异头质子信号在偏低场为.,
验证了甘露糖为构型。/,以及高碘酸氧化、降解分析,显示多糖
主链由?÷连接的甘露糖构成,侧链主要由?弭和一连接的甘露糖构成,
侧链与主链之间以一糖苷键和?糖苷键连接为主,并含有少量?÷连接.
利用肿瘤细胞株,和对进行抗肿瘤活性评价.
结果表明,对,和细胞株均未发现有明显的活性,其
它生物活性正在测定中.
本文首次从海洋真菌发酵液中分离获得甘露聚糖,为其精细结构和生物活性
研究提供了基础资料,对海洋微生物胞外多糖的研究具有参考价值.
关键词:海洋真菌胞外多糖分离纯化结构口,
. 髓】】障
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食用菌多糖提取技术研究概况
王雪冰，赵天瑞，樊建
&&&&&& 食用菌多糖是由l0个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，存在于食用菌的菌丝体、子实体和发酵液中。食用菌多糖有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和抗感染活性【1，同时还有增强免疫、抗氧化、降低血糖、抗溃疡、抗衰老、抗辐射等方面的生物活性和生理功能 。本文概述了几种提取食用菌多糖的方法，介绍其原理，通过比较近年来相关领域已有的研究报道，总结几种方法的优势与不足，为食用菌多糖的提取应用提供参考，并对食用菌多糖的开发利用做出了展望。
&&&&& 1 水提醇沉法提取食用菌多糖
&&&&&& 多糖溶于水而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂。用热水进行提取，主要是借助于热力作用使食用菌细胞发生质壁分离，水作为溶剂渗入细胞壁和细胞质中，溶解液泡中的物质，使其穿过细胞壁．扩散到外部溶剂中 细胞内或细胞问物质的渗出主要靠扩散作[31。刘祖同、罗信昌归纳了食用菌子实体多糖的提取T艺步骤 ：即食用菌子实体粉碎一脱脂肪一多糖的浸提一过滤(离心分离)一合并滤
液一多糖沉淀一去蛋白质、脱色一多糖组分的分离纯化一多糖组成和结构的分析，其中，热水浸提的温度一般为90qC～100℃，浸提时间为l h～3 h，浸提次数为2次～3次。
&&&&&& 陈湘嘲利用水提醇沉法提取黄蘑粗多糖． 结果显示提取的最佳条件为：料液比1：20，提取温度90℃。提取时间3 h，多糖产率达21．32％。宁慧青倒利用同样方法提取了灵芝、香菇、羊肚菌中多糖，所得多糖含量分别为4．875％、4．5％、8．1％ ，平均回收率为99．47％ 、99．18％ 、99．40％ 。说明此方法有较好的准确度。水提醇沉法的优点为试验设备简单，操作容易，准确度高，成本低廉，一次性投入较小，适用于大规模的丁业生产，但提取效率低且费时，劳动强度大，产品纯化困难且活性损失较大，随着工业技术的发展，一些现代高新技术被应用于食用菌多糖的提取。也有利用索氏提取法提取食用菌多糖的报道，原理与水提法是相同的，即利用索氏提取器以水为介质对食用菌干燥粉末进行回流提取多糖。靳丹虹等 利用索氏提取法提取灵芝多糖，具体步骤为精密称取灵芝粉末6份各约2 g，分别置索氏提取器中，加水90 mL，加热回流提取6 h。多糖得率为0．512％ 。从此实验可以看出其用时较长．且多糖提取率并不高。利用此法的研究也较少。
&&&&& 2 酸碱浸提法提取食用菌多糖
&&&&&& 原理是通过酸碱液的充分作用，使食用菌细胞、细胞壁充分吸水胀膨而破裂，从而使食用菌多糖充分游离出来，提高得率。田光辉等_引以灵芝为材料考察了酸碱盐介质对灵芝多糖提取率的影响，结果显示提取温度为90℃水提法所得多糖的质量分数为0．51％，1％Na：CO 溶液对多糖提取的质量分数为1．11％，0．5％HC1溶液对多糖提取的质量分数为0．89％。碱提法的多糖提取率最高。廖丽娟等唧在对松茸多糖的提取试验中分别在9O℃条件下，利用质量浓度为30 g&L 的NazCO 、NaC1、NaOH、HCI溶液
及蒸馏水提取松茸多糖，所测得松茸多糖质量分别为31．9g&kg～、19．5 g。kg 、33．5 g。kg 、24．8 g&kg 和l5．2 g&kg 。
与水提法相比酸碱法提取率明显捉高。
&&&&&& 由以上结果可以看出，酸碱介质能够明显提高多糖的提取率，但以酸作为介质时对糖苷键具有一定的破坏作用．降低多糖的得率，还会对容器造成腐蚀，除弱酸外一般不宜采用 采用稀碱液浸提后既能节省时间，又能减少原材料及试剂的消耗。且提取的多糖含量高，但碱提后的溶液浓度增大，造成过滤闲难。
&&&&&& 3 酶解法提取食用菌多糖
&&&&&& 食用菌组成复杂，除多糖外还含有蛋向质、纤维素、半纤维素和果胶等物质，这些物质的存在会影响多糖的浸L叶J． 因此在多糖提取过程巾适当加人酶制剂如水解纤维素的纤维素酶、水解果胶质的果胶酶等有利于多糖的浸 ，在提高溶出效率的同时，为后续捉取液的精制创造有利条件{l0】。酶解法的一般方法为按一定料液比加入样品干粉和生物酶、蒸馏水，在合适温度和pH值下酶解一定时间，然后升温灭酶，在合适的温度下提取一定时间，离心取上清液，即可测定多糖含量I⋯。以下分别介绍单一酶法和复
合酶法在食用菌多糖提取巾的应用。
&&&&&& 3．1 单一酶法提取食用菌多糖
&&&&&& 单一酶法是指只』}j一种酶来辅助提取食用菌多糖，从而提高多糖提取率。常用的酶有蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等。
&&&&&& 蛋白酶可破坏蛋白质的肽键，水解细胞中的游离蛋白质．破坏其空问结构，使其变得松散。同时蛋白酶还可水解蛋白聚糖和糖蛋白中的蛋向质，降低其对多糖的结合率，使多糖更易浸}H。刘青娥I⋯彳F推荐的最佳提取条件下分别考察了果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶对袖珍菇多糖提取效率的影响，以直接水提法为对照，结果显示木瓜蛋白酶酶解法有最佳提取效果，多糖提取率提高了95％， 试验考察了酶解温度、酶用量、pH和酶解时问对木瓜蛋白酶法多糖得率的影响．得 的结果是酶解温度为50℃左右时多糖提取率最高，随着温度的升高，多糖提取率下降；木瓜蛋白酶朋量为2．O％ 。冈浓度增加到2．0％ 以后， 再增加酶用量多糖提取率基本不再增加； 最佳酶解pH 值为5．2，因酶对pH值较为敏感，适当的pH值可维持酶活性中心的最佳空问构象，促进酶与底物的结合，提高反应速率：多糖得率随着酶解时间的延长而增加，超过100 rain时有所下降，是由于酶解时间太长会引起糖结构变化甚至碳环裂解，致使多糖得率降低。
&&&&&&& 纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，从而使细胞内的成分更易向提取介质扩散，食用菌多糖存在于子实体的细胞壁内，细胞壁的结构由纤维素维持，使用纤维素酶可水解细胞壁，提高多糖的浸 率。刘晓鹏等I l利用纤维素酶辅助提取茶树菇多糖，比较了酶解法和水提法2种方法，水提法提取茶树菇多糖料液比为1：60，提取时间120 rain．温度为6O℃时提取效果最佳，其多糖平均提取率为1．40％。纤维素酶酶解辅助提取茶树菇多糖的平均提取率为2．38％，比水提法提高了70．47％。纤维素酶酶解辅助提取茶树菇子实体多糖的料液比为1：80，酶浓度1．5％ ，浸提液DH值为6．0，提取温度为50℃ ，提取时间为60rain．可以发现纤维素酶解法节省原料，缩短了提取时间，反应条件更为温和．提取率更高。而刘青娥⋯ 的酶法提取袖珍菇多糖试验中，纤维素酶酶解法较之水提法多糖提取率提高了42％。李清等llU 以羊肚菌为实验材料研究了酶法提取的T 艺条件．其中纤维素酶加量为15％，温度45℃ ．提取时间为1 h时，其多糖浸提率为2．063％，优于水浸提法， 同样条件的热水浸提法羊肚菌多糖得率仅为0．56％。使用纤维素酶提取食朋菌多糖优于水提法，其条件温和．提取率高且不影响后续提取。
&&&&&&& 3．2 复合酶法提取食用菌多糖
&&&&&&&& 复合酶法即使用2种以上的酶对多糖进行提取，多采用一定比例的蛋白酶、纤维素酶和果胶酶进行酶解。复合酶法的提取条件温和，提取率通常比单一酶法高，且杂质较易除去，能源消耗低。邹东恢等I 】利用木瓜蛋白酶、纤维素酶复合提取香菇多糖，其最佳一[艺条件是：木瓜蛋白酶与纤维素酶质量比为2：1，复合酶质簧分数为0．4％ ，料液比为】：20，酶解反应的温度55℃，pH值6．5，反应时问3 h．提取率可达16．1％。马淑凤等l】4j利用二次回归正交旋转组合设计法．探寻复合酶法提取门灵菇菌丝体多糖的最
佳T艺，复合酶系组成为纤维索酶、蜗牛酶、溶壁酶、中性蛋白酶．质量比为3：2：0，5：5。试验结果表明当酶用量为2．53％ 、酶解温度39．6 、酶解时问3．2 h、pH值7．2时，多糖得率最高可达8．23％ ，而水提法多糖得率为6．36％(由该实验室测得)，高出i．87％。梁敏 采，[}j木瓜蛋白酶、纤维素酶提取香菇多糖，加酶比例为2：l(木瓜蛋白酶：纤维素酶)， 酶解反应温度55℃ ，pH 值6．5， 反应时间3h，多糖的提取率为16．1％ ，与传统水提法相比较，提取率提高了8．6％。可见．复合酶法处理可明显提高多糖的提取率。
&&&&&&& 酶法提取食用菌多糖经大量实验证明，可提高多糖的得率，且反应温度较低，提取时间较短；不足之处是酶的价格较高，又容易失活，实验过程中温度控制要求严格(因酶的最佳温度在很小的范罔内，条件的改变可能导致酶的失活)．且多糖的高级结构可能因酶的作用而改变_】61。
&&&&& 4 超声波法提取食用菌多糖
&&&&& 超声波法提取食用菌多糖是利』fj超声波的高频振荡、超声波的空化效应和机械剪切效应，通过强化固体微粒向液体的传质，促进提取剂向同&液界面扩散。另外，空化作朋产生的冲击波和射流可破坏植物细胞壁和细胞膜结构．并除去部分妨碍酶与底物接触的物质，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力 同体微粒和缔合水分子也被粉碎．变成微小的质团，从而提高lr有效成分溶出的速
度ll7I，即可提高多糖的得牢。王萍等I】81考察了超声波辅助法提取滑菇多糖的效果，寻找最佳的工艺条件，分别对液料比、超声处理时问、超声功率及水浴浸提时间4个因素进行了单因素和正交试验。具体操作步骤为称取预处理的滑菇干燥粉碎粉末．按一定料液比加蒸馏水．在0~C环境下进行超声波处理特定时问后． 于80℃水浴锅中浸提特定时间，取出后离心，抽滤。采用苯酚一硫酸法测定多糖含量。通过正交试验得到超声波辅助法提取滑菇多糖最佳工艺条件为：料液比为22 mL&g～，超声波时问40 min，超声波功率700 W，水提时间0．5 h。在此条件下滑菇多糖粗品得率达13．5％。而常规水浴浸提法提取滑菇多糖的提取时间长达6 h，且去蛋白后多糖得率也只为11．24％。超 波法提取时间短， 提取效率高，并且提取过程可以在低温下进行，有效成分损失较传统方法小得多。但超声时问不宦过长，否则可能使多糖发生断裂而降低多糖的得率。
&&&&&& 近年来，酶法结合超声波法提取食用菌多糖的方法也得到广泛应用。早年的研究报道认为，较高强度的超声波会致使酶失活口91。但近年来的研究发现，适当强度的超声波不但不会使酶失活，还会增强酶的活性 。原因是超声波促进底物与酶催化部位的结合， 同时促进产物进入介质，表现出酶催化活性的提高。其次，超声波空化作用产生的冲击波改变酶分子的构象，使其更易与底物结合，提高酶催化效率l2】。
&&&&&& 廖伟玲等[捌采用纤维素酶协同超声波法提取香菇多糖，得到最佳提取T艺条件为：酶加量1．0％ ，料液比1：15．超声功率为1 500 W，超声时间为60 min。按此方法提取香菇样品中多糖，平均得率为6．64％。正交试验结果表明酶加量的改变对香菇多糖得率的影响最大。而在谢红旗等&J自勺香菇多糖提取试验中．考察纤维素酶对香菇多糖的提取率的影响，加酶量为1％ ．单一使用纤维素酶的多糖提取率为5．50％，可见超声波辅助酶法较单一酶解法提取多糖有更好的效果。唐娟等[241也利用超声波结合纤维素酶法对黑木耳多糖进行提取．通过单因素和正交试验得到，二者结合提取木耳多糖的最佳工艺条件为：超声波功率40 W、pH 值为4．5、提取时间2．5 h， 提取温度为45℃，此实验纤维素酶的加量为300 IU&g～。
&&&&& 5 微波法提取食用菌多糖
&&&&& 微波是频率介于300 MHz和300 GHz之间的电磁波，频率很高，能够透人物体的深处。Pare等&l提出了微波提取的机理，即微波透过对微波透明的溶剂．到达物料内部的维管束和细胞内部，微波转化成分子的动能而发热，连续的高温使细胞内部压力超过其空间膨胀的能力，从而导致细胞破裂．胞内有效成分流出． 从而容易进入提取溶剂。靳丹虹等 分别利用索氏提取法、超声波法和微波法
对灵芝多糖进行提取，索氏提取法多糖提取率为0．512％，超声波法多糖提取率是0．632％．提取时间比索氏法缩短9倍：微波法多糖提取率是0．868％．提取时间比索氏法缩短45倍。试验结果表明微波法提取率最高，且最为省时。么宏伟等[261分别利用微波法和超声波法对松茸多糖进行提取，结果显示微波提取法更优于超声波法。正交试验表明超声波法的最佳提取条件为超声功率180 W，提取温度100℃ ， 超声时间为13 min，料液比为1：20， 按此工艺进行提取，松茸多糖提取率为11．13％，纯度为90-28％。根
据实验结果综合考虑、，确定最佳微波提取条件为微波提取功率为660 W，微波提取时间为45 rain，料液比为1：25，按此工艺进提取，松茸多糖提取率高达11．25％ ，纯度达90．74％。其中微波提取功率影响最大，其次是微波提取时间，料液比影响最小。由此可以看出微波法提取率更高，且多糖纯度也更高。何兵存等 通过正交试验寻找微波提取香菇多糖的最佳工艺条件为：料液比1：25，浸提温度80℃ ，浸提时间3 h，微波辐射3 min，浸提1次。在此条件下，香菇多糖得率可达7．70％。李德海等【28】利用微波辅助法提取滑菇多糖，通过正交试验得到最优提取条件为以水为浸提剂，微波处理4 min，液固比28：1(mL&g。)，微波功率为480 W，水浴浸提55 rain 实验结果表明．滑菇粗多糖得率可达14．611％。而王萍等 1利用超声波辅助法，最优条件下滑菇粗多糖的得率为l3．5％ ，可见微波法多糖的提取率更高。
&&&&&&& 微波提取法的优点是简单、高效、节能、安全，具有高选择性 近年来广泛应用于生物活性成分的提取．如提取谷胱甘肽、黄酮类物质、多糖等生物活性成分。但微波法也有其缺点，此法耗电量较大，微波功率稍高， 易出现焦糊状态，破坏食用菌多糖。
&&&&&& 6 超临界流体萃取技术
&&&&&& 超临界CO：流体萃取(SFE)分离过程是通过调节体系的压力和温度，来控制溶解度和蒸汽压2个参数进行分离．故超临界流体萃取综合了溶剂萃取和蒸馏的2种功能和特点。在特定条件下超临界流体选择性地把对应极性、沸点、摩尔质量的成分提取出来。对应范围内所得到的提取物不可能是目的物的纯净物，但可通过控制条件使目的提取物的含量有最佳比例。收集过程中，通过减压、升温
的方法使超临界状态的CO 变成气体状态， 目的提取物则被释放析出．从而达到分离提纯的目的 此法适用于热敏物质，且因黏度小、扩散系数大，提取速度较快
&&&& 利用超临界CO 流体苹取技术提取多糖已有报道，赵子剑等[3。]以茯苓多糖为评价指标，采用正交试验对超临界CO 流体萃取茯苓多糖提取工艺进行优选，得到最佳多糖提取条件为：萃取温度35cc，萃取压强20 MPa，夹带剂(水)用量0．4 mL&g～，萃取4．0 h，在此条件下茯苓多糖的平均得率为5．276％。而杜玲玲等l31]利用微波法提取茯苓多糖，最佳工艺条件下多糖的平均得率为3．704％ ，可见此法提取率更优于微波法。王大为等旧考察了超临界CO：流体萃取对蒙古口蘑多糖提取率的影响，采用超临界CO 流
体萃取技术脱除蒙古口蘑中脂类及色素物质。经脱脂、脱色素后利用热水浸提法提取多糖，提取率为6．24％，是溶剂脱脂和色素前处理提取率结果的4．2倍．是未经前处理试样的1．8倍
&&&&& 超临界流体萃取的优点为选择性好，适合分离热敏物质，溶剂回收简单，二氧化碳具惰性保护作用、无毒，萃取后无有害物质残留，可最大限度地保证产品的天然品质。其缺点为需在相当高的压力下操作．压缩设备投资以及附加费用较大，对配套设备要求很高，进一步提高了投资费用，且在连续化上还存在工艺设备方面的困难
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黄伞胞内与胞外多糖提取优化与抗氧化活性探析.pdf55页
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山东农业大学
硕士学位论文
黄伞胞内与胞外多糖提取优化与抗氧化活性研究
姓名：邓鹏
申请学位级别：硕士
专业：微生物学
指导教师：贾乐
山东农业大学硕士学位论文
中 文 摘 要
黄 伞 （ Pholiota
） 隶 属 担 子 菌 亚 门 （Basidiomycotina
）， 伞 菌 纲
（Agaricomycetes ），伞菌目（Agaricales ），球盖菇科（Strophariaceae ）。富含多糖、蛋
白质、微量元素、食用纤维和维生素等生物活性物质。黄伞多糖是黄伞主要的活性成分
之一，具有降血脂、抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等多种药理活性。
本文对黄伞 SX-02
试验和响应面试验等方法确定了黄伞胞外多糖
（Exopolysaccharide, EPS ）与胞内多糖（Intracellular polysaccharide, IPS ）的最佳提取条
件，并初步分析了其抗氧化能力，得到以下结论：
1、IPS 的最佳提取条件
响应面优化结果为超声破壁功率561.26W，沉淀时间30.18h，沉淀pH8.28 ，此条件
下黄伞胞内多糖得率的理论值达20.73% 。考虑到操作方便，将最佳提取条件调整为：超
声破壁功率
560W ，沉淀时间30h，沉淀pH8.3 。在此条件下，胞内多糖得率为20.70% ，
稍低于理论值20.73% 。
2 、IPS 的体外抗氧化活性
测定了IPS对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH ）、超氧阴离子自由基（O2-? ）和羟自
由基（?OH ）的清除能力，同时用普鲁士蓝法测定还原力。结果表明，IPS有明显抑制
O2-?、?OH和DPPH 自由基的作用，并具有一定的还原
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羊肚菌菌丝体胞内多糖提取工艺研究
现代商贸工业
Ｎｏ．４，２００９
ＭｏｄｅｒｎＢｕｓｉｎｅｓｓＴｒａｄｅＩｎｄｕｓｔｒｙ２００９年第４期
羊肚菌菌丝体胞内多糖提取工艺研究
（揭阳职业技术学院实训与计算机中心，广东揭阳５２２０００）
摘要：通过液体深层发酵获得羊肚茵茵丝体，用正交实验的方法得出羊肚菌苗丝体胞内多糖的最佳提取工艺条件：浸提比１：１５，浸提温度为９０℃，浸提时间为３ｈ和沉析用的乙醇最佳浓度为５０％。同时证实：用草酸和氢氧化钠溶液浸提羊肚茵茵丝体，可提高多糖的提取率；胞内多糖也可用冷水长时问浸提出来。
关键词：羊肚茵，深层发酵，茵丝体，胞内多糖，提取工艺中图分类号：Ｑ２８
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２—３１９８（２００９）０４—０３０７—０２
羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ），又叫羊肚菜、羊肚蘑、木耳蘑菇，为子囊菌亚ｆ－ｉ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）中最著名的食用菌，是世界上珍贵的食用菌之一。据现代研究表明，羊肚菌富含蛋白质、多糖、核酸，具有降血脂、升高白细胞和调节免疫功能等方面的作用，并可减轻患者放疗化疗引起的恶心、头疼、少食欲等副作用。它与冬虫夏草的功能类似。而羊肚菌中起重要作用的活性物质是羊肚菌多糖。羊肚菌多糖具有调节人体生理节律、促进免疫和康复的功能，属于生理活性成分或功能性物质．
目前研究较多的真菌多糖提取主要有：香菇多糖、灵芝多糖、银耳多糖、猴头菇多糖和茯苓多糖等，而有关羊肚菌多糖提取工艺研究的报道还很少。由于利用羊肚菌野生子实体来提取羊肚菌多糖成本极高，原料来源也受到很大限制，但采用深层液体发酵法培养羊肚菌具有明显降低成本，提高生产效率等优点。为了有效地开发和利用羊肚菌，本文以深层发酵的羊肚菌菌丝体为原料对羊肚菌胞内粗多糖的提取工艺进行研究，对提取工艺进行了优选．
１０００ｍｌ，ｐＨ值６．５。
液体发酵培养基（胡萝ｈ酵母膏培养基）：胡萝卜２５％，酵母膏１％，蛋白胨１％，葡萄糖３％，Ｋ２ＨＰ０４０．２％，Ｍｇ—
Ｓ０４?７Ｈ２０
０．２％，ｐＨ自然。
１．２方法
１．２．１
多糖提取方法
液体深层培养得到的羊肚菌菌丝体，经真空抽滤、洗涤、烘干并研磨成粉末状，取一定量的菌丝体粉末。以不同的加水量、提取温度和提取时间在恒温水浴中提取。提取液经加热蒸发浓缩和用活性炭去除色素后．用Ｓｅｖａｇ法去蛋白，再加入乙醇沉析过夜，离心得到粗多糖。１．２．２多糖含量的测定方法
用苯酚一硫酸法测粗多糖含量。１．２．３?不同提取条件对多糖提取率的影响
用热水作提取剂，选用浸提比（干菌粉与加入水量的比例）、浸提温度、浸提时间和乙醇浓度四个因素，按Ｌ９（３４）设计４个因素、３个水平的正交实验，如表１。去蛋白时用Ｓｅｖａｇ法，以脱蛋白多糖含量为指标．三次重复．
表１因素水平表
Ａ（授提比）
１：１５１ｔ２５１：３５
１材料和方法
１．１材料１．１．１供试菌种
尖顶羊肚茵。由华南师范大学生命科学学院提供．
１．１．２
Ｂ（浸提时间）／ｈ
Ｃ（浸掘温度）／℃
８０９０１００
Ｄ（乙醇浓度）／％
５０７５９Ｓ
试剂与设备
正丁醇、氯仿、草酸、９５％乙醇、苯酚、氢氧化钠、葡萄糖、９８％浓Ｈ２Ｓ０４（均为分析纯）；活性炭、蒸馏水，
分光光度计：ＶＩＳ－－７２３Ｇ；循环水真空泵：ＺＩ（Ｊ一１型；恒温培养振荡器：ＺＨＷＹ一２１０２；电子分析天平：ＡＢ２０４一Ｎ；低速大容量离心机：ＤＬ一５ｌ电热恒温水浴锅：Ｈ．Ｈ．Ｓ２；冰箱：ＢＣＤ一２６８ＷＡ，生化培养箱：ＬＲＨ一２５０一Ａ｝电热鼓风干燥箱：ＤＬ一１０１—２；灭菌器：ＴＨ—Ａ３５６０Ｃ；无菌工作台；研磨器；玻璃器皿。１．１．３培养基配方
平板培养基：马铃薯２００９（去皮），Ｋ２ＨＰ０４ｌｇ，ＭｇＳ０４１９，蛋白胨１９。葡萄糖２０９，硫酸铵１９，琼脂２０９ｔ加水至
１．２．４
草酸和ＮａＯＨ作提取荆对羊肚茵多糖提取的影响
采用正交实验中所得出的最佳条件组合即最佳的浸提比，浸提温度和浸提时间，以及沉析用的乙醇浓度，分别用１０９／Ｌ草酸、３０９／Ｌ草酸、６０９／Ｌ草酸、２０９／ＬＮａＯＨ和４０９／
ＮａｏＨ作提取剂，以蒸馏水作对照。
１．２．５冷水４℃的漫提效果研究
由于冷水对细胞内物质不会造成破坏，本实验采用冷水作浸提剂．准确称取２．Ｏｇ的菌丝粉。根据正交实验所得出的最佳浸提比，加入预冷的冷水。于４＂Ｃ的冰箱中连续浸
?－——３０７??——
万方数据　
贡献者：riddsk金阳
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几种真菌DNA提取方法的比较
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