12基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测方面的研究进展
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12基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测方面的研究进展
３７１８；塞旦匿堂盘查！Ｑ塑生箜堑鲞筮！！塑；基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及；耐药性检测方面的研究进展；我国是全球２２个结核病高负担国家之一．目前结核病；临床实验室中传统的药敏试验方法烦琐、费时，由于结；基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征；１．１；基因芯片历史同顾生物芯片的最；初构想来源于１９８９年美国加州的Ａ所ｍｅⅢｘ公司；进行非放
３７１８塞旦匿堂盘查！Ｑ塑生箜堑鲞筮！！塑基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测方面的研究进展我国是全球２２个结核病高负担国家之一．目前结核病患者数量居世界第２位，仅次于印度。３月２４日是“世界肺结核日”．２００４年根据世界卫生组织的最新研究报告指出．结核病已跃升为人类头号杀手。我国目前现有肺结核患者约４５ｌ万，其中传染性肺结核患者约２００万。每年约有１４５万新发病例，每年因结核病死亡人数达１３万．大大超过其他传染病死亡人数的总和。临床实验室中传统的药敏试验方法烦琐、费时，由于结核分枝杆菌生长缓慢，在得到分离株后３～４周才能获得结果。Ｂａｃｔｅｃ．９６０ＴＢ系统使结核分枝杆菌药物敏感性试验时间缩短．但还不能为结核病的早期治疗提供有利依据，造成结核患者在人群中播散。基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。利用基因芯片可以快速获得各种疾病菌种和耐药性方面的信息，为疾病的治疗提供依据。ｌ基因芯片技术１．１基因芯片历史同顾生物芯片的最初构想来源于１９８９年美国加州的Ａ所ｍｅⅢｘ公司的前身Ａ卿ｍａｘ公司里的一次即兴的建议。当时Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ发现被标记的核酸分子能够与另一个被固化的核酸分子配对杂交，因此，Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交可被看作是最早的生物芯片…。１９９１年利用光蚀刻光导合成多肽１２】。１９９２年第一块生物芯片诞生。１９９３年设计了一种寡核苷酸生物芯片［“。１９９４年又提出用光导合成的寡核苷酸芯片进行ＤＮＡ序列快速分析［“。到１９９６年制造出世界上第一块商业化的生物芯片。近年来，合成的寡核甘酸探针因其独特的优点而备受关注商］，如（１）可根据需要合成相应序列：（２）可识别靶序列内１个碱基的变化；（３）可大量合成且能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。圳。１．２基因芯片的定义ＤＮＡ芯片是生作者单位：ｌ０００９ｌ北京市，解放军３０９医院全军结核病研究所万方数据张俊仙综述吴雪琼审校物芯片目前应用最广泛的产品。基因芯非接触微机械印刷法ｒ『＇０ｓＰＯＴ和软光刻片又称ＤＮＡ芯片（ＤＮＡｃｈｉｐｓ）或ＤＮＡ微复制等。主要有两种基本方法．①原位合阵列（ＤＮＡｍｉｒｃｏａ丌ａｙ）．是生物芯片中的成：“３：②合成点样法［，一］：另外一种方法一种。其特点是高度平行性、多样性、微是合成点样的改进型。除上述３种方法型化和自动化ｉ”。外，还有以凝胶块为阵点的芯片或者也１．３基因芯片技术原理基因芯片的工可以通过导电的吡咯单体的聚合形成微作原理与Ｓｏｕｔｈｅｍ、Ｎｏ曲ｅｍ是一致的．都阵列。探针的荧光素标记分为间接标记是应用已知核酸序列作为探针固定在玻和直接标记。间接标记是指将生物素连璃等基片上．然后与待测样品的ＤＮＡ或接在探针上．利用亲和素对生物素有极ＲＮＡ互补的靶核苷酸序列杂交．从而获高亲和力的原理．进行分子杂交．然后用得待测样品的信息。基因芯片技术由于偶联有荧光素或链霉亲和素进行检测。同时将大量探针固定在支持物上．所以直接标记是通过荧光素直接与探针核苷可以一次性对样品大量序列进行检测和或磷酸戊糖骨架共价结合。或掺入荧光分析．从而解决了传统核酸印迹杂交技素一核苷三磷酸以标记探针．杂交后，直术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数接检测荧光信号ｍ】。（２）样品的制备。包量少、检测效率低等不足’８］，而且，通过括样品ＤＮＡ或ＲＮＡ的分离提纯和用设计不同的探针阵列，使用特定的分析ＰＣＲ技术对靶基因片段扩增以及对靶基方法可使该技术具有多种不同的应用价因标记。将样品进行提取、扩增，获取其值。中的蛋白质或ＤＮＡ、ＲＮＡ．然后用荧光标１．４基因芯片的主要类型和制备方法记。由于目前的检测体系还不能检测出１．４．１主要类型生物芯片包括ＤＮＡ未扩增的标记样品．所以待测样品在杂芯片、蛋白芯片及芯片实验室三大领域。交前一般都要进行ＰＣＲ反应。在扩增过基因芯片按其性能和用途可分为两类：程中对靶ＤＮＡ进行标记。（３）基因探针毛细管型和基闪探针型。按基因芯片技的固定化。生物分子探针是与靶分子互术主要分为两大类：（１）ｃＤＮＡ微点阵补的序列。基因探针的固定化方法目前（ｃＤＮＡｍｉｃｍａｎ－ａｙ）。（２）寡核苷酸微阵列常用的有两种：聚赖氨酸法、醛基一氨基芯片叫ｏ】。按基因芯片的用途分为表达芯法。（４）杂交反应。杂交反应是一个复杂片、基因组芯片和测序芯片．按芯片上核的过程，受很多因素的影响。选择合适的甘酸的长度分为寡核甘酸芯片、ｃＤＮＡ芯反应条件使生物分子问的反应处于最适片和基因组芯片。按片基可分为无机片状况中。（５）芯片信号的检测与分析。样基和有机合成物片基。按工作原理可分品中靶基因与固定在芯片上的探针发生为杂交型、合成型、连接型、亲和识别型特异性杂交而结合在芯片上的不同点．等。按分析过程可分为样品制作芯片、生荧光素分子受特定波长的激发光照射出物化学反应芯片、检测芯片、芯片实验室。特定波长的荧光，杂交越完全，得到的信根据生物芯片的特点和发展趋势，可将其号也就越强。分为两类。第一类为高密度分子微阵列２基因芯片技术在结核病研究中的应芯片。第二类是以各种结构微阵列为基用础的生物芯片．由微通道或反应池等构２．１基因芯片技术用于分枝杆菌菌种鉴成的通道型微阵列及生物传感芯片…】。定ＮＴＭ的分离率全国差异很大［－引。１．４．２制备方法（１）芯片的制备。首先２０００年非结核分枝杆菌的分离率平均为要寻找有意突变位点设计、合成探针；其１１．１％，耐药率为９５．９％，耐多药率为次在制备基因芯片时要考虑阵列的密８３．７％［”Ⅲ。ＮＴＭ具有天然的对抗结核药物的耐受性。传统的分枝杆菌菌种鉴定等几方面的因素。目前ＤＮＡ芯片的制备是鉴定结核杆菌复合群和非结核分枝杆菌，耗时长，步骤繁琐。最近发展起来并广泛使用的快速培养技术．如度、再生性、操作的简便性、成本的高低方法有：光引导原位合成法、化学喷射法、接触式点涂法、原位ＤＮＡ控制合成、塞旦匿堂苤查；嫂！生蔓垫鲞箜！！塑ＢＡＣＴＥＣ４６０．ＢＡＣＴＥＣ９６０无疑大大缩短了培养周期．但只能检测是结核杆菌复合群还是非结核分枝杆菌，依然无法达到快速检测的要求。目前常用的分子生物学方法有始于１９８９年的ＰＣＲ―ＳＳＣＰ、ｖａｎｅｅｃｈｏｕｔ等㈨报道的ＰｃＲ．ＲＦＬＰ、ＰｃＲ．直接测序法［１７。”、ＤＮＡｐｍｂｅ和分子灯塔法…等，这些方法各有优缺点，仍不能满足临床的需要。基因芯片技术始创于２０世纪９０年代初．由美国Ａ毋ｍｅⅢｘ公司的Ｆｏｄｏｒ博士开始相关研究ｆ２ｌ】。基斟芯片在结核分枝杆菌快速鉴定方面的应用研究一经报道．立即引起了国内外学者的高度重视ｍ引．等方面。１９９８年，Ｇｊｎｇｅｒａｓ等［驯利用结核ｂｐ特异种１２１株分枝杆菌进行基因分型与菌种ｒＲＮＡ和ｒｐｏＢ基因序列，利用基因芯片技术鉴床分离株和１５株耐利福平菌株为准确间的差异．１９９９年Ｂｅｈｒ等【“】通过ＤＮＡ芯片对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗（ＢＣＧ）的基因组进行杂交试验比较，证实ＢＣＧ缺失与结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ致源性的分枝杆菌的准确鉴定和疫苗的合理设计提供了新的思路。２．２基因芯片技术用于结核分枝杆菌耐的特点：感染人数多；患病人数多；新发患者多；死亡人数多；农村患者多；耐药患者多。全国菌阳肺结核患者中耐药患者约占ｌ／４．而他们传播引起新患者的耐药率高达２８％．每年由结核病带来的直接损失超过３５亿［引。目前常用的耐药基因分子生物学检测方法有：聚合酶链反应一ＤＮＡ直接测序法；聚合酶链反应一单链构象多态性分析；聚合酶链反应一异源双链构象分析；ＲＮＡ／ＲＮＡ错配法：分子灯塔法；线性探针法和聚合酶链反应一酶联免疫吸附试验．等等。但是都因各种原因难以满足临床的快速需要。芯片技术最大优势是能同时分析成千上万个基因，可将所有突变的探针固定到一张芯片上，只须一次杂交，即可获得某一菌株对所有药物的敏感性结果，因而对指导医生合理用药非常有价值，万方数据３７１９并为控制疾病的传播提供了可能性。３当前面临的困难１９９８年，Ｃｉｎｇｅｒａｓ等。驯利用结核分枝尽管基因芯片技术已经取得了长足杆菌ｒｐｏＢ基因保守区７０５ｂｐ特异核苷酸的发展，得到人们的瞩目，但仍然存在着序列探针与基因芯片杂交．对１０种１２ｌ许多难以解决的问题，例如技术成本昂株分枝杆菌进行基因分型与菌种鉴定。贵、复杂、检测灵敏度较低，重复性差、分作者用ｒｐｏＢ寡核苷酸芯片技术与常规双析范围较狭窄等问题。这些问题主要表脱氧核苷酸测序方法，分析了ｌｏ种分支现在样品的制备、探针合成与固定、分子杆菌种问与种内的序列多样性，并确证的标记、数据的读取与分析等几个方面。了几种特异性单碱基多态性。１９９９年基因芯片的特异性还有待提高。上述问１’ｍｅｓｃｈ等ｔ。：基于１６ｓｒＲＮＡ和ｒｐｏＢ基因题不仅是当前和今后一段时期内国内外序列，利用基渊芯片技术鉴定出７０株２７基因芯片技术研究的焦点．同时也是基种不同菌种的分枝杆菌临床分离株和１５因芯片能否从实验室研究推向临床应用株耐利福平菌株．结果正确地鉴定了２７的关键问题。个种属中的２６个．而且检测出了所有耐目前基因芯片的大规模临床应用还利福平的１５株结核分枝杆菌ｒｐｏＢ突变存在尚未克服的技术缺陷。主要包括芯片基因。２００２年张万汀等。４ｊ报道应用基因诊断特异性和灵敏度低、芯片诊断成本高芯片技术检测ｌ株结核分枝杆菌药物敏昂和芯片诊断配套仪器价格昂贵等等。感株和４株耐多药株结核分枝杆菌．基４展望因芯片扫描结果经分析与传统药敏检测基因芯片技术发展到今天不过短短结果相符合。２００３年崔振玲等：臼ｊ用芯片十几年时间．虽然还存在这样或那样的检测耐异烟肼分离株ｋａｔＧ、ａｈｐｃ调节区问题，但其在基闪表达谱分析、基凶诊域和ｉｎｈＡ调节区域的基因突变。２００３年断、药物筛选及序列分析等诸多领域已端木和运等：圳报道应用基因芯片检测呈现出广阔的应用前景．随着研究的不２０株耐ＩＮＨ、ＲＦＰ结核分枝杆菌临床分断深入和技术的更加完善．基因芯片一离株的ｋａｔＣ、ｒｐｏＢ基因突变。２００３年李定会在生命科学研究领域发挥出其非凡胡渤等㈣用ＤＮＡ芯片对５９株耐药结核的作用。尤其在结核病方面，在分枝杆菌分枝杆菌进行耐异烟肼、耐利福平基因的基阗分型、菌种鉴定和耐药基因的检进行检测。２００３年单万水等㈨报道３５株测等方面．将发生越来越重要的作用，我耐利福平结核菌中有９１．４％用直接测序们相信这一天很快就会到来。法检测出存在ｒｐｏＢ基因突变，ＤＮＡ芯片５参考文献的检测效率为７１．４％。『１］朱国萍，解俊．ＤＮＡ芯片一世纪之交的２．３基冈芯片的优势基冈芯片在感染技术革命［Ｊ］．安徽师范大学学报，１９９９．性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临２２（４）：６７ｌ一６７３．床诊断方面具有独特的优势。与传统检［２］ＦｏｄｏｒｓＰ，ＲｅａｄＪＬ，Ｐｉ删ｎｇＭｃ，ｅｔａ１．测方法相比．它可以在一张芯片同时对ＬｉｇＩｌ¨ｉｒｅｃｔｅｄ，ｓｐａｔｉａｌｌｙａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅｐａ叫ｌｅｌ多个患者进行多种疾病的检测：无需机ｃｈｅｍｉｃａｌｓｙｎｔｈｅｓｊｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９ｌ，２５ｌ体免疫应答反应，能及早诊断；待测样品（４９９５）：７６７―７７３．［３］Ｆ０ｄｏｒｓＰ．ＲａｖａＰＰ，Ｈｕ锄ｇｘｃ，ｅｔａ１．用量小：能检测病原微生物的耐药性，病Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌ船ｓａｙｓｗｉｔｈ原微生物的亚型：极高的灵敏度和可靠ｂｉ０１０舀ｃａｌｃｈｉｐ８［Ｊ］．Ｎａｔｕｍ，１９９３．３６４性；检测成本低，自动化程度高，利于大（６４３７）：５５５―５５６．规模推广应用。这些特点使得医务人员［４］Ｐｅ鹊ｅＡｃ，ｓｏｌ够Ｄ，ｓｕｌｌｉｖａｎＥＪ，ｅｔａ１．在短时间内．可以掌握大量的疾病诊断Ｌｉｇｈｔ?ｇｅｎｅｒ８ｔｅｄｏｌｉ９０ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ啪ｙｓｆ打信息．这些信息有助于医生在短时间内ｒａｐｉｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ明ａｌｙＢｉＢ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ找到正确的治疗措施２００５年１月中国ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｊＵＳＡ。１９９４，９ｌ（１１）：５０２２―科学院武汉病毒所分析生物化学与分析５０２６．生物技术学科组邓教宇助理研究员报告［５］马立人。蒋中华．生物芯片［Ｍ］．北京：化题为“结核分枝杆菌耐药性检测基因芯学工业出版社，２００ｌ：ｌ一２０。片研究”，他报告了结合现代分子生物学［６］林万明．核酸探针杂交实验技术［Ｍ］．北京：中国科学技术出版社．１９９ｌ：２―４．和基因：占片技术．建立的一种准确、快速［７］高天祥．田竞生．医学分子生物学［Ｍ］．北和灵敏的结核分枝杆菌耐药性检测实用京：科学出版社．２０００：１３２一１３８．化新方法．它扩展了基因芯片的研究内［８］ｃｈｅｕｎｇＶＧ。Ｍｏｒｌ８ｙＭ，Ａｇｕｉｌ盯Ｆ，ｅｔａＩ容，对于结核病的早期诊断、结核菌耐药Ｍａｌ【ｉｎｇａｎｄｒｅａｄｉｎｇｍｉｃｍ帅ｙｓ［Ｊ］．Ｎａｔ性快速测定及耐药性结核病的有效防治Ｇｅｎｅｔ．１９９９，２ｌ（１ＳｕｐｐＪ）：１５一１９．和控制具有重要意义。［９］安海廉．ＤＮＡ芯片技术及其应用［Ｊ］．生成为本世纪分子生物学的研究热点．应用于分枝杆菌的菌种鉴定和耐药性检测分枝杆菌ｒｐｏＢ基因保守区７０５核苷酸序列探针与基因芯片杂交．对１０鉴定。１９９９年Ｔｍｅｓｃｈ等［∞３基于１６Ｓ定出７０株２７种不同菌种的分枝杆菌临理解ＤＮＡ同源性高的分枝杆菌基因组病相关的区域。由此可见。对关系密切的分枝杆菌基因差异的正确了解．对高同药性检测我国结核病疫情呈现“六多”３７２０塞旦匡堂盘查！Ｑ塑生笠堑鲞苤！！塑ｄｅｎｓｉ竹ＤＮＡＭｉｃｒｏｂｉ０１．１ｐｒｏｂｅ物工程进展，１９９８，１８（２）：３７―４０．（１１）：２８８２―２８８９．ａｎ＿ａｖｓ［Ｊ］．Ｊｃｌｉｎ［１０］孙开来，吴东宁．ＤＮＡ芯片的发展和意义［Ｍ］．国外医学：遗传学分册，１９９８（６）：２８１―２８３．［１１］徐炳森，邵建忠．几种新型生物芯片的研究进展［Ｊ］．生物化学与生物物理进展。２０００．２７（３）：２５１．（１８］Ｐ“ｓ，Ｅ驼ｎＮ，Ｐ蛳ｘ，ｅｔａ１．Ｒｏｕ“ｎｅｍｐｉｄｂａｓｅｄｉｎ９Ｉ吟，３７（１）：４９―５５．ｏｆＢＣＧＭｙｃｏｂ舵ｔｅ―ｕｍｓｐｅｃｉｅｓｏｎ曲ｓｉ印ｍｅｎｔ８ｐｅ“ｅｓ―Ｂｐｅｃｉｆｉｃａ¨ｅｌｉｃｖ撕ａｔｉｏｎｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ『２４］ＢｅｈｒＭＡ．ＷｉｌＢ∞ＭＡ．ＧｉｌｌＷＰ，ｅｔａ１．ｖａｃｃｉｎｅ８Ｃｏｍｐａ阳ｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓｂｙｗｈｏｌｅ．ｇｅｎｏｍｅｔｈｅ６５一ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎＤＮＡｍｉｃｒｏａｍｙ【ＪＪ．ｇｅｎｅ（ｈｓｐ６５）［Ｊ］．Ａｒｃｈ１９９７。１２ｌ（８）：８５９―８６４．ＰａＩｈｏＩＬａｂＭｅｄ，ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９．２８４（５４１９）：１５２０―１５２３．［２５］全国结核病流行病学抽样调查技术指ＢａｌｚＭ，ｅｔｔｏ［１２］杨明杰，曹佳．多彩色荧光原位杂交技术原理及应用［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，１９９８，２５（４）：３３３―３３７．［１９］ＴｅｌｅｎｔｉＡ，Ｍａ”ｈｅｓｉＦ，ｏｆａ１．ｔｈｅ导组．第四次全国结核病流行病学抽样调查报告［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２００２．２５（１）：３．［２６］张万江，鲍朗，王晓樱．等．和Ｊ用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的研究［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００２．２５（４）：２０９．崔振玲，景奉香，胡忠义．等．用ＤＮＡ芯［”］片快速检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００３，２６（４）：２４４．［２８］端木和运．张钢，邓为群．ＤＮＡ芯片法检测耐多药结核分支杆菌耐药性［Ｊ］．临床医学，２００３，２３（５）：２５―２６．［２９］李胡渤，张晨曦，施旭东．５９株耐药结核分枝杆菌ＤＮＡ芯片检测结果分析［Ｊ］．医药论坛杂志，２００３，２４（１９）：２５―２６．［３０］单万水，金岚．能勇，等．ＤＮＡ芯片快速检测耐利福平结核分枝杆菌ｒｐ０Ｂ基因突变［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００３。２６（１１）：６８０一６８２．（收稿：２００９―０５―２ｌ编辑：陈兵）Ｒａｐｉｄｉｄｅｎ“ｆｉｃａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｅｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｄａｌｅｖｅｌｂｙｐｏｌｙｍｅｒａ∞ｃｈａｉｎＭａｃｔｉ∞［１３］王忠仁，张宗德，张本．非结核分支杆菌病的流行趋势［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２０００，２３（５）：２６３―２６５．［１４］结核分枝杆菌病诊治进展研讨会纪要［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２０００，２３（５）：２７８．卸ｄｒｅｓｔ―ｃｔｉｏｎｅｎｚｙＩＩｌｅａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＪｃｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏＩ，１９９３．３ｌ（２）：１７５一１７８．［２０］Ｇｉｎｇｅ瑚ＴＲ，Ｇｈ蛐ｄｏｕｒａ１．Ｓｉｍｕｈａｎｅ叫８ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｍｙｃｏｂａｃｔｅｄｕｍＧ，ｗ粕ｇＥ，ｅｔｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ帅ｄＢｐｅｃｉ∞ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｐａｔｔｅｍｇｅｎｅ―ｃｕｓｉｎｇ鲫ａｌｙｓｉｓ［１５］刘敬东．非结核分枝杆菌病ｌ临床研究现状［Ｊ］．浙江临床医学，２００３，５（９）：６４ｌ一６４２．ＤＮＡ椰ｙｓ［Ｊ］．ＧｅｎｏｍｅＲｅ８．１９９８，８（５）：４３５―４４８．［２１］ｆｊｏｄｏｒｓＰ．ＲｅａｄＪＬ，１）ｉｒｍｎｇＭｃ，ｅｔａ１．［１６］ＶａｎｅｅｃｈｏｕｔｔｅＭ，ＣＩａｅｙｓＧ，ｅｔＤｅａ１．ＢｅｅｎｈｏｕｗｅｒＨ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ“ｏｎｂｙｕ６ｉｎｇＬｉｇ｝ｌｔ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ，ｐａｍｉｉｅＩｃｈｅｍｉｃａｌｓｐ砒ｉａｌｌｙａｄｄｍｓ６ａｂｌｅｏｆｓｙｎｔｈＰ面９［Ｊ］．ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ―ｕｍ８ｐｅｃｉｅｓａｍｐｌｉ６ｅｄ１９９ｌ，２５ｌ（４９９５）：７６２―７６３．ｒｉｂｏｓｏ啪ｌ２０６５．ＤＮＡｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ３ｌ（８）：２０６ｌ一［２２］ＴｈｌａａｔＡＭ，ＨｕｎｔｅｒＰ．ＪｏｈｎｓｔｏｎＳＡ，ｅｔａ１．Ｇｅｎｏｍｅ?ｄｉｒｅｃｔｅｄｐｒｉｍｅ瑁ｆｏｒ肫ｌｅｃｔｉｖｅｌａｂｅｌｉｎｇ０ｆＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ。１９９３，ｂａｃｔｅｒｉ址ｔ舢ｓｅ＾ｐｔＢａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ｆｏｒＤＮＡ［１７］ＫｉｒｓｃｈｎｅｒｎｕｃｌｅｉｃｒｅｐｏｒｔＰ，ｓｐｒｉｎｇｅｒＢ，Ｖｏｇｅｌｕ，ｅｔａ１．ｏｆｍｙｃｏｂａｃｔｅｄａｍｉｃｍａｒｒａｙＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏＩ，Ｇｅｎｏ帅ｉｃｉｄｅｎ嘲ｃ“ｏｎ们ｉｄａｂｙ２０００。１８（６）：６７９―６８２．［２３］１’ｒ（）ｅＢｃｈＡ，ＮｇｕｙｅｎＨ．ＭｉｙａｄａｃＧ，ｅｔａＩ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｉｆａｍｐｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：ｉｎａｏｆ２－ｙｅａｒｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｐｅｃｉ的ｉｄｅｎｔｍｃａｔｉｏｎ帅ｄｔｅ￥ｔｉｎｇｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［Ｊ］．ＪｃｌｉｎＭｉｃｎ，ｂｉｏｌ，１９９３，３ｌｒｅｓｉ目ｔ蚰ｃｅｗｊｔｈｈｉｇｈ?肠道相关淋巴样组织与肠道黏膜免疫王为综述周国华审校肠道黏膜免疫系统主要是指肠道相关的淋巴样组织（ｇｕ卜ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｉｄｌ肠道相关淋巴样组织１．１成浆细胞前体的位点。ＰＰ结生发中心的是派伊尔结（Ｐｅｙｅｒ’ｓｐａｔｃｈｅｓ，ＰＰ）ｔｉｓｓｕｅ．ＧＡＬＴ），是全身最大的淋巴器官。根据形态、结构、分布和功能，可将ＧＡＬＴ分类为两大部分．即有结构的组织黏膜滤泡和广泛地分布于黏膜固有层中的弥漫淋巴组织川。黏膜滤泡是免疫应答的传人淋巴区，又称诱导区，抗原由此进入ＧＡＬＴ．被抗原呈递细胞捕获、处理和呈递给免疫活性细胞，诱发免疫应答：而弥漫淋巴组织是免疫应答的传出淋巴区．又称效应区，浆细胞和致敏淋巴细胞通过归巢机制迁移至弥漫淋巴组织．抗体和致敏淋巴细胞在此发挥生物学功能Ⅲ。小肠的黏膜滤泡组织。主要位于远端小肠的黏膜固有层。在回肠末端最为明显。ＰＰ是一种白色椭圆型微微隆起的结构。凸现在小肠系膜对向部，与肠腔仅隔一层上皮细胞。ＰＰ由许多淋巴滤泡聚集而成．每个ＰＰ约含淋巴滤泡５―９００个，此数目随年龄而有变化。根据Ｔ细胞和Ｂ细胞的分布特点．可将ＰＰ划分为三个区，即滤泡区（ｆｏｕｉｃｔｌｌａｒａ陀ａ），上皮下圆顶区（ｓｕｂｅｐｔｈｅｌｉａｌｄｏｍｅ大多数淋巴细胞是产生表面Ｉ酣的细胞，它们是构成ＰＰ中分泌Ｉ外细胞的主要部分。这是与一般淋巴器官的生发中心不同所在。滤泡间区（ｉｎｔｅ而ｌｌｉｃｕＬ盯ａｒｅａ），也称滤泡旁区（ｐａｒａＪ．０１ｌｉｃｕｌａｒａｒｅａ）是Ｔ细胞所在区，占ＰＰ结内细胞数量２５％～３５％，称胸腺依赖区。此区还分布毛细血管后微静脉．是淋巴细胞进出淋巴组织的通道，此区内也有许多Ｂ细胞及浆细胞。在滤泡及生发中心内也可见到一些Ｔ细胞．肠道Ｐｅｙｅｒ’ｓ结表面的滤泡相关上皮（ＦＡＥ）与滤泡之间的区域为上皮下圆顶区（ｄｏｍｅａｆｅａ），此区内既有Ｔ细胞、Ｂ细胞．又有特殊化的抗原识别细胞或称Ｍ细胞．它吞饮肠腔内多种抗原。抗原被转运到ＰＰ，在滤泡区受到加工，引起抗原特异性Ｂ和Ｔ淋巴细胞兴奋。随ａｒ；ｅａ）及滤泡间区（ｉｎｔｅ血１１ｉｃｕｌａｒａｒｅａ）。滤泡区靠近浆膜面．主要由Ｂ细胞组成。无菌动物的滤泡无明显的生发中心，受抗原刺激后．或肠道受感染后．滤泡内可出现明显的生发中作者单位：４２ｌ００２湖南省衡阳市．中国人民解放军１６９医院心…。生发中心是抗原诱导Ｔ细胞依赖性增殖、前间Ｂ细胞分化以及Ｂ细胞分化万方数据包含各类专业文献、中学教育、高等教育、文学作品欣赏、应用写作文书、外语学习资料、专业论文、12基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测方面的研究进展等内容。
　笔者欲从副结核分枝杆菌的分子病原学,检测技术 及疫苗的研究进展进行综述。 ...个牛分离株,鉴定了在羊分离 株中有 3 个大的基因缺失,共 29208bp 包括 24... 　基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性 作者: 张瑞梅, 刘成永, 申涛, 刘汀 作者单位: 江苏省徐州市传染病医院 结核科, 221004 【摘要】 目的 研究基因... 　结核分枝杆菌的研究进展_基础医学_医药卫生_专业资料...有研究通过基因芯片技术来分析比较结核杆菌基因组的...结核分枝杆菌对很多常用的一线药物都产生了抗药性。 ... 　基因芯片技术在病原微生物耐药性检测中的应用_医药卫生...基因芯片技术的主要研究步骤是什么?他在病原体耐 ...首 先我们看结核分枝杆菌这张片子, 现实的是对于... 　基因芯片技术,噬 关键词 菌体裂解技术 1882 年,...从未停 止过对结核分枝杆菌以及抗结核药物的研究。...性分析法(PCR-SSCP),主要用于结核杆菌耐药性的检测... 　[8] 张俊仙,吴雪琼.基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测方面的研究进展.实用 医学杂志,):. [9] [10] 徐炳森,邵建忠.几... 　现就结核 分枝杆菌特异性抗原检测的研究进展做一综述。 1 结核分枝杆菌特异性抗原检测的技术方法 1.1 凝集试验(Agglutination test) Krambovitis 等[1]于1984年... 　基因芯片技术在微生物检测中的应用摘 要: 基因芯片...3.4 在微生物菌种鉴定中的应用 利用基因芯片杂交...基因分型与菌种鉴定,筛选监测结核分枝杆菌 利福平抗... 　RFP) 、链霉素(SM) 、 乙胺丁醇(EMB)耐药性检测...1 材料与方法 1.1 菌株来源 79 株结核分支杆菌...预防控制中心结核病预防控制所负责传代培养、鉴定和...悬赏20爱心点
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就是没有检测出来的意思吧！
基因是DNA分子上的一个功能片断，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子；基因决定人的生老病死，是健康、靓丽、长寿之因，是生命的操纵者和调控者。因...
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71实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用3
42临床检验杂志2007年第25卷第1期Chin；文章编号:07)0120；?研究生园地?；实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初；步临床应用；严子禾；1,2；,潘世扬,陈丹,高丽,谢而付,；黄佩；1；,戎国栋,杨笛,童明庆,张寄南(1.南京医科大学；医院临床检验中心,南京.南京医科；摘要:
42　临床检验杂志2007年第25卷第1期　ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vol125,No11　文章编号:07)　　　中图分类号:Q503　　　文献标识码:A?研究生园地?实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初3步临床应用严子禾1,2,潘世扬,陈丹,高丽,谢而付,黄佩111111111,戎国栋,杨笛,童明庆,张寄南(1.南京医科大学第一附属医院临床检验中心,南京.南京医科大学附属无锡市第二人民医院检验科,江苏无锡214002)摘要:目的　评价实时荧光定量PCR技术检测血浆(或血清)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)DNA的技术。方法　建立实时荧光定期量PCR方法测定血浆MTBDNA,分别检测临床确诊的55例结核病患者血清43份,血浆25份以及非结核肺部疾病患者血清18份,健康体检血清18份和健康体检者血浆11份的MTBDNA含量。结果　18例非结核肺疾病患者血清、18例健康体检者血清以及11例健康体检者血浆MTBDNA全部阴性。55例初诊结核患者中10(18.2%)治疗前血浆(或血清)MTBDNA阳性,在痰涂片阴性的18例结核患者中,血浆()BDNA8%(5/18),其特异性达100%。结论　本研究证实了结核患者血浆(或血清)循环MTB,结核病诊断有重要参考价值。关键词:结核分枝杆菌;血浆　　上世纪,分枝杆菌DNA(MycobacteriumtuberculosisDNA,MTBDNA)阳性,并从理论上证明了亚临床结核菌血症[1]的存在。国内外尚未见循环MTBDNA定量检测的相关报道。本研究建立荧光定量PCR和标准曲线的方法,检测结核病患者血浆(或血清)MTBDNA,并探讨本法的临床应用价值。1　材料与方法1.1　样本收集　月,自无锡市传染病(AmershamBioscience)、7500荧光定量PCR扩增仪(AppliedBiosystems)、琼脂糖凝胶电泳仪(Bio2Rad)、凝胶成像分析系统(Kodak)、PTC100PCR扩增仪(MJ)。1.3　试剂　M7H9液体培养基(OrganonTeknika公司),磁珠法血浆DNA提取试剂盒(上海浩源公司),琼脂糖、异丙醇、氯仿(Sigma公司),热启动Taq酶、dNTPs购自大连Takara公司。MTBTaqMan医院收集确诊为结核病的患者血清(带分离胶促凝管,室温3000r/min离心10min,取上清)30例(男性27、女性3),其中,20例患者仅有治疗前1份血清,7例患者有治疗前后2份血清,3例患者有治疗前后3份血清,血清标本总数43份;同时,收集了非结核肺疾病患者血清18份和健康体检者血清18份。月,自无锡市传染病医院收集确诊为结核病的患者抗痨治疗前的血浆(EDTA抗凝管,室温3000r/min离心10min,取上清),共25例(男21,女4);同时收集健康体检者血浆11份。1.2　仪器　Bact/Alert3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、JY922ⅡD超声波细胞粉碎机、Jouan温控高速离心机、GeneQuantpro紫外分光光度计3荧光探针和引物合成参照文献,序列如下:上游引物:5′2GGCTGTGGGTAGCAGACC23′;下游引物:5′2CGGGTCCAGATGGCTTGC23′,由上海英骏(in2vitrogen)公司合成;TaqMan荧光探针:5′2JOE2TGTCGACCTGGGCAGGGTTCG2ECLIPSE23′,Takara公司合成;预期产物长度163bp。1.4　MTBDNA的提取及标准品的制备　参照文[2]由献[3]。1.5　血清(血浆)MTBDNA的提取　所收集的79份血清(结核患者43份,非结核肺部疾病患者血清18份,健康体检血清18份)和36份血浆(结核患者血浆25份,健康体检者血浆11份)按磁珠法操作说明书进行DNA的提取。提取的DNA样本置-20℃冰箱保存。[3]1.6　MTBDNA荧光定量PCR扩增　参照文献。基金项目:江苏省政府“135”重点实验室基金资助项目(SK200205)。　　　　作者简介:严子禾,1969年生,女,副主任技师,在职硕士研究生。　　　　通讯作者:潘世扬,教授,南京医科大学第一附属医院/南京医科大学第一临床医学院检验系,电子信箱:sypan@/labmed@。　临床检验杂志2007年第25卷第1期　ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vol125,No11　43PE7500分析软件设定基线(baseline)和阈值(thre2should),以模板起始浓度的对数值为横坐标,Ct值为纵坐标,构建标准曲线。每一个标准点重复两次,观察曲线的斜率和相关系数,通过斜率计算扩增效21/k率。公式为E=1021(E为扩增效率,K为标准曲线的斜率)。1.7　统计学分析　采用Stata7.0统计软件进行比为阳性;经过抗痨治疗2周后,有3例由阴性转为阳性(其中2例为结核性胸膜炎),而仅有的2例阳性均转为阴性。MTBDNA含量与患者性别、年龄无关,与痰涂片结果无关。3　讨论较分析,率的比较采用χ检验。2　结果2.1　结核杆菌DNA的定量　紫外分光光度法检测提取的MTBDNA浓度为8.03μg/ml(A260/A280=1.78),根据Genebank数据库中MTB基因组大小,2本研究采用磁珠吸附法提取血浆(或血清)游离DNA,通过实时荧光定量PCR,特异性扩增MTBDNA并采用标准曲线方法对其进行定量。结果显示,所有对照组样本均为阴性,显示了100%的检测特异性。在总共55例结核患者中,18例血浆(MTB.8%(5/18)。(联合检测,MTBDNA检计算其浓度为1.66×10copies/ml。2.2　MTBDNA标准曲线　图1为MTB品扩增曲线,,测。MTBDNACt=-3.3727logC0+34.56,线性范围达2×10～10copies/ml,最低可检测1copy/反应管,Ct值和起始模板浓度对数值的相关系数为0.998。扩增效率根据标准曲线的斜率计算得到,达98%。9测结果显示,仅有的2例阳性患者在经过2周治疗后,均转为阴性,提示疾病的良性转归。另一方面,抗痨治疗有效时,寄生细胞内的结核杆菌死亡破裂,结核杆菌DNA大量释放。本研究发现,8例阴性患者中有3例经过治疗转为阳性,提示该指标可作为抗痨治疗疗效评价的指标之一。经治疗转阳的3例患者中,有2例为结核性胸膜炎,可能与该类型结核病的病理特征有关,能否为结核性胸膜炎的临床诊断和疗效评判提供依据尚待进一步研究。55例结核患者MTBDNA的检测证实了循环系统中外源性MTBDNA的存在,MTBDNA含量与患者性别、年龄无关,与痰涂片结果无关,可能与抗结核治疗的疗效有关。以血浆(或血清)作为标本检测MTBDNA,其污染机会少,可免除前处理,样本均一,容易做到标准化定量检测,具有痰液和全血标本无法比拟的优越性。参考文献:[1]王苏民.结核病及其实验技术的现状与展望[J].中华检验医学图1　MTBDNA扩增曲线2.3　临床结核患者血清(血浆)MTBDNA的检测结果　18例非结核肺疾病患者血清、18例健康体检者血清以及11例健康体检者血浆MTBDNA扩增全部阴性。55例临床结核患者痰涂片阳性37例,阴性18例。在痰涂片阴性的18例患者中,血浆(或血清)MTBDNA阳性检出率为27.8%(5/18)。在10例抗痨治疗前后采集2份或3份血清的结核患杂志,):71272.[2]ClearyTJ,RoudelG,CasillasO,etal.RapidandspecificdetectionofMycobacteriumtuberculosisbyusingthesmartcyclerinstrumentandaspecificfluorogenicprobe[J].JClinMicrobiol.):.[3]严子禾,潘世扬,陈丹.4种血浆游离DNA提取方法的比较[J].临床检验杂志,):3632365.者中,治疗前有8例其血清MTBDNA为阴性,2例44　临床检验杂志2007年第25卷第1期　ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vol125,No11　ClinicalapplicationofquantificationofMycobacteriumtuberculosisDNAinplas2mabyreal2timePCRYANZi2he,PANShi2yang,CHENDan,GAOLi,XIEEr2fu,HUANGPei2jun,RONGGuo2dong,YANGDi,TONGMing2qing,ZHANGJi2nan(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstClinicalMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China)Abstract:ObjectiveToevaluatethevalueofquantitativefluorescentPCRfordetectionofMycobacteriumtuberculosis(MTB)DNAinplasma(orserum).MethodsThecontentofMTBDNAinthefollowingsampleswasdetectedbyreal2timePCR,including43seraand25plasmasfromtuberculosispatients,18serafromthepatientswithnon2tuberculosispulmonarydiseaseand18seraand11plasmasfromhealthyvolunteers.ResultsMTBDNAwasnegativein18serafromthepatientswithnon2tuberculosispulmonarydiseaseandallthespecimens(serumandplasma)fromhealthyvolunteers.ThepositiverateofMTBDNAin55tuberculosispatientswas18.2%(10/55).Thepositiveratewas27.8%insmear2negativeTBpatientscomparedwith13.5%insmear2positivepatientgroup.ThespecificityofthedetectionofMTBDNAwas100%.ConclusionsThisstudyconfirmedexistenceofDNAinplasmaandserumoftuberculosispatientsandshowedthatthedetectionofMTBmayprthediagnosisofsmear2negativeTBpatients.Keywords:Mycobplasma(收稿日期:)(本文编辑:陈维忠)(上接第35页)2　结果呈中度负相关,r=-0.5517,P&0.01;PLG:A和AT:A呈中度正相关,r=0.5415,P&0.01。结果见表1、表2。表2结果相关性分析:PLG:A与vWF表1　NS患儿AT:A、PLG:A、vWF、Fib、D2D含量与正常对照组检测结果比较(x??±s)组别NS例数4330AT:A(%)534.60±25..01PLG:A(%)69.33±16..786.74&0.01vWF(%)221.42±61..369.31&0.01Fib(g/L)5.11±0.982.81±0.68)11.84(t′&0.05D2D(mg/L)1.00±0.750.35±0.30)5.13(t′&0.05正常对照tP表2　NS患者治疗前后AT:A、PLG:A、vWF、Fib、D2D的结果比较(xs)??±组别NS治疗前　治疗后正常对照q1q2q3例数232330AT:A(%)56.57±38...116.96,P&0.013.16,P&0.0512.88,P&0.01PLG:A(%)66.43±18...786.51,P&0.011.91,P&0.058.84,P&0.01vWF(%)230.23±52...3611.38,P&0.011.85,P&0.0513.90,P&0.01Fib(g/L)5.21±1.022.93±1.012.81±0.6812.19,P&0.010.68,P&0.0513.65,P&0.01D2D(mg/L)1.06±0.570.51±0.210.35±0.30H=13.19,P&0.01H=2.13,P&0.05H=14.52,P&0.01　　注:q1为NS治疗前vs治疗后,q2为治疗后vs正常对照组;q3为治疗前vs正常对照组;D2D为秩和检验H值。3　讨论免疫内环境紊乱、感染、损伤等原因可能导致肾脏抗原性质改变或使隐蔽的抗原决定簇暴露,产生直接针对肾脏组织结构的自身抗体,导致肾小球微血管内皮细胞的损伤,释放组织因子(TF)激活外源凝血途径,并激活巨噬细胞及暴露内皮细胞破损表层等激活内源凝血途径,引起肾内的高凝状态,既而引发纤溶途径的激活。内皮细胞能产生抗血栓物质(PLG、AT2Ⅲ、t2PA等)和促血栓物质(PAI21、vWF、血管紧张素等),两者的平衡对维持正常的出凝血状态至关重要。可见内皮细胞损伤也是NS发生发展的重要因素。本实验NS患者血浆vWF、Fib、D2D较正常对照明显增高,而PLG:A、AT:A明显降低,表明NS患儿的内皮细胞有一定程度的受损,导致由内皮细胞产生并释放的促血栓物质增多及抗血栓物质减少,是NS发生发展的一个重要原因,如治疗有效,各指标均趋向于正常,而PLG、vWF等比AT:A恢复得更快,因此临床上可以通过检测上述指标衡量NS患者内皮细胞的受损程度及凝血纤溶系统的激活情况,对病情的估计、预后、治疗具有一定的指导意义。(收稿日期:,修回日期:)(本文编辑:陈维忠)包含各类专业文献、应用写作文书、中学教育、幼儿教育、小学教育、专业论文、外语学习资料、71实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用3等内容。
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