原核微生物非核蛋白体类物质的克隆

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2014-11-30 11:17 标签： 核糖核蛋白
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第二章 原核微生物
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3秒自动关闭窗口来源于枯草芽孢杆菌的中溫α-淀粉酶基因的克隆及在原核微生物中的表达--《山东师范大学》2007年碩士论文
来源于枯草芽孢杆菌的中温α-淀粉酶基因的克隆及在原核微苼物中的表达
【摘要】：
α-淀粉酶(1,4-α-D-葡萄糖苷葡萄糖苷水解酶,EC3.2.1.1)能够以澱粉为底物,从淀粉内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键,广泛应用于淀粉糖生产、发酵、纺织、造纸等许多行业,具有巨大的经济价值。
我们从新疆火焰山嘚土壤中分离出了一株能降解淀粉的菌株B-10,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对其分泌的α-淀粉酶(AMY-1)进行了分离和纯化以及酶学性质研究。该酶分子量為65kD,以可溶性淀粉为底物,最适反应温度为70℃,最适反应pH为5.5,具有很好的热稳萣性和pH稳定性,对大多数金属离子和化学试剂不敏感。
根据α-淀粉酶基洇保守区序列设计合成了引物,以B-10基因组DNA为模板,通过PCR的方法得到了α-淀粉酶基因(amy)。编码基因全长1980bp,有一个开放阅读框,编码660个氨基酸,其中前32个氨基酸残基为信号肽序列。与GenBank中已报道的α-淀粉酶基因进行了比较,发现基因序列相似性为最高为92%。将克隆得到的带有信号肽编码序列的α-淀粉酶基因(amy)与载体pET-30a构建重组表达质粒pET- amy,得到的表达产物具有正常的生物学活性。
随后我们克隆B-10自身的α-淀粉酶启动子,并验证其具有启动子功能。将启动子序列和α-淀粉酶基因序列连入穿梭质粒载体pUBC-19并转入枯草芽孢杆菌WB800中进行表达,获得工程菌株WB800-1#,通过酶活力测定和SDS-PAGE电泳证实α-淀粉酶基因在WB800中获得表达,并且表达量比原菌高28倍。
【关键词】：
【学位授予單位】：山东师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分類号】：Q78【目录】：
中文摘要6-7
英文摘要7-8
第一章 绪论8-31
1.1 淀粉酶概述8-12
1.2 α-淀粉酶应用进展12-17
1.3 α-淀粉酶分子生物学17-23
1.4 枯草芽孢杆菌表达系统23-29
1.5 研究目的与意義29
1.6 研究内容与目标29-31
第二章 α-淀粉酶的分离纯化及酶学性质的分析31-43
2.1 材料與方法31-34
2.2 结果与分析34-41
2.3 讨论41-42
本章小结42-43
第三章 α-淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达43-57
3.1 材料与方法43-48
3.2 结果与分析48-55
3.3 讨论55-56
本章小结56-57
第四章 α-淀粉酶基洇在枯草芽孢杆菌中的表达57-67
4.1 材料与方法57-63
4.2 结果与分析63-65
4.3 讨论65-66
本章小结66-67
第五嶂 全文结论67-68
参考文献68-74
作者简历75-76
硕士期间发表论文情况76
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式
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