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亲和沉淀主动RHO上皮细胞裂解液中使用的GST标签的突变Rho蛋白（GST-RhoA蛋白（G17A））全环基金
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
这里介绍的方法检测，按照激活RhoA的具体GDP / GTP交换因子（全环基金）在培养细胞中的突变RhoA的GST融合蛋白具有高亲和力激活全环基金的使用。全环基金沉淀的细胞裂解物，免疫印迹和密度定量检测。
Date Published: 3/31/2012, ; doi:
Keywords: , , , , , , ,
Waheed, F., Speight, P., Dan, Q., Garcia-Mata, R., Szaszi, K. Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates. J. Vis. Exp. (61), e3932, doi:10. (2012).
Rho家族小GTP酶的蛋白质是细胞骨架的中央监管机构，并控制多种细胞过程，包括细胞迁移，基因表达，细胞周期进程和细胞粘附1。 RHO蛋白质是活跃的分子开关是在GTP结合，并在国内生产总值的束缚态无效。其激活介导的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的蛋白质家族。卢全环基金构成一个大家族，重叠的特殊性2。虽然已经有很大进步作出识别激活特定信号的全环基金，仍然有许多问题，其余有关的具体规定，这些蛋白质的途径。的Rho环基金的数量超过70，每个单元表示一个以上的全球环境基金的蛋白质。此外，许多这些蛋白质激活不仅RHO，但其他家庭成员，进一步促进监管网络的复杂性。重要的是，探索全环基金如何监管要求的方法，按照不同的刺激活化细胞活跃的个人全环基金池。在这里，我们提供的方法来评估和量化提供积极具体的Rho-环基金使用亲和沉淀法一步一步的协议。此法是几年前开发Burridge实验室3,4和我们用它在肾小管细胞株5,6,7。该法的“核苷酸自由”突变RhoA的优势，为活跃的全环基金的高亲和力。突变（G17A），使蛋白质无法结合GDP或GTP和这个国家模仿的中间状态，则势必对全球环境基金的。 GST标签的版本的这种突变蛋白表达和纯化从E.大肠杆菌 ，势必谷胱甘肽琼脂糖珠和沉淀活跃未处理和刺激细胞裂解全环基金。作为最全环基金被激活，通过翻译后修饰或释放抑制绑定，他们的活动状态被保留在细胞裂解物，他们可以通过检测此法8。捕获的蛋白质可以被探测已知的全环基金通过检测特异性抗体，用免疫印迹，或通过质谱分析，以确定某种刺激激活的未知全环基金。
1。 大肠杆菌的转型大肠杆菌与PGEX-RhoA蛋白（G17A）结构准备LB琼脂溶解在100毫升DH 2 O 2.5克LB和1.5克琼脂高压灭菌和冷却估计50-55°C，这作为一个经验法则，是当烧瓶可以舒适举行。 准备氨苄青霉素（Amp）的股票，通过溶解在DH 2 O 50毫克/毫升注射器过滤器和冻结闲置等分。从1.1 LB琼脂加入100安培股票μL（终浓度为50微克/毫升）。涡流混合，倒入10厘米细菌菜（15-20毫升/皿）。允许它巩固（15-30分钟）和4未使用的板倒°C间储存为2-3周。 改造E。大肠杆菌 ，快速解冻DH5α感受态细胞分装在冰浴。新增1μlpGEXRhoA（G17A）稀释至25-50 ng /μl的DNA的。轻弹管混合并在冰上孵育30分钟。在42℃热休克45秒和地方上冰2分钟。新增900万亩，L SOC培养基，用颤抖的增长在37°C一小时 50-100μl转化细菌的传播LB琼脂放板使用巴斯德吸管弯曲无菌。在37℃培养箱中孵育板右侧5分钟，然后反转和成长过夜。 板准备的GST标签蛋白（步骤2.1）将有所回升，从一个单一的殖民地。以供将来使用，包装和储存板倒在4°C，约3个星期。此外，细菌的股票，可以更长时间的存储准备在2毫升无菌的LB放大器在37°C过夜，用颤抖的日益增长的个人殖民地。混合等分无菌甘油以1:1的比例，并冻结80％-80°C。
2。制备GST-RhoA蛋白（G17A）珠准备加入25克磅到1升卫生署2 0和灭菌LB。当冷却，加入50μl的放大器，从股票到50毫升LB（50μg/ ml的最终浓度）。接种与一个孤立的山坳ony转化细菌和增长在37°C，搅拌过夜。当全密度（OD值600& 1.0）稀释450毫升LB放大器和一个额外的30分钟增长在37°C。 准备通过溶解在10毫升DH 2 O 0.238?100毫米原液的异丙基BD-硫代半乳糖苷（IPTG）在分装储存于-20°C诱导细菌产生Rho蛋白加入500μLIPTG的100毫米至500毫升的文化（终浓度为100μm）。温度降低到22-24℃，成长为?16 H小时。
10分钟的自旋文化在4°C，在3600?如果需要的话，500毫升的文化可分为50毫升离心管。冻结颗粒（S）至少1小时（或最好过夜），在-80°C。 准备200毫升裂解液中含有20毫米肝素钠（0.95克）/ pH值7.5; 150 mM氯化钠（1.75克）; MgCl 2的 5毫米（0.203克），1％TX-100（2毫升）。准备1M DTT（1.542克10毫升DH 2 O的股票解决方案）和100毫米PMSF（0.174 g/10毫升乙醇）。准备裂解液+，补充10毫升为1mM DTT（10微升）的股票和1毫米PMSF（100μL的股票）和一个完整的迷你蛋白酶抑制剂片。 冰工作，加入裂解液10毫升+从步骤2.3颗粒。悬浮彻底温和涡旋和吸取。避免起泡。超声波清洗1分钟，有50％的脉冲4冰。在15,000-20,000?旋转声振裂解液在4°C 15分钟，取出澄清的超声粉碎（上清）无菌管上限15毫升。 准备轻轻含有75％到15毫升管的泥浆和转移335μL混合原管谷胱甘肽琼脂糖凝胶。使用大口径的尖端吸取珠。加入10毫升冷PBS，旋转500克为5分钟，在4°C。弃上清，加入1 mL裂解液+珠和自旋为以前的洗。弃上清，加入裂解液+，使50％的泥浆。 加入250μL的角球从2.5步上清ibrated珠浆。在4°C旋转45分钟。 准备500毫升哈佛商学院，含有20毫米肝素钠（2.38克）/ pH值7.5和150 mM氯化钠（4.38克）在DH 2 O准备1M氯化镁2 DH 2 O的 10毫升（0.952克）和1M DTT（1.542克）10毫升DH 2股票解决方案。准备哈佛商学院+，补充100毫升，只是在使用前用5毫米MgCl 2的现货（50μL）和1 mM DTT（100μL股票）。 旋转5分钟从2.7步珠在4°C，500克倒掉上清，洗珠2X裂解液+ 10毫升，10毫升沸+和2倍。最后一次洗涤后重新悬浮在哈佛商学院的珠子+辅以BD BaculoGold蛋白酶抑制剂（20μL50X的BD BaculoGold /毫升），使50％的料浆。 稀释10μl2X Laemmli样品含有β-巯基乙醇的缓冲准备最后的珠子的。使牛血清白蛋白（BSA）的标准。使用2毫克/毫升股票（BSA的0.02克10毫升DH 2 O）的。 10μL股票混合10微升的Laemmli（最后20微克）; 5μL5μLDH 2 O和10μL的Laemmli（最后的10微克）的股票;和2.5微升7.5μLDH 2 O和10μL的Laemmli股票（最后5微克）。煮沸所有样品（5分钟）。旋珠样本和运行上清与BSA的标准和10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分子量标记。 在10毫升醋酸，40 mL甲醇和50毫升DH 2准备（0.1克）和脱色液（500毫升，400毫升的甲醇和醋酸100毫升DH 2 O的 ）Comassie蓝染色。在室温下储存。凝胶染色20-30分钟，去除染料（可重复使用多次）和脱色液冲洗两次。继续脱色轻轻摇动几个小时，直到乐队都清晰可见。 估计耦合珠BSA的标准作为参考（ 图2）使用浓度的GST-RhoA蛋白（G17A）。 aliquot的等量含1.5毫升微型离心管?10-15微克蛋白珠。商店珠在4°C，在一天之内使用。冻结在-80°在哈佛商学院的C + + /甘油以3:1的比例，在几天之内使用。
3。全球环境基金Pulldown分析核苷酸RhoA蛋白（G17A）珠增长在10厘米的菜汇合的细胞。血清剥夺至少3个小时的治疗需要。 在步骤2.4准备裂解液+。准备足够的裂解液700μL/碟，再加上一些额外的金额，以便吸取错误。使用前加入蛋白酶抑制剂。 冰工作，从菜培养基，用冰冷的哈佛商学院。删除所有的哈佛商学院和700μL裂解液+添加到每一道菜。旋流板，涵盖所有领域，刮去，并收集到编号为1.5毫升管裂解。自旋为1分，在4°C 15,000?将用于检测上清。 如果你的手机号码是相当于在所有菜被测试，你可以省略做蛋白检测，并移动到步骤3.5。否则每个使用Bio-Rad公司的快速蛋白测定上清液蛋白浓度测量和均衡数量和浓度上清液。总蛋白量取决于（通常1-1.5毫克LLC-PK1细胞蛋白）的细胞类型。 取出30μL2X减少Laemmli样品缓冲液，煮沸30μl每个上清和混合的步骤3.7作废。剩余的上清加入GST-RhoA的珠（G17A）从步骤2.12等分。 45分钟旋转4°C。 旋转10秒珠在4°C，在6800?弃上清，珠裂解缓冲液洗3倍，在同样的方式之间的洗涤纺纱。彻底清除最后洗净，用1毫升注射器装上了地下30针，并添加20μL的2X减少Laemmli样品缓冲液。煮沸5分钟。旋转球珠和运行上清立即（最好）或存储它?-80℃，以后进行分析。 运行20μL总细胞裂解物对你正在研究全球环境基金的规模适当比例的SDS-聚丙烯酰胺凝胶和沉淀的蛋白质样品。通过Western印迹使用特异性抗体检测您所选择的全球环境基金。
4。代表结果该协议第1部分和2描述GST-RhoA蛋白通过SDS-PAGE（见协议大纲图1），再加上谷胱甘肽琼脂糖珠和其测试（G17A）的准备。一个典型的考马斯染色凝胶上图2所示。与洗脱的蛋白质样品应包含在约50 kDa的（ 图2，泳道6）单波段。估计该蛋白的浓度可使用BSA参考样品。在图2的例子中，RhoA蛋白（G17A）浓度估计为15μg/10μL。因此，10μL/管分装准备。典型的产量在我们的手是从10毫升细菌裂解15-20微克蛋白。该协议的第3部分介绍了亲和沉淀法（见概述图1）。一个成功的全球环境基金的检测，检测激活的交换因子GEF-H1的图3所示。 RhoA的蛋白（G17A）抓获一些GEF-H1的对照组（未处理）细胞裂解，表明GEF-H1的基底活动。但是金额沉淀在细胞增加与炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）治疗，肿瘤坏死因子-α激活GEF-H1的5,7与概念一致。重要的是，总的细胞裂解类似GEF-H1基因在控制和治疗的样品量，暗示治疗，并没有改变GEF-H1的水平，并在实验中使用的输入是平等的。
图1。协议的概述。 ove_content“&
图2。代表珠准备协议的结果。一个成功的GST-RhoA蛋白（G17A）珠准备考马斯染色凝胶。使用10％的丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE分离珠样品和BSA蛋白标准。为了测试的珠子，10μL含有GST-RhoA蛋白（G17A）最后珠浆稀释减少Laemmli样品缓冲液和水煮5分钟1:1。珠纺简要上清液装入凝胶。被装在下面的示例：1巷：分子量（兆瓦）（FroggaBio BLUeye预染蛋白质梯）;泳道2-4：牛血清白蛋白（BSA）5，10和20微克; 5巷空巷6：10 μL新鲜配制的RhoA蛋白（G17A）珠。完成分离后，凝胶用考马斯蓝染色后脱色，揭示蛋白质。 GST-RhoA的蛋白（G17A）的分子量约为50 kDa和运行约48 kDa的标记水平。在这个特别的样品GST-Rho蛋白的浓度据估计，约15μg/10μL浆。
图3。代表GEF激活作用的检测显示TNF-α诱导活化的GEF-H1。 5分钟与10 ng / ml的TNF-α的融合的LLC-PK1细胞治疗。治疗后的细胞裂解和活跃全环基金使用的GST-RhoA蛋白（G17A）约束珠被抓获。使用反GEF-H1的抗体（Cell Signaling公司）与西方印迹检测沉淀蛋白质（顶部印迹）和总细胞裂解样品（底部印迹）GEF-H1的存在。请注意在相对等效输入与非治疗细胞TNF-α治疗的沉淀GEF-H1的增加额，说明一个成功的结果。 fig4.jpg“/&
图4。一个“糟糕的结果”。虽然全球环境基金下拉检测导致一些珠拍摄的GEF-H1的，金额从控制沉淀和TNF-α处理的细胞是相同的。因此，肿瘤坏死因子-α，知道在这种情况下，激活了GEF-H1基因没有诱导激活。随后的故障排除在这个特殊的实验表明，TNF-α的使用是不是够新鲜，可能退化。
这里介绍的方法是唯一可用的激活全环基金，可以按照细胞中环基金的积极池非放射性检测。该法是类似以下的小GTP酶的激活以及对Rac和Cdc42全环基金用于检测的降水。这些实验使用不同的GST标签蛋白，并从此处所述的略有差异，但基本步骤是相同的。因此，这个协议可以很容易地被改编为其他小GTPase和GEF激活检测。 最近提出的全球环境基金法修改为9,10核分数申请。随着进一步的修改，在细胞内的其他车厢的GEF激活的测试可能也是可能的。 我们使用该方法的研究激活上皮细胞系5,6,7全环基金。随着一些优化，此法应该是足够的，以检测任何细胞株的全环基金。当adapti吴到一个特定的细胞类型，找到最佳的细胞数量，裂解液量，为全球环境基金和检测方法进行测试（一个很好的抗体免疫印迹很重要）。检测的初始设置，最好是使用一个被称为激活全球环境基金的利息刺激。使用一个未知的刺激时，总是用阳性对照，以验证您的检测工作。此法可用于检测Western印迹称为全环基金的激活。然而，这也足以识别未知的全环基金。对于这一点，从控制和刺激的样本捕获的全环基金应在考马斯染色凝胶分析。只有在刺激的样本中出现的乐队可能包含激活的全环基金，可用于识别发送质谱（如5）。 最后，一个警示说明。该法的基础上，使全环基金活跃的翻译后修饰细胞裂解后保留的假设。事实上，这显然是CA本身为全环基金的数量，因为它的机构，此法已用于各组检测激活不同的全环基金，包括全球环境基金H1，p115RhoGEF和XPLN（如5,11,12,13）。保存的活跃状态，但是可能不会发生在所有全环基金的情况下，因此，可以想象的是，此法不适用于所有的全环基金。它也必须指出，许多环基金发挥对多个小GTP酶的活性。因此，当一个特定的全球环境基金研究，建议，以配合此法与其他小GTP酶，以及研究RhoA蛋白，Rac1和Cdc42功能研究全球环境基金沉淀检测。 在协议中的关键步骤： 转化细菌菌落应挑选新鲜，适当的准备板，放大器，良好的生长和产量，以确保足够的选择。从其他来源获得的细胞转化的条件可能会有所不同，应谘询。 </p& 在4°C水冷解决方案和离心机，应执行协议（从2.3步）的蛋白制备和检测（步骤3.2）的所有步骤。 为了获得均匀的悬浮细菌裂解（2.5步）应该全面和完整的。当裂解细菌，旋涡和吸取裂解交替，同时保持在4°C，并确保超声冰，以防止蛋白质变性。如果使用不同的sonicator模型，条件可能需要进行调整。超声粉碎的珠子孵化应始终在4°C，在肩，以确保足够的约束力，并应小心保持时序一致。
GST-RHO突变有些不稳定时，在细菌中表达，所以最好使用马上或在几天内准备珠。 沉淀法（第三部分）是时间和温度敏感，的主动全环基金可以很容易地从细胞裂解物丢失，这样的步骤，应尽快进行。 以下部分包含了一些故障排除技巧。
没有或突变，在最后的珠子准备RHO蛋白量非常低，这可能会造成低效的诱导，细菌裂解不足，或蛋白质的损失在筹备过程中或存储。为了帮助解决这些可能性，细菌样本进行分析诱导前后。如果是穷人诱导的蛋白质重复使用一个殖民地，从一个新鲜的条纹板或再能干细胞转化的过程。不同的IPTG浓度和诱导时间也应该进行测试。如果裂解不足（即蛋白质仍然代替上清丸）不同的裂解液中的盐和洗涤剂浓度可以尝试。替代超声倍和应考虑设置，前后超声的样品可以通过显微镜检查，以确定裂解效率。
无沉淀，全球环境基金，即使GST蛋白是目前珠：这可能是由于技术问题，在沉淀法，或缺乏真正的研究全球环境基金的使用施加的刺激激活。始终使用已知的刺激作为阳性对照，以验证您的检测工作。在几天之内准备的珠子。如果沉淀法捕捉不到全球环境基金的研究在各种条件下的金额，确认您的全球环境基金是目前是被用来检测（步骤3.3），离心后上清检测。确保所有缓冲区和蛋白酶抑制剂是新鲜的，和冰尽可能快地执行所有步骤。增加输入蛋白量（例如，通过使用从2板/样品的裂解）。如果沉淀实验结果显示，基底降水tation您的全球环境基金，但无明显差异之间的控制和刺激的样品（ 图4），通过验证，应用的刺激工作使用其他已知的影响（例如通过检测的其他信号通路的激活）开始排除故障。考虑改变治疗条件和/或浓度。从文献报告的数据，如何刺激激活RHO或其他信号来预测可能的时间和浓度依赖。优化治疗时间时，使用短期和长期的时间点，作为全球环境基金的激活可能是最好的检测时间点之前以及检测RHO激活。最后，相同的刺激可能会导致不同程度的激活因在细胞反应的变化，引起通道数，细胞汇合，等
作者没有透露。
这项工作是由加拿大健康研究协会（CIHR）（澳门币97774），自然科学和工程研究理事会，加拿大（NSERC，批NR：480619）。 KS是新研究者奖1 KRESCENT（加拿大，加拿大肾脏病学会和加拿大卫生研究院的肾脏基金会联合奖）和安大略省的研究和创新，从早期的研究者奖的收件人。 fw是由李嘉诚奖学金支持。
Catalog Number
pGEX-RhoA(G17A)
available soon
Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3)
Invitrogen
Store -80°C
SOC medium
BioShop Canada
BioShop Canada
Keep sterile
BioShop Canada
Ampicillin
BioShop Canada
Store stock at
-20°C
BioShop Canada
AGR001.500
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside)
Calbiochem
Store stock
solution at -20°C
Glutathione
Sepharose beads
GE Healthcare
17-0756-01
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
BioShop Canada
Sigma-Aldrich
before use
Sigma-Aldrich
OmniPur, EMD Millipore
before use
Sigma-Aldrich
Add just before
Inhibitor 50x
BD Biosciences
before use
Mini, EDTA-free 10x
Roche Group
11 836 170
before use
Sample Buffer 2x
β-mercapt–thanol
Sigma-Aldrich
before use
Coomassie Brilliant
Acetic Acid
Protein Assay
BLUeye ladder
PM008-0500
Table 1. Reagents used
centrifuge
Sorvall, Thermo Scientific
SS-34 Rotor
Use at 4°C
Centrifuge
Sorvall, Thermo Scientific
Use at 4°C
centrifuge
Use at 4°C
INFORS HT Ecotron
AG CH-1403
Bottmingen
Use at 37°C or at 22°C
Sonifier-450
099A CR4012
Use at 4°C
Table 2. Specific equipments used
Jaffe, A. B., Hall, A. R. ho Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. . Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. . J. Biol. Chem. 277,
(2002).Garcia-Mata, R. . Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).Kakiashvili, E. . J. Biol. Chem. 284,
(2009).Waheed, F. . Am. J. Physiol. Cell Physiol. (2010).Kakiashvili, E. . J. Biol. Chem. 286,
(2011).Garcia-Mata, R., Burridge, K. . Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).Dubash, A. D. . PLoS One. 6, e1 (2011).Guilluy, G., Dubash, A. D., García-Mata, R. . Nature Protocols. (2011).Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. . Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. . J. Cell Sci. 120,
(2007).Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. . J. Biol. Chem. 277,
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| ISSN XMyJoVE Corp. | One Alewife Center, Suite 200 | Cambridge, MA | 02140 | tel.rho激酶在乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用
【关键词】& 法舒地尔；缺血再灌注损伤；rho激酶；细胞凋亡
&&& injury in neonatal rat cardiomyocytes
&&& sun junping, zhang juan, song zhaofeng, li xiaoxing, ji xiaoping
&&& (department of cardiology, qilu hospital of shandong university, key laboratory of cardiovascular
&&& remodeling and function research, chinese ministry of& education& and public health, jinan 250012， china)
&&& to investigate the effects of rhokinase on ischemia/reperfusioninduced cardiac apoptosis and the effects of the rhokinase inhibitor, fasudil on cardiac apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes. methods& neonatal rat ventricular myocytes were prepared from hearts of 12 day old sprague dawley rat pups, and then subjected to ischmemia and reperfusion injury in vitro. cultured neonatal cardiomyocytes were visualized with immunofluorescence staining. cultured cardiomyocytes& were randomly divided into three groups: the control group, the i/r group, and the i/r+fasudil group(treated with three concentrations of 10?&mol/l, 30?&mol/l and 50?&mol/l). the extent of phosphorylation of myosin phosphatase target subunit 1(mypt1) was quantified by western blot analysis, and the activity of the rhokinase. cardiac myocyte apoptosis ratio was determined by flow cytometry with annexinv and propidium iodide（pi）staining. results& cardiomyocyte ischemia reperfusion resulted in a 5.7fold increase in the amount of phosphorylated mypt1 compared with the control group(p＜0.01 ). in contrast, treatment with fasudil at 10?&mol/l， 30?&mol/l and 50?&mol/l attenuated the amount of phosphorylated mypt1 by 24.6%, 40.1% and 60.1%, respectively (p＜0.05). the cardiac myocyte apoptosis ratio were significantly decreased when myocytes was subjected to 3?h and 6?h reperfusion in the fasudil group in a dosedependent fashion compared with the i/r group. conclusions& rhokinase induces cardiomyocyte apoptosis, however, the rhokinase inhibitor, fasudil can decrease cardiomyocyte apoptosis and
&& 细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发生的重要机制之一，是心肌受损、心力衰竭发展的重要因素。关于心肌缺血再灌注的细胞凋亡发生机制尚未明确，探讨心肌缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的作用机制并对其有效干预，对心肌缺血再灌注损伤的防治有重要意义。
&&& rho/rho激酶信号通路与，心力衰竭，心肌梗死和动脉粥样硬化等主要心血管疾病的发生密切相关［1］。研究表明，rho激酶在调节细胞凋亡中亦起重要作用，但rho激酶在心肌细胞的促凋亡作用尚存争议。体外实验证明腺病毒过度表达激活的rhoa作用于rho激酶可导致心肌细胞肥大，继而促发细胞凋亡［2］。但yukiyo等［3］用rho激酶抑制剂y27632干预培养的乳鼠心肌细胞，使心肌细胞的凋亡增加。本实验拟建立乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模型，探讨rho激酶在缺血再灌注心肌细胞是否有促凋亡作用，及rho激酶特异性抑制剂法舒地尔?能否抑制心肌细胞的凋亡而具有心肌保护作用。
&&& 1& 材料与方法
&&& 1.1& 材料& 出生1～2?d的sd乳鼠（山东实验动物中心）；胰蛋白酶为difco进口分装；无糖dmem、高糖dmem、胎牛血清(均为gibco公司)；兔抗pmypt1（thr850）抗体(upstate公司)，兔抗&actin抗体(santa cruz biotechnology公司)；辣根酶标记山羊抗兔igg （北京中杉金桥生物公司);细胞凋亡试剂盒annexin vfitc/pi reagent kit（晶美生物工程有限公司）；盐酸法舒地尔注射液,又名川威（天津红日药业股份有限公司,批号：070605）；ecl试剂（santa cruz biotechnology公司)。
&&& 1.2& 心肌细胞的分离培养& 无菌操作下取出生1～2?d的sd乳鼠心脏，立即在pbs液中洗去残血，用眼科剪将心肌剪成1?mm&1?mm&1?mm大小碎块并用0.125%的胰蛋白酶反复消化4次，收集每次消化的单细胞悬液离心，洗涤后收集悬于含10%胎牛血清的高糖dmem中制成单细胞悬液，差速贴壁法于co2孵箱（50?ml/l co2,37?℃）中培养90?min（使大部分成纤维细胞贴壁）。小心吸出余下富含心肌细胞的悬液接种于培养瓶中。培养72?h换液，继续培养36～48?h后进行实验。
&&& 1.3& 肌钙蛋白抗体免疫荧光染色鉴定& 将原代培养的心肌细胞放入预先放置有载玻片的6孔培养板中培养48?h后，将生长有心肌细胞的载玻片取出pbs洗3次，用4%多聚甲醛固定细胞30?min,用0.3%tritonxpbs通透20?min,5%bsa封闭30?min，加一抗小鼠单克隆troponint抗体（thermo scientific)4?℃过夜。0.3%tritonxpbs洗涤3次，加二抗为fitc标记小鼠抗羊血清（santa cruz biotechnology)，室温避光放置1?h,pbs洗后磷酸甘油封片，倒置相差显微镜下观察。&
&&& 1.4& 心肌缺血再灌注（i/r）损伤模型的建立& 用无血清无糖dmem换置正常培养液，将原代心肌细胞放入自制缺氧装置中，充入混合气体（95%n2，5%co2）后密封，将原代心肌细胞放入培养箱中培养2?h，即为缺氧（缺血）模型。2?h后将培养瓶从自制装置中取出，换成含10%血清高糖培养液，放入培养箱（5%co2，95%空气，37?℃）中，于常氧环境中继续培养3?h和6?h，即为复氧（再灌注）模型。
&&& 1.5& 实验分组和药物干预& 实验随机分为3组：① 正常对照组：正常培养4～5?d，不予i/r处理；② i/r组：行模拟i/r处理，不加药物干预；③ i/r组+药物治疗组：设3个浓度梯度，在实验开始前20?min加入法舒地尔，终浓度分别为10?&mol/l（f1组）、30?&mol/l(f2组)、50?&mol/l(f3组)，再行模拟i/r处理。各组心肌细胞分别用0.125%胰酶+0.01%edta消化约2?min，待镜下观察细胞变圆时收集细胞。
&&& 1.6& western blot法检测rho激酶蛋白表达& 每瓶细胞加入1?ml裂解液ripa(tritonx100,去氧胆酸钠，np4，偏钒酸钠，edta，egta，ixpbs，aprotine等）和pmsf冰上裂解30?min,再将裂解细胞吸入1.5?ml ep管，4?℃，15?000?r/min离心15?min（离心半径8.18?cm）,留取上清液。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。按每孔20?&g蛋白上样行sdspage凝胶电泳，蛋白转移到硝酸纤维（nc）膜（pall公司），用5%脱脂室温封闭2?h,加入兔抗pmypt1（thr850，1∶1?500）抗体，4?℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg（1∶1?000）室温孵育2?h，洗膜3次后，加发光底物暗室暴光1～2?min，显色条带用totallab v2005软件进行辉度分析。以&actin作内参，目的蛋白显色条带辉度与&actin显色条带辉度比值代表目的蛋白相对表达量。
&&& 1.7& 流式细胞仪检测细胞凋亡& 于不同时点用0.125%胰酶+0.01%edta消化贴壁心肌细胞，离心收集各培养瓶心肌细胞，用4?℃预冷的pbs漂洗细胞2次，用250?&l结合缓冲液调整细胞浓度为1&106/ml。应用annexin vfitc/pi试剂盒行annexin v/pi双色标记。应用流式细胞仪检测心肌细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻情况，计算凋亡细胞的百分比。结果判定：annexin v、pi均为阴性为正常细胞，annexin v阳性、pi阴性为凋亡细胞，annexin v、pi均为阳性为坏死细胞。
&&& 1.8& 统计学处理& 采用spss16.0软件行单因素方差分析，实验以&s表示，组间多重比较采用最小显著差法（lsd），两组间的比较采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
&&& 2& 结& 果
&&& 2.1& 培养心肌细胞鉴定& 心肌细胞生长状况良好，形态呈梭形或不规则三角形，胞体有明显折光性。倒置相差显微镜下少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或单层细胞（图1），搏动规则而同步，频率约80～100次/min。用肌钙蛋白抗体行免疫荧光染色证明心肌细胞纯度达90%以上，提示经差速贴壁后获得绝大多数为心肌细胞（图2）。
&&& 2.2& westernblot检测rho激酶蛋白表达& rho激酶蛋白表达通过检测其下游底物磷酸化mypt1(pmypt1)水平。心肌细胞缺血2?h再灌注3?h后,对照组、i/r组、i/r+f1组、i/r+f2组、i/r+f3组 rho激酶蛋白表达情况见图3,提示各组均有rho激酶激活。rho激酶蛋白相对表达量以rho激酶蛋白与&actin western blot电泳条带辉度比值表示。设对照组为100%，i/r组与药物干预组为正常对照组的倍数，见图4。i/r组磷酸化mypt1 水平是正常组的5.7倍(p＜0.01)，说明rho激酶在心肌细胞缺血再灌注后有明显的激活。用f1、f2、f3组法舒地尔干预后，磷酸化mypt1水平较i/r组分别降低24.6%、40.1%、60.1%，差异具有统计学意义（p＜0.05）．提示心肌细胞i/r后有rho激酶激活，法舒地尔对rho激酶有抑制作用，且存在剂量依赖关系。
&&& 2.3& 法舒地尔对i/r损伤后乳鼠心肌细胞凋亡的影响& 乳鼠心肌细胞经缺血2?h,再灌注3?h和6?h后，各组心肌细胞凋亡率见表1。i/r组与对照组相比，细胞的凋亡率明显升高;药物干预组随着药物浓度的增高，细胞凋亡率呈下降趋势，与i/r组比较差异具有统计学意义(p＜0.05),各药物浓度组间差异均具有统计学意义（p＜0.05）。随着再灌注时间的延长，6?h缺血再灌注组和药物干预组的细胞凋亡率明显高于相对应的3?h各组（p＜0.05）。
&&& *3& 讨& 论
&&& 凋亡是缺血再关注损伤发病的重要环节之一，坏死和凋亡共同决定着细胞的丢失程度。gottlieb等［4］在家兔离体心脏灌注模型中发现，缺血30分钟、缺血4.5小时的心脏均无细胞凋亡发生，而缺血30分钟再灌注4小时的心肌出现明显的细胞凋亡。又有研究表明，心肌的凋亡在缺血后即发生，再灌注加重细胞的凋亡［5］。本实验用流式细胞术检测心肌细胞的凋亡，再灌注3小时和6小时后分别测心肌细胞的凋亡率较对照组显著升高，不同浓度法舒地尔干预后的缺血再灌注心肌细胞凋亡率小于单纯缺血再灌注组，药物浓度大，凋亡率下降明显。随着再灌注时间的延长，6小时组心肌细胞的凋亡率明显高于3小时组。以上结果说明心肌细胞在缺血再灌注过程中发生严重损伤，法舒地尔可抑制缺血再灌注心肌细胞的凋亡起到对心肌的保护作用，进而提示rho激酶和缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生密切相关。在不同的细胞类型中，rho激酶可作为抑制凋亡因子，也可作为促凋亡因子。rho激酶抑制剂y27632和ha1077使肝星形细胞［6］和神经母细胞［7］的凋亡明显增加；而最新研究显示rhoa/rho 激酶信号通路通过上调bax引起线粒体途径的心肌细胞的凋亡。凋亡是缺血性心脏疾病细胞死亡的重要方式，是缺血再灌注损伤的特征性的病理生理变化，本实验证明了rho激酶在缺血再灌注心肌细胞的促凋亡作用，为心肌缺血再灌注治疗提供了新的药物靶点。
&&& rho激酶(rock)有两种异构体：rock&和rock,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是目前功能研究最清楚的rho下游靶效应分子。rock接受rho传递的活化信号，发生多个氨基酸位点的磷酸化而激活，并介导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应，从而控制细胞的移动、黏附、趋化和收缩等生物学行为［8］。rho/rho激酶信号通路参与多种心血管疾病的发病，抑制rho激酶对心血管病的防治具有重要的意义。法舒地尔是rho激酶特异性抑制剂，通过与atp竞争rho激酶催化区的atp 结合位点，而抑制rho 激酶的活性［9］。具有特征意义的rho激酶底物是肌球蛋白轻链(myosin light chain，mlc)和mypt1，rho激酶可通过直接作用于mlc或间接作用于mypt1来增加胞浆内mlc的磷酸化，促进肌动蛋白微丝骨架的聚合。在本研究中，rho激酶的活性通过其特异性下游底物mypt1的磷酸化程度来检测。本研究结果显示，体外培养心肌细胞缺血2小时再灌注3小时后rho激酶水平较正常组明显上调，说明心肌细胞缺血再灌注后有明显rho激酶的激活。用法舒地尔干预后，rho激酶水平较缺血再灌注组明显降低。大、中、小剂量的法舒地尔作用于缺血再灌注模型的结果显示，应用大剂量的法舒地尔抑制作用更明显，提示应用法舒地尔治疗时存在剂量依赖关系。bao等［10］用大鼠动物结扎冠状动脉30分钟再灌注24小时建立缺血再灌注模型，结果显示应用rho酶特异性抑制剂y27632梗死面积明显减少，rho激酶的活性也受到明显的抑制，本实验结果与此相符。
&&& 关于rock凋亡机制中的具体基础机制并没完全明确，可能与细胞类型和凋亡刺激物有关。在心肌细胞中，rock1是联系促凋亡刺激物和凋亡间的关键调节子［11］。多种促凋亡刺激物可导致心肌细胞caspase3依赖的蛋白水解和rock1活化，且sirna可通过降低rock1活性阻止神经酰胺诱导的caspase3的活化和细胞凋亡。此外，抑制rock可同时减少细胞凋亡和炎性反应，rock抑制剂的抗凋亡作用也可能与炎症细胞浸润和细胞因子产生有关。rock参与炎症反应的调节，如炎症因子的产生和炎症细的胞浸润，这些炎症反应继而促发凋亡［1213］。
&&& 综上所述，心肌细胞凋亡明确存在于缺血再灌注损伤的过程中,rho激酶导致缺血再灌注细胞凋亡增加，法舒地尔可减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡，有望成为治疗缺血再灌注损伤的有效药物。
【参考文献】
摘自：
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