中国科学990216
SCIENCE IN CHINA
1999年 第<font
face="System" size="2" color="#期 No.2 1999
人肿瘤坏死因子α基因穿梭表达载体的构建和
在鱼腥藻7120中的表达*
刘凤龙　张宏斌　施定基　商之狄　林　晨
邵　宁　彭国宏　张雪艳　张海霞　吴锦银
　王　捷　徐旭东　江悦华　钟泽璞赵树进　吴　F　曾呈奎
　　摘要　报道了人肿瘤坏死因子α（hTNFα）基因穿梭表达载体的构建及其在丝状体蓝藻鱼腥藻7120中的表达和鉴定结果.　将质粒pRL-rhTNF上hTNFα的cDNA连于pRL-439质粒上的PpsbA启动子下游，得到中间载体pRL-TC.　进一步与穿梭质粒pDC-8重组，得到可在大肠杆菌和蓝藻中均可表达的穿梭表达载体pDC-TNF.　pRL-rhTNF，pRL-TC和pDC-TNF三者在大肠杆菌中的表达量分别为11.8%,
16.9%和15.0%.　通过三亲接合转移将pDC-TNF引入鱼腥藻7120中并获稳定遗传的转基因株.　从转基因的鱼腥藻7120中检测到pDC-TNF质粒的存在，且在和TNFα的cDNA探针进行的Southern杂交中呈阳性反应.　抽提转基因藻的蛋白样品进行检测，在Western印迹中和TNFα单克隆抗体呈阳性反应.　采用TNF对L929细胞的细胞毒性方法，证明转基因藻粗提液中,TNF确有细胞毒活性.
　　关键词　人肿瘤坏死因子α　鱼腥藻7120　穿梭表达载体　三亲接合转移　Southern和Western　印迹细胞毒活性
　　肿瘤坏死因子（TNF）是1975年由Carswell等人［1］发现的，人肿瘤坏死因子α（hTNFα）是由激活巨噬细胞产生的一种非糖基化蛋白质，单体分子量约为17
ku，由157个氨基酸残基组成.　三聚体为TNFα的活性形式.　TNFα有多种生理功能，其中最引人注目的是，在体外TNFα能特异性地杀死肿瘤细胞而对正常细胞无不利影响，可能是至今所知抗癌剂中作用最强的.因此，TNFα是有希望的天然抗癌因子之一,特别对消化道系统疾病疗效显著,
国内外都已在临床上进行试验［2］.　然而目前国内外普遍使用的是用大肠杆菌生产的基因工程重组产品［3～6］.　由于大肠杆菌含有内毒素，重组蛋白往往形成包涵体，这使得下游工艺复杂，成本较高.　
　　蓝藻又称蓝细菌，是一类光合原核生物.　由于它结构简单、生长迅速、遗传特性和大肠杆菌十分相近，在分子克隆上易于操作，使得蓝藻的分子生物学在近10年来得到了较快的发展，已经成为基因工程中越来越重要的工具.　早在1987年法国Tandeau
de Marsac等人［7］已把芽胞杆菌毒蛋白基因转入蓝藻试图对蚊子幼虫进行生物防治；1994年Takeshima等人［8］把人超氧化物歧化酶（SOD）基因转入蓝藻表达成功；1993年以来我们与Ren［9，10］把小鼠金属硫蛋白（MT-Ⅰ）基因转入蓝藻并成功得到表达.　由于大多数蓝藻不含内毒素，用它作为宿主来生产重组产品可简化下游工艺，这可能是一条制备重组药物的新途径,
尤其是其粗制品可望制成口服液,可以大大提高其对消化道系统疾病的治疗效果.　
　　本文采用蓝藻作为重组TNFα的宿主，通过基因重组技术将TNFα的cDNA连于穿梭质粒上构建成功穿梭表达载体，进一步在接合质粒和辅助质粒的参与下，通过三亲接合转移法将表达载体引入异形胞丝状体蓝藻――鱼腥藻7120中，并检测到TNFα基因在藻细胞中的表达及其活性.
1　材料和方法
1.1.1　质粒、菌株和蓝藻细胞株　　大肠杆菌Escherichia
coli TG1，质粒pRL-rhTNF来自广州军区广州总医院；质粒pRL-439,
RP4+pRL-542在E.coli HB101中由美国国家植物学实验室C.P.Wolk教授惠赠；鱼腥藻7120（Anabaena
sp. PCC7120 ）来自法国巴斯德研究所.　
1.1.2　工具酶和试剂　　各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、随机引物试剂盒和DNA聚合酶大片段（Klenow）均为Promega公司产品，同位素α-32P-dCTP来自福瑞公司，鼠抗人TNF-α单克隆抗体为北京邦定生物医学公司产品.　
1.2.1　蓝藻的培养　　鱼腥藻7120的培养在BG-11［11］无氮培养基中，温度28～30℃，于光强120～150
μmol/m2.s日光灯下，液体培养时摇床转速为130r/min.
1.2.2　重组DNA技术　　质粒的提取、酶切、片段回收、末端修饰、连接、转化、及琼脂糖凝胶电泳方法均参见文献[12].　
1.2.3　质粒在大肠杆菌中的表达和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析　　质粒pRL-rhTNF表达的热诱导：接种单菌落入含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养过夜.　3%接种量转移过夜培养物到新鲜LB培养基中继续30℃培养至A600=0.4～0.5时,立即转入42℃热诱导表达5～6
　　SDS-PAGE：收集菌体，裂解变性后走SDS-PAGE（12％分离胶），经考马斯亮蓝染色，脱色后用CS-930扫描仪（日本）检测重组蛋白的表达水平.　
1.2.4　三亲接合转移　　基本按文献［13］进行.　(1)
大肠杆菌的准备：三亲接合转移前一天晚上，在含相应抗生素的LB培养基中，分别接种含穿梭表达载体质粒及含接合质粒（RP4）和辅助质粒（pRL-542）的HB101菌，振荡培养过夜，离心收集后重悬于一定体积的BG-11培养基中；(2)
蓝藻的准备：三亲接合转移前更换培养液，继续照光培养一定时间后，离心收集藻细胞，洗涤后重悬于一定体积的BG-11中并做系列稀释；(3)
三亲接合转移：将细菌和藻混合后涂于混合纤维素酯微孔滤膜（φ50，0.45
μm，华美公司）上，在不含抗生素的培养基平板上培养2 d后,连膜转移至含新霉素的BG-11培养基上继续照光培养,直至转化子出现.　
1.2.5　蓝藻质粒的提取　　参照文献［14］进行.　
1.2.6　探针的标记和纯化　　采用随机引物标记系统（Primer-A-gene
system, Promega）,检测TNF-α基因在蓝藻细胞中的存在所用探针为质粒pRL-rhTNF的XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切产生的700
bp DNA片段.　探针DNA变性后，在Klenow酶（5U）作用下掺入α-32P-dCTP（50
μCi），标记反应结束后的DNA样品过Sephadex G-50柱层析纯化后，收集标记的探针峰用于Southern印迹.　
1.2.7　Southern印迹　　DNA样品通过琼脂糖凝胶电泳分离后,经变性和中和后转移至Zeta
probe尼龙膜（华美,0.45 μm）上,将膜于80℃烘烤2 h后,加入预杂交液过夜后,换含放射性探针的杂交液于42℃杂交24
h. 杂交之后的膜在2×SSC，0.1% SDS溶液中室温洗2次，每次30换0.1×SSC，0.1%
SDS溶液于55℃洗膜2次，每次45 min，于-70℃放置自显影.　
1.2.8　Western印迹　　TNFα基因在鱼腥藻7120中表达后,破碎细胞，细胞裂解液变性后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移蛋白至硝酸纤维素膜上，4℃封闭过夜后，用适当的缓冲液洗膜，加抗血清于37℃结合2～3
h，经过适当缓冲液洗膜后，加羊抗鼠酶标二抗进行结合反应，洗膜后进行显色观察.　
1.2.9　转基因蓝藻中TNF的表达和活性测定　　转基因鱼腥藻7120在含新霉素25
μg/mL (Neo25)的无氮BG-11固体培养基［11］平板上保种，挑单藻落在同样的液体培养基中通气扩大培养，光强120～150
μmol/m2.s（日光灯下），温度28～30℃.　对数生长中后期离心收藻（4℃，6
000 r/min，15 min），用pH8.0的50 mmol/L Tris-HCl （buffer A）洗涤沉淀2次.　按每克鲜藻加3
mL裂解缓冲液（buffer A, 1 mmol/L EDTA, 0.1 mol/L NaCl）悬浮沉淀，用液氮冻融3次，冰水浴中加玻璃微珠超声破碎，每次15～20
s，停30 s，共10次.　4℃，17 000 r/min，30 min离心得上清粗提液.　粗提液蛋白浓度测定按215～225
nm光吸收差法.　
　　粗提液中hTNF-α活性检测采用在放线菌素D存在下，TNF对L929细胞的细胞毒性方法［21］，以杀死50%细胞（接种2～3×104细胞/孔）的TNF的稀释度为1个活性单位（U）.
2　结果和讨论
2.1　穿梭表达载体pDC-TNF的构建和酶切鉴定
　　穿梭表达载体pDC-TNF的构建过程（如图1所示）主要分2步：(1)
含有重组hTNFα cDNA全长的pRL-rhTNF质粒经XhoⅠ酶切，在Klenow酶的作用下补平3′-末端后，继以EcoRⅠ消化，回收包含rhTNFα
cDNA的700 bp片段，将此片段定向插入到pRL-439载体上紧随启动子PpsbA之后的SmaⅠ和EcoRⅠ位点中，如此得到的重组质粒定名为pRL-TC；(2)
用EcoRⅠ/SalⅠ双酶分别消化pRL-TC和pDC-8，回收pRL-TC的800
bp左右的含PpsbA及TNFα cDNA的片段和pDC-8的9.0 kb片段，连接后得到穿梭表达载体pDC-TNF.
图1　穿梭表达载体pDC-TNF的构建过程
　　图2(a)为重组质粒pRL-TC的酶切鉴定结果，它经EcoRⅠ单酶切证实分子量为3.4
kb，由于pRL-439的SmaⅠ位点由于和目的片段的补平端连接而丢失，但在紧靠SmaⅠ处有一个BamHⅠ位点，所以重组质粒经BamHⅠ/EcoRⅠ消化时产生700
bp片段，它和pRL-rhTNFα经XhoⅠ/EcoRⅠ消化时产生的目的片段大小一致.　图2(b)为重组质粒pDC-TNF的酶切鉴定结果，BglⅡ单酶切消化确证分子量为9.8
kb左右，用SalⅠ和EcoRⅠ消化时产生了9.0 kb和800 bp左右的2条带，分别与pDC-8经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切时产生的9.0
kb大片段和pRL-TC经SalⅠ/EcoRⅠ双酶切时产生的小片段相一致.
图2　中间载体及重组质粒酶切分析电泳图
(a) 中间载体pRL-TC的酶切分析电泳图：1为分子量标准：λDNA/HindⅢ酶切片段，2为pRL-439/EcoRⅠ酶切，3为pRL-TC/EcoRⅠ酶切，4为pRL-rhTNF/EcoRⅠ酶切，5为pRL-439/SmaⅠ/EcoRⅠ双酶切，6为pRL-TC/BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，7为pRL-rhTNF/XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切，8为100
bp DNA分子量标准.　(b) 重组质粒pCD-TNF的酶切分析电泳图：1分子量标准：λDNA/HindⅢ酶切片段,2为pDC-8/BglⅡ酶切，3为pDC-TNF/BglⅡ酶切，4为pDC-8/EcoRⅠ/SalⅠ双酶切，
5为pDC-TNF/EcoRⅠ/SalⅠ双酶切， 6为pRL-TC/EcoRⅠ/SalⅠ双酶切， 7为100 bp
DNA分子量标准
　　TNFα基因进入蓝藻表达有2种方式：(1)
是质粒pRL-rhTNF直接转化［15］进入单细胞蓝藻.　在直接转化时，外源DNA受蓝藻的限制性内切酶系统的降解使转化效率很低；(2)
由于有些质粒本身不含蓝藻的复制子，所以它在蓝藻中往往是和宿主遗传系统（染色体或内源质粒）间发生了同源重组.　因此，本工作未采用直接转化法，而采用第2种方法――构建穿梭表达载体进行三亲接合转移.　已经证明［16］，λ噬菌体的PR和PL启动子可在2种单细胞蓝藻中高效表达，并且受CIts857基因所编码的阻遏蛋白所调控.　但高温对蓝藻并非是一个理想的诱导刺激，因为很多蓝藻难以耐受42℃的高温环境.　本工作未采用pRL-rhTNF载体本身的PRPL启动子去启动TNFα基因在蓝藻中的表达正是基于这一点考虑.　而来自叶绿体的启动子PpsbA［17］，其序列和大肠杆菌δ70启动子的共有序列几乎完全相同，已被广泛用在载体、转座子以及DNA序列组件中驱动npt基因的表达，从而使鱼腥藻（Anabaena）有高水平的新霉素（Neo）抗性.　而且PpsbA用于驱动枯草杆菌的毒蛋白基因以及小鼠金属硫蛋白基因在蓝藻中的表达也获得了成功.　本工作用它来启动TNFα基因在蓝藻中的转录.　TNFα目的基因前的E.coli
atpE翻译起始区（TIR）也和TNFαcDNA一起克隆于PpsbA之后，因为这段序列被证明［18］可有效增加β-干扰素（IFN-β）和白细胞介素-2（IL-2）等基因的表达.　
2.2　pDC-TNF-α在大肠杆菌中的表达检测
　　图3为大肠杆菌蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果.　带有重组质粒pRL-TC和pDC-TNF的细菌裂解物中均出现了1条着色较深、分子量约为17
ku的新增蛋白带.　而空宿主菌（TG1）以及含空载体（pRL-439和pDC-8）菌，其裂解物中均无该特异带的出现.　该蛋白带分子量大小和TNF-α蛋白理论值相符，而且其位置和诱导后的含pRL-rhTNF质粒的TG1菌中表达的TNFα位置一致.　说明了在启动子PpsbA的作用下，pRL-TC和pDC-TNF均可表达TNFα蛋白.　进一步用CS-930扫描仪进行扫描分析，pRL-TC,
pDC-TNF, 和pRL-rhTNF（诱导后）3个载体在E.coli TG1中的TNF-α表达量分别为16.9%,
15.0%和11.8%.
图3　大肠杆菌E.coli TG1蛋白的SDS-PAGE图谱
1为蛋白分子量标准，2为宿主菌E.coli TG1，3为含pRL-439的E.coli TG1，4为含pDC-8的E.coli
TG1，5为含pRL-TC的E.coli TG1， 6为含pDC-TNF的E.coli TG1， 7为含pRL-rhTNF的E.coli
TG1(诱导前)， 8为含pRL-rhTNF的E.coliTG1(42℃诱导后)
2.3　三亲接合转移和转基因藻的筛选
　　转化鱼腥藻7120后,平板筛选2周左右开始有转化子出现,而野生藻对照在加新霉素选择压力后7
d左右已完全变黄死亡.　挑单藻落接入含新霉素的液体培养基培养2周后变绿.　进一步在对转基因藻进行的稳定性实验中，经过多次的不加抗生素的继代培养后，再用抗生素筛选仍维持新霉素抗性.　这些说明了pDC-TNF载体已转入鱼腥藻7120中，并且可稳定维持新霉素抗性.
2.4　转基因藻的DNA水平检测
　　图4(a)为提取质粒的电泳结果，可以看出转基因藻质粒样品中除含有和野生藻相同的4.9
kb质粒带［19］外,还多出1条质粒带,其分子量在9.8 kb左右，和转入鱼腥藻中的pRL-TNF分子量一致，且在进一步的Southern印迹杂交（图4(b)）中，野生藻无阳性带，转基因藻在9.8
kb质粒位置有杂交带，但在染色体和内源质粒的同一位置没有，酶切鉴定结果符合分子量值.　由此就在DNA水平上证实了TNFα基因已经进入鱼腥藻7120中.　将提取自蓝藻中的质粒样品重新转化大肠杆菌TG1感受态细胞，提取转化子质粒酶切鉴定证实为pDC-TNF，由此证实了pDC-TNF的穿梭表达特性.
图4　转基因鱼腥藻7120质粒的琼脂糖凝胶电泳图(a)和Southern
blot结果(b)
1为分子量标准：λDNA/HindⅢ酶切片段，2为野生型的藻细胞；3为转基因型的藻细胞，4为大肠杆菌质粒pRL-rhTNF样品，5为转pDC-TNF藻质粒样品经EcoRⅠ消化，6为经EcoRⅠ消化的细菌质粒pRL-rhTNF样品
2.5　TNFα基因在鱼腥藻7120中的表达及活性
　　用鼠抗人TNFα单克隆抗体进行的Western印迹（图5）中，转基因藻特异表达的17
ku蛋白可和抗体结合，从而证实了TNFα基因在鱼腥藻7120中得到正确表达.　在转基因藻连续培养几代后仍能通过SDS-PAGE检测出特异表达的17
ku蛋白，这证明了TNF基因在蓝藻中的表达是稳定的.　
　　含有重组人TNF的转基因蓝藻粗提液细胞毒活性为60 000 U/mL，粗蛋白比活为1.09×104
U/mg.　而在野生型鱼腥藻7120粗提液中未发现有细胞毒活性.　我们已经建立了从转TNF基因蓝藻中分离纯化TNF的方法，其回收率及产物表达效率将另文发表.
图5　转基因鱼腥藻7120蛋白Western
1，2为转基因藻，3为野生藻，4为诱导后的含pRL-rhTNF的大肠杆菌TG1
　　通过三亲接合转移法将构建的含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）基因的穿梭表达载体转入鱼腥藻7120中,并证实了hTNFα在鱼腥藻7120中的正确和稳定表达，并且具有细胞毒活性.
*　国家自然科学基金资助项目(批准号：
作者简介　施定基　联系人
　　　　　商之狄　现在地址：中国科学技术大学生物系93级，合肥230027
　　　　　徐旭东　现在地址：美国密执安州立大学国家植物学实验室，East
　　　　　Michigan
作者单位：刘凤龙　邵　宁　钟泽璞(中国科学院植物研究所，北京
　　　　　张宏斌　吴锦银　王　捷　江悦华赵树进(广州军区广州总医院医学实验科，
　　　　　广州510010)
　　　　　林　晨　张雪艳　吴　F(中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验
　　　　　室，北京 100021)
　　　　　彭国宏　张海霞　曾呈奎(中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验室，
　　　　　青岛266071)
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收稿，收修改稿临床医学专科
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人白介素-2基因在原代培养骨骼肌细胞中的表达研究
来源：青年人()&更新时间： 17:52:51 &【字体： 】
　　【摘要】　目的　对以人白介素-2在原代培养骨骼肌细胞中的表达作为肿瘤基因治疗模式进行新的探索；　方法　将人白介素-2 cDNA片段与CMV启动子及RSV启动子重组，通过Lipofectin介导将得到真核表达载体pCMV-IL2和pRSV-IL2转入原代培养的骨骼肌细胞，并用免疫组织化学方法观察白介素-2的表达；　结果　pCMV-IL2和pRSV-IL2经酶切鉴定正确，免疫组织化学观察到约有10%左右细胞表达了白介素-2cDNA；　结论　不同启动子表达情况并无差别，质粒DNA为今后肿瘤基因治疗提供了新的途径。　　【关键词】　人白介素-2　骨骼肌细胞　脂质体介导的基因转移
THE HUMAN INTERLEUKIN-2 EXPRESSION IN PRIMARY SKELETAL MUSCLE CELLS OF THE RAT
Pan Haiyan△, Tian Jingsheng, Wang Ke, Zhao Chunli, Zheng Shaopeng, Xue Shaobai*(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing, *Molecular and Cellular Program,Biology Department of Beijing Normal University,Beijing)
　　【Abstract】 Objective By using hIL2-muscle model to exploit a new gene therapeutics for cancer.Methods Two mammalian expression vectors were constructed,which contained 1kb human interleukin-2 cDNA,and were transfected into primary skeletal muscle cells of the rats mediated by lipofectin(hIL2-muscle model).The hIL-2 expression in primary muscle cells was detected by immunohistochemical stain method.Results Identification of pCMV-IL2 and PRSV-IL2 was confirmed by digesting with restrictive endonucleases,about 10% positive cells were observed and the expression level of pCMV-IL2 and pRSV-IL2 had no difference in the muscle cells.Conclusion　Recombinant plasmid DNAs might be suitable for gene therapeutics for cancer.　　【Key words】 hIL2; M Lipofectin mediated gene transfer　　目前，对肿瘤的基因治疗研究正方兴未艾、发展迅速。肿瘤基因治疗中大约有1/3的方案是将细胞因子基因导入肿瘤细胞后作为肿瘤疫苗植入体内，以期持续分泌活性细胞因子来达到增强抗肿瘤免疫反应的目的［1］。在诸多细胞因子中，白介素-2(interleukin-2,IL2)是体内一种重要的参与免疫调节的细胞因子，也是肿瘤临床治疗中应用最早的细胞因子［2］。相反，由于IL2在血液中半衰期短，反复输入IL2会产生严重的毒副作用，因此用体内直接输入IL2的方法来治疗肿瘤有很大的缺点［3］。用IL2基因修饰的肿瘤细胞可以使之在肿瘤部位表达分泌，从而增加了IL2的靶向性，而且肿瘤疫苗还会诱导特异性的抗肿瘤免疫反应，故用IL2基因导入肿瘤细胞行肿瘤基因治疗有很好的前景。然而，以肿瘤细胞作为靶细胞也有许多不足之处［4］：肿瘤细胞自体建系困难，稳定的自体细胞系除了在黑色素瘤和肾癌患者中约30%病人可建立稳定的自体细胞系外，在其他患者尚未见成功，将永久性的细胞系回输体内有易于癌化趋势。因此我们拟采用原代培养的骨骼肌做为靶细胞转入IL2基因，希望通过其能分泌细胞因子达到治疗肿瘤的目的，为肿瘤的基因治疗提供新途径。材料和方法
1. pGEM-3zf(+)-IL2多克隆载体的构建　　用限制性内切酶PstI酶切pGEM-3zf(+)质粒(购自华美生物工程公司)，与纯化的1.0kbh-IL2 cDNA片段(两端pstI酶切，由美国Michigan大学医学中心Thompson CB教授惠赠)，用T4连接酶(华美生物工程公司)连接；转化感受态菌DH5α或JM109，将细菌涂布于含X-gal和IPTG的平板上进行蓝/白斑筛选，酶切鉴定阳性克隆(图1)。重组质粒的提取、纯化、酶切、片段回收、连接及大肠杆菌感受态制备均参见文献［5］。2. 真核表达载体pCMV-IL2构建　　用pCMV-LacZ质粒(美国Wisconsin大学Waisman中心惠赠)，经限制性内切酶HindⅢ、EcoR Ⅰ(华美生物工程公司)双酶切，去掉3.0kb的LacZ基因，回收含CMV启动子的4.3kb片段；pGEM-3zf(+)-IL2经相同双酶切处理，提取其中1.0kb的h-IL2cDNA片段，与含有CMV启动子的DNA片段经T4连接酶连接，建成pCMV-IL2真核载体(图2)。
图1　多克隆载体pGEM-IL2构建示意图Fig.1 Construction of recombinant vector pGEM-IL2.
图2　表达载体pCMV-IL2构建示意图Fig.2 Construction of eukaryotic expression vector pCMV-IL2.
3. 真核表达载体pRSV-IL2的构建　　将pRSV-LacZ质粒(美国Wisconsin大学Waisman中心惠赠)，经限制性内切酶HindⅢ、pvuⅡ(华美生物工程公司)酶切，去除其中的LacZ基因，回收其中含有RSV启动子的4.0kb基因片段；将pGEM3zf(+)-IL2经HindⅢ、HincⅡ(华美生物工程公司)双酶切，回收其中1.0kb h-IL2 cDNA片段，与RSV启动子经T4连接酶连接，构建pRSV-IL2真核载体(图3)。
图3　表达载体pRSV-IL2构建示意图Fig.3 Construction of eukaryotic expression vector pRSV-IL2
4. 原代骨骼肌的培养　　取新生2～5d的SD大鼠的四肢骨骼肌组织，剪成肉糜后用胰蛋白酶(1∶250，Sigma)和胶原酶(Gibco/BRL)消化，制成细胞悬液并用20μm孔径的滤膜过滤去除组织碎块，所得悬液用Percoll(Sigma)进行密度梯度离心，得出纯化干细胞以5×105细胞密度在35mm平皿内进行原代培养。培养基含5%鸡胚浸出液(Gibco/BRL)、15%马血清(天津血研所)、和80%MEM(Gibco/BRL)。前3d每日换液，以后隔日换液。5. Lipofectin介导的基因转移　　将质粒pCMV-IL2、pRSV-IL2以及作为阳性对照的质粒pRSV-LacZ与Lipofectin分别用无血清培养基(Opti-MEM)稀释至0.75ml，然后逐滴混匀，形成DNA-Lipofectin复合物；将培养2～3d的原代骨骼肌细胞用无血清培养基洗3次后加入DNA-Lipofectin复合物，在37℃、5%CO2条件下放置4～6h，经10%DMSO冲击后，加入完全培养基，继续培养2～3d。6. ABC免疫组织化学法检测人白介素-2的表达　　将35mm平皿取出，对其中培养的转基因后细胞进行免疫组织化学染色，以PBS(0.01mol/L pH7.4)洗2次，用5%戊二醛固定5～10min，以PBS洗(5min×3)。加入含0.1% Triton X-100和1.5%正常马血清的PBS缓冲液，室温下振荡孵育30min，移入鼠抗人白介素-2单克隆抗体(1∶100，购自军事医学科学院)中4℃孵育24h，PBS洗(5min×3)。加入ABC复合物(1∶50)，37℃孵育30min，0.05mol/L Tris.HCl缓冲液洗(5min×3)，加入含0.5g/L DAB的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，含0.003% H2O2)中呈色，室温下孵育5～10min。对转入pRSV-LacZ的肌细胞阳性对照经X-gal组织化学染色，方法参见文献［6］。结果
1. 多克隆载体pGEM3zf(+)-IL2的鉴定　　在涂布含有X-gal和IPTG的LB Amp+平板上，长有数百个细胞克隆，蓝和白的比例接近1∶1。用HindⅢ单酶切分析随机挑取的6个白色克隆，全有h-IL2 cDNA插入，用XbaⅠ酶切分析，其中1号和6号是正向克隆，3号是反向克隆(图片未附)。HindⅢ、EcoR Ⅰ分别单酶切下产生4.2kb单一条带，XbaⅠ酶切下产生两条带，即正向0.6kb+3.6kb，反向0.4kb+3.8kb(图4)。2. 真核表达载体pCMV-IL2和pRSV-IL2的构建　　pCMV-IL2组建后全长5.3kb，pRSV-IL2组建后全长5.0kb，经酶切鉴定后显示构建正确(图5)。3. 真核表达载体在原代培养的骨骼肌细胞中的表达　　骨骼肌原代培养中，前3d的培养细胞以成肌细胞(myoblast)形式存在；培养3d后细胞拉长并出现多核，转化为肌管细胞(myotube)，以后融合成骨骼肌细胞，在显微镜下可见骨骼肌细胞具有多核、融合、收缩活动等形态特征。　　(1)对照pRSV-LacZ转染的骨骼肌细胞经X-gal组织化学染色后呈蓝色，光镜下观察蓝染细胞占骨骼肌细胞总数的10%～20%(图6)。　　(2)pCMV-IL2、pRSV-IL2转染的骨骼肌细胞经ABC免疫组织化学染色后，阳性细胞呈褐色，阳性细胞占总数的10%，细胞核深染，含不同启动子的两种质粒的表达情况未见差别(图7，8)。
图4　pGEM-IL2酶切鉴定图Fig.4 Restritive digestion and identification of recombinant vector pGEM-IL2
F:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ Marker G:pGEM-IL2/XbaⅠ反向［0.4kb,3.8kb］　H：pGEM-IL2/XbaⅠ正向［0.6kb,3.6kb］　I：pGEM-IL2/HindⅢ［4.2kb］ J:pGEM-IL2/EcoRⅠ［4.2kb］ K:λDNA/HindⅢ Marker
图5　pCMV-IL2和pRSV-IL2酶切鉴定图Fig.5 Restrictive digestion and identification of mammalian expression vectors pCMV-IL2 and pRSV-IL2
A:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ marker B:pRSV-IL2/StuⅠ［0.7kb,4.3kb］ C:pRSV-IL2/ApaⅠ［4.0kb］ D:pRSV-IL2/XbaⅠ［0.7kb,4.3kb］　E:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ Marker F:pCMV-IL2/XbaⅠ［0.6kb,4.7kb］　G:pCMV-IL2/stuⅠ［0.7kb,4.6kb］ H:pCMV-IL2/EcoRⅠ［5.3kb］　I：pCMV-IL2/HindⅢ［5.3kb］ J:λDNA/HindⅢ marker
图6　免疫组织化学方法检测LacZ基因在大鼠原代培养骨骼肌中的表达Fig.6 Detection of LacZ gene expression in primary skeletal muscle cell of the rat by immunohistochemical stain.
图7　免疫组织化学方法检测pCMV-IL2在大鼠原代培养骨骼肌中的表达Fig.7 Detection of pCMV-IL2 expression in primary skeletalmuscle cell of the rat by immunohistochemical stain.
图8　免疫组织化学方法检测pRSV-IL2在大鼠原代培养骨骼肌中的表达Fig.7 Detection of pRSV-IL2 expression in primary skeletalmuscle cell of the rat by immunohistochemical stain.
讨　论　　目前，基因治疗中所遇困难之一是遗传修饰的各类细胞植入体内后不能持久表达［7］，而原代培养的骨骼肌细胞在保持移植后长期存活及基因表达的成功率方面优于其他细胞。　　大鼠骨骼肌做基因治疗的靶细胞有以下特点：(1)已有研究表明骨骼肌不仅能表达肌蛋白基因，也能表达非肌蛋白基因，如人生长激素［7］、凝血因子IX［8］和GM-CSF［9］等，而且这些基因在体内能稳定表达几个月之久，因此可以用移植的骨骼肌细胞做为异位点(ectopic site)产生重组蛋白治疗遗传性疾病、代谢性疾病或诱导免疫反应的目的；(2)外源基因即使以附加体形式存在，也可以在骨骼肌中长期表达［10］，例如用Lipofectin或重组腺病毒直接注射等方法，这也许与骨骼肌纤维处于Go期，较稳定有关；(3)原代培养的骨骼肌细胞能在植入成体后10d左右与宿主肌纤维融合，并且遗传修饰的肌纤维形态上无任何改变［7，8］；(4)移植数月后，遗传修饰的骨骼肌细胞不仅与宿主肌纤维融合，其中存在一小部分静止期的肌肉前体细胞即遗传修饰的干细胞，它们仍具有重新再生的能力，这就进一步保证移植后的骨骼肌能长期稳定表达外源基因［8］。　　骨骼肌上述特征，应看作适于做人白介素-2基因治疗肿瘤的载体。如果将IL2基因修饰的骨骼肌细胞移植到肿瘤附近，有理由相信其应可成为一个长期稳定的、生理量的白介素-2的分泌源。　　本研究成功重组了质粒pCMV-IL2和pRSV-IL2并转入原代培养的骨骼肌细胞，看到了的确可以表达白介素-2，尽管有文献说不同启动子会产生不同基因表达水平，但我们看到的两种质粒(pCMV-IL2和pRSV-IL2)的表达情况基本相同。此外我们采用Lipofectin与质粒DNA混合物的方法进行基因转移，这就克服了以病毒为基因转移载体所存在的问题［11］。质粒DNA易于制备，纯度较病毒上清易于控制，质粒DNA注射后，免疫反应很少或几乎不存在，而使用逆转录病毒与腺病毒都会造成有免疫细胞浸润现象。此外质粒DNA与细胞染色体发生重组的可能性远远小于病毒载体，特别是逆转录病毒载体。　　曹雪涛等［12］将白介素-2基因修饰的成纤维细胞，用胶原包裹后植入腹腔治疗肝癌取得一定疗效。由于骨骼肌的优点，我们有理由认为将基因修饰的骨骼肌细胞植入腹腔治疗肝癌当有更好的效果。
Fig.1 NOV mRNA neurons in ventral region of the spinal cord at 16 weeks of gestation age.The strong hybridization signal were localized in the cytoplasm. ×100Fig.2 NOV mRNA neurons in principal nucleus of inferior olive at 16 weeks of gestation age the density of positive cells were high. ×40Fig.3 The density of NOV mRNA in principal nucleus of inferior oliveat 25 weeks of gestation age were lower than that of 16 weeks of gestation age,but the positive signal were stronger. ×100Fig.4 NOV mRNA neurons were widely distributed throughout the principal nucleus of inferior olive at 28 weeks of gestation age. ×40Fig.5 NOV mRNA neurons in gracile nucleus at 38 weeks of age.There are three types of positive neurons:large,middle and small in size. ×100Fig.6 NOV mRNA neurons distributed in striatum at 38 weeks of gestation age. ×40Fig.7 NOV mRNA neurons localized in Ⅴ and Ⅵ layer of cerebral cortex of parietal lobe were large pyramidal cells. ×100
　　△ Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China　　作者单位：潘海燕　田竟生　王珂　赵春礼　郑少鹏(首都医科大学神经科学研究所，　　　　　　　北京　100054）　　　　　　　薛绍白　北京师范大学生物系细胞组)
［1］Blankenstein T,Qin Z.Cancer vaccines in gene therapy.Gene Therapy,):95［2］Cordier L,Duffour MT,Sabourin JC,plete recovery of mice from a pre-established tumor by direct intratumoral delivery of an adenovirus vector harboring the murine IL2 gene.Gene Therapy,):16［3］Sobol RE,Fakhrai H,Shawler D,et al.Interleukin-2 gene therapy in a patient with glioblastoma.Gene Therapy,):164［4］Foe R,Guarini A,Cronin K,et al.Cytokine gene therapy:a new stragtegy for the management of cancer patients.Nat Immun,-3):65［5］金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1992［6］郑少鹏，田竟生，徐群渊，等.LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达.首都医学院学报，1995，16(2)：85［7］Dhawan J,Pan LC,Pavlath,et al.Systemic delivery of human growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts.Science,7):1507［8］Yao SN,Kurack K.Implanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precuror cells.Journal of cell Science,［9］Bonham L,Palmer T,Miller AD.Prolonged expression of therapeutic levels of human granulocyte colony-stimulating factor in rats following gene transfer to skeletal muscle.Human Gene Therapy,):1423［10］Karpacti G,Acsadi G.The potential for gene therapy in Duchenne muscular dystropy and other genetic muscle disease.Muscle Nerve,):1141［11］Davis HL,Demeneix BA,Quantin B,et al,Plasmid DNA is superior to viral vectors for direct gene transfer into adult mouse skeletal muscle.Human Gene Therapy,［12］曹雪涛，章卫平，陶群，等.成纤维细胞介导的白细胞介素2基因疗法的免疫增强作用及其抗肿瘤效果.中华医学杂志，1995，75(9)：521
收稿1997-10　修回1998-07
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