分枝杆菌噬菌体的生物学特性及基因组学研究--《重庆医科大学》2012年博士论文
分枝杆菌噬菌体的生物学特性及基因组学研究
【摘要】：目的
结核病疫情严峻，耐药率高，新型抗结核药物研发越来越困难，分枝杆菌噬菌体逐渐成为新型抗结核药物的研究热点之一。目前还无文献报道在国内发现新分枝杆菌噬菌体，本研究在国内首次分离鉴定出5株分枝杆菌噬菌体(Mycobacterium Phage)，命名为Chy1、Chy2、Chy3、Chy4和Chy5，通过对其生物学特性和基因组学进行研究，探寻这5株分枝杆菌噬菌体抗结核菌的潜力，明确其遗传背景，为噬菌体的进一步开发利用提供理论基础和方法指导。
1采用直接分离法和富集法从泥土标本中分离、纯化分枝杆菌噬菌体。
2比较噬菌体滴度测定、噬菌体大量扩增和收获的不同方法，优化实验条件。
3分枝杆菌噬菌体生物学特性研究
3.1采用PEG8000沉淀法纯化分枝杆菌噬菌体，电镜观察噬菌体形态特征。
3.2以不同MOI扩增分枝杆菌噬菌体，根据扩增后的产量找出每株噬菌体的最佳MOI。
3.3通过一步生长实验测定分枝杆菌噬菌体潜伏期、裂解期和裂解量。
3.4分离临床病原菌，用罗氏药敏培养基进行初步菌种鉴定和药敏实验，再采用单斑法测定分枝杆菌噬菌体的宿主谱。
3.5比较分枝杆菌噬菌体在pH值为5.0和7.4的7H9固体培养基中裂解耻垢分枝杆菌mc2155的能力。
3.6比较Chy1、Chy2、Chy3、D294种噬菌体组成鸡尾酒制剂与这4种噬菌体分别单独裂解耻垢分枝杆菌mc2155的能力，实验数据采用SPSS17.0统计软件中的单因素方差分析进行统计分析，以P 0.05为差异有统计学意义。
3.7培养原代巨噬细胞，巨噬细胞吞噬结核菌后分为3组，1组加入Chy3，2组加入D29，3组为不加噬菌体的空白对照组，培养过夜后，收集细胞，电镜观察噬菌体对巨噬细胞胞内结核菌的影响。
4分枝杆菌噬菌体全基因组测序
4.1用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取分枝杆菌噬菌体基因组DNA，限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。
4.2基于鸟枪法随机测序和重叠群组装的方法进行测序：构建文库，随机挑取克隆片段测序，拼接成大小不一的重叠群，最后通过PCR法填补各重叠群之间的缺口，得到完整的全基因组序列。
4.3组装成环形的噬菌体采用DNAStar程序包中的GeneQuest软件对其基因组列进行电子酶切分析，并与实际酶切图谱进行比较，以确定噬菌体基因组是否为环形。
5分枝杆菌噬菌体基因组生物信息学分析
5.1分枝杆菌噬菌体基因预测及基因组注释
⑴分析5株分枝杆菌噬菌体基因组的一般特性：①采用DNAStar软件包中Editseq软件分析基因组大小，碱基组成，基因平均长度、基因密度以及5株噬菌体遗传密码子的使用频率及其偏嗜性。②采用TRF软件预测基因组中的串联重复序列。③通过tRNAscan软件预测基因组中的tRNA区域。
⑵采用Glimmer3.0和GeneMark基因预测软件对基因组进行基因de novo预测，推定5株分枝杆菌噬菌体基因组编码序列。
⑶用Blast和Clustal软件将推定基因与nr，swissport，tremble，cog数据库中的序列进行同源比对，E value为1e-5，对每个预测出来的基因选取同源比对上分值最高的序列，预测基因功能。
6分枝杆菌噬菌体比较基因组学
6.1将5个分枝杆菌噬菌体的基因与公共数据库数据进行Blast m8比对，e-value =1e-5，选取每个蛋白的最好比对结果，将两两比对均是最好的结果保留，绘制共线性图。
6.2先将所有的基因序列用Clustal W软件进行两两比对，计算得到包含每对序列分歧程度的距离矩阵，再根据距离矩阵计算得到引导树，最后根据前面得到的引导树分支顺序，逐级比对，得到全部序列的全局比对结果，用tree view软件生成进化树。
1采用富集法分离纯化得到5株分枝杆菌噬菌体,根据分离地点分别命名为Chy1、Chy2、Chy3、Chy4和Chy5。这5株噬菌体的噬菌斑均为圆形、透明、清晰，呈裂解性噬菌体噬菌斑特点，但Chy2、Chy4和Chy5培养超过48h后噬菌斑逐渐变混浊。
2优化实验方法，后续实验均采取小平板法测定噬菌体滴度，双层固体培养基培养的方法大量扩增噬菌体以及刮取上层培养基离心的方法收集噬菌体。
3分枝杆菌噬菌体生物学特性研究
3.1Chy1、Chy3、Chy4和Chy5噬菌体头部均为多面立体对称，而Chy2噬菌体头部呈椭圆形。5株噬菌体均具有长尾，可弯曲，但不可收缩，可见尾板和尾丝，依据ICTV第八次报告的最新病毒分类系统的标准属长尾噬菌体科(Siphoviridae)。
3.2Chy1最佳MOI为1.4×10~-6，Chy~2最佳MOI为9.58×10~-5，Chy3最佳MOI为1.1×10~-4，Chy4最佳MOI为4.5×10~-5，Chy5最佳MOI为1.8×10~-5，后续实验大量扩增这些噬菌体时，均根据最佳MOI扩增，以达到最大产量。
3.3Chy~2感染耻垢分枝杆菌mc~2155的潜伏时间约为210min，裂解期为60min，270min后进入平台期，噬菌体滴度不再增加，裂解量为23；Chy3感染耻垢分枝杆菌mc~2155的潜伏时间约为150min，裂解期为90min，240min后进入平台期，噬菌体滴度不再增加，裂解量为40；Chy1、Chy4和Chy5潜伏期超过420min。
3.4共收集临床病原菌36株，经菌种鉴定，有32株为结核分枝杆菌(结核菌)，2株为牛结核分枝杆菌，2株为非结核分枝杆菌。这5株分枝杆菌噬菌体的宿主谱较广，能裂解MS mc2155、结核菌标准株H37Rv、大部分临床分离耐药结核菌株、耐药牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，其中Chy1对广泛耐药结核菌裂解率达100％。
3.5抗菌能力最强的噬菌体是D29(P 0.05)，48h内几乎裂解所有的耻垢分枝杆菌mc~2155，48h后细菌数量逐渐回升，但仍比初始加入的细菌数少，维持在较低水平，其次是鸡尾酒制剂，24h内能裂解大多数耻垢分枝杆菌mc2155，但24h后细菌数逐渐增多，到96h时细菌数与Chy2和Chy3组已无差别(P0.05)。Chy1、Chy2和Chy33个新分离的噬菌体中，Chy3早期(48h)杀菌能力最强(P 0.05)，但到96h时细菌数与Chy2相当(P0.05)，Chy1杀菌能力最弱，在48h内不能抑制细菌生长，但48h后MS不再增加，维持在109CFU左右，细菌数比空白对照组少(P 0.05)。
3.6当7H9固体培养基pH值为5.0和7.4时，Chy1、Chy2和Chy3均能裂解耻垢分枝杆菌mc~2155。
3.7电镜观察发现Chy3组和D29组结核菌数量少，菌体结构明显被破坏，而空白对照组结核菌数量较多，细菌结构仍完整。
4分枝杆菌噬菌体全基因组测序
4.15株噬菌体基因组DNA均可被EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamH I切开，这3种核酸内切酶均能识别并切割双链DNA分子特定的核苷酸序列，表明这5株噬菌体基因组均为双链DNA。分析酶切图谱发现这5株噬菌体基因组大小均在40-50kb之间。4.25株噬菌体测序质量达到完成图标准。Chy1、Chy2、Chy4和Chy5最终均组装为线状重叠群。虽然Chy3组装为环状重叠群，但实际酶切图谱中，Hind Ⅲ将Chy3基因组切为2个条带，与线性电子酶切图谱相同，所以Chy3基因组很可能是线性。5分枝杆菌噬菌体基因预测及基因组注释5.1Chy1⑴Chy1基因组全长为47198bp，G＋C含量为63.68%，基因平均长度为562bp，基因密度为0.92。Chy1有明显的遗传密码子偏嗜性，未发现串联重复序列，共预测出5个tRNA。⑵采用glimmer软件分析，确定了77个推定基因(GL)，对这些基因进行同源检索分析，得到29个已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和GL25为噬菌体的结构基因；GL06、GL07和GL08分别编码LysA、holin和LysB；GL31为整合酶基因，GL70推定为阻遏蛋白类似基因，与D29p72基因序列100％相似，D29p72在进化过程中丢失了N-末端的一个片段，缺乏完整的HTH模体，不能结合到宿主菌DNA上，因而不能形成溶原性反应，即Chy1为裂解性噬菌体。GeneMark软件分析，共预测出71个推定基因(GM)，其中有55个基因与glimmer软件分析结果相同，有16个不同的基因，通过比对，发现GM22与GL23， GM08与GL09， GM51与GL55， GM52与GL56具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。5.2Chy2
⑴Chy2基因组全长为40017bp， G+C=66.73%，基因平均长度为656bp，基因密度为0.951。Chy2有明显的遗传密码子偏嗜性，共发现3个串联重复序列，未发现tRNA。
⑵采用glimmer在线分析软件分析，确定了58个推定基因，对这些基因进行同源检索分析，得到16个已知功能的基因。GL02、GL05、GL06、GL12、GL13、GL15、GL17和GL19为噬菌体的结构基因；GL26、GL27分别编码LysA和LysB，未发现holin基因；GL31为整合酶基因，GL32推定为阻遏蛋白基因，与分枝杆菌噬菌体Halo的gp33基因序列100％相似，Halo是溶原性噬菌体，gp33表达的产物是阻遏蛋白，即Chy2为溶原性噬菌体。GeneMark软件分析，共预测出54个推定基因，其中有44个基因与glimmer软件分析结果相同，有10个不同的基因，通过比对，发现GM15与GL12具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
⑴Chy3基因组全长为40070bp， G+C=66.86%，基因平均长度为667bp，基因密度为0.97。Chy3有明显的遗传密码子偏嗜性，共发现3个串联重复序列，未发现tRNA。
⑵采用glimmer在线分析软件分析，确定了58个推定基因，对这些基因进行逐个同源检索分析，得到20个已知功能的基因。GL01、GL41、GL43、GL45、GL47、GL48、GL54、GL55和GL58为噬菌体的结构基因，位于整合酶基因(GL29)的两侧；GL33、GL34分别编码LysB和LysA，未发现holin基因和编码阻遏蛋白的基因，即Chy3为裂解性噬菌体。GeneMark软件分析，共预测出56个推定基因，其中有46个基因与glimmer软件分析结果相同，有10个不同的基因，通过比对，发现GM43与GL43具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
⑴Chy4基因组全长为46639bp， G+C=63.68%，基因平均长度为586bp，基因密度为0.92。Chy4有明显的遗传密码子偏嗜性，未发现串联重复序列，共发现5个tRNA。
⑵采用glimmer在线分析软件分析，确定了73个推定基因，对这些基因进行同源检索分析，得到28个已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和GL25为噬菌体的结构基因；GL06、GL07和GL08分别编码LysA、holin和LysB；GL31为整合酶基因，GL71与编码噬菌体L5阻遏蛋白的gp71相似性为86.3％，L5gp71具有183aa，而Chy4GL71仅含155个aa，是否能编码有活性的阻遏蛋白还未知，即Chy4很可能为溶原性噬菌体。GeneMark软件分析，共预测出70个推定基因，其中有55个基因与glimmer软件分析结果相同，有15个不同的基因，通过比对，发现GM09与GL09，GM23与GL23，GM46与GL47，GM54与GL57具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
⑴Chy5基因组全长为51214bp，G+C=66.74%，基因平均长度为530bp，基因密度为0.91。Chy5有明显的遗传密码子偏嗜性，未发现串联重复序列，共发现5个tRNA。
⑵采用glimmer在线分析软件分析，确定了88个推定基因，对这些基因进行逐个同源检索分析，得到29个已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和GL25为噬菌体的结构基因；GL06、GL07、GL08分别编码LysA、holin和LysB；GL31为整合酶基因，gene70与分枝杆菌噬菌体Pukovnik编码阻遏蛋白的基因gp72相似性为70.81％，推定为编码阻遏蛋白的基因，是否能编码有活性的阻遏蛋白还未知，即Chy5很可能为溶原性噬菌体。GeneMark软件分析，共预测出86个基因，其中有68个基因与Glimmer3.0软件分析结果相同，有18个不同的基因，通过比对，发现GM09与GL09，GM12与GL12，GM23与GL23，GM55与GL54，GM63与GL62具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
6分枝杆菌噬菌体比较基因组学
6.1共线性分析
⑴Chy1同源性最高的两株噬菌体为D29和Che12，可归入ClusterA，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy1基因组77个基因中有75个基因与D29的基因具有同源性，有60个基因与Che12的基因具有同源性。
⑵Chy2同源性最高的两株噬菌体为BPs和Angel，可归入ClusterG，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy2基因组58个基因中有57个基因均与这两个噬菌体具有同源性。
⑶Chy3同源性最高的两株噬菌体为BPs和Angel，可归入ClusterG，同源性基因分布在整个基因组，Chy3基因组58个基因组中有56个基因均与这两个噬菌体具有同源性。Chy3基因组前3个基因与BPs和Angel前3个基因匹配，但从第4个基因开始与BPs和Angel的同源基因排列顺序相反。
⑷Chy4同源性最高的两株噬菌体为D29和Che12，可归入ClusterA，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy4基因组73个基因组中有70个基因与D29具有同源性，有54个基因与Che12具有同源性。
⑸Chy5同源性最高的两株噬菌体为D29和Pukovnik，可归入Cluster A，同源性基因分布在整个基因组，具有清晰的共线性。Chy5基因组88个基因组中有70个基因与D29具有同源性，有57个基因与Pukovnik具有同源性。
6.2进化树分析
对14株分枝杆菌噬菌体基因组进行系统发育分析构建进化树，距离越近，噬菌体间亲缘关系越近。Chy1与D29亲缘关系最近，Chy4与Chy5亲缘关系最近， Chy2与BPs、Angel亲缘关系最近，Chy3与Legendre亲缘关系最近。
5株分枝杆菌噬菌体均属于双链DNA病毒群(群Ⅰ)，尾病毒目，长尾病毒科。Chy1和Chy3为裂解性噬菌体，Chy2为溶原性噬菌体，Chy4和Chy5为可疑溶原性噬菌体，基因组学研究未在噬菌体基因组中发现毒力基因。5株噬菌体均能裂解耐药结核分枝杆菌，Chy3潜伏期短，体外裂菌能力强且能裂解巨噬细胞内结核分枝杆菌，最具有抗结核潜力。本研究初步探明5株新分枝杆菌噬菌体抗结核菌的潜力和遗传背景，为下一步开发利用噬菌体提供理论基础和方法指导。
【关键词】：
【学位授予单位】：重庆医科大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R378【目录】：
目录4-6英汉缩略语名词对照6-8摘要8-19ABSTRACT19-29前言29-30第一部分 分枝杆菌噬菌体分离和生物学特性研究30-58 第一章 分枝杆菌噬菌体的分离30-34
1 试剂与材料30-32
2 方法32-33
3 实验结果33-34 第二章 分枝杆菌噬菌体实验方法优化34-38
1 试剂与材料34-35
2 实验方法35-36
3 结果36-38 第三章 分枝杆菌噬菌体部分生物学特性研究38-44
1 试剂与材料38-39
2 方法39-40
3 实验结果40-44 第四章 分枝杆菌噬菌体体外杀菌实验44-54
1 试剂与材料44-45
2 方法45-49
3 结果49-54 讨论54-58第二部分 分枝杆菌噬菌体基因组学研究58-92 第一章 分枝杆菌噬菌体全基因组序列测定58-67
1 试剂与材料59
2 方法59-62
3 结果62-67 第二章 分枝杆菌噬菌体基因预测及功能注释67-83
1 材料与软件67
3 结果67-83 第三章 分枝杆菌噬菌体比较基因组学分析83-86
1 材料与软件83
3 结果83-86 讨论86-92全文总结92-95参考文献95-101附表101-125文献综述125-135 参考文献132-135致谢135-136攻读博士学位期间研究成果136-137
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京公网安备74号1.噬菌体、烟草和烟草花叶病毒中,构成遗传物质的碱基种类依次是A 4,5,4,B 4,4,4 C 4,8,4 D 5,5,52.收集健康人体的四种液体,分别用斐林试剂鉴定,能生成砖红色沉淀的是 A.尿液 B.胃液 C.唾液 D.血清 3.下列不属于原核生物_百度作业帮
1.噬菌体、烟草和烟草花叶病毒中,构成遗传物质的碱基种类依次是A 4,5,4,B 4,4,4 C 4,8,4 D 5,5,52.收集健康人体的四种液体,分别用斐林试剂鉴定,能生成砖红色沉淀的是 A.尿液 B.胃液 C.唾液 D.血清 3.下列不属于原核生物的是A支原体 B颤藻 C酵母菌 D大肠杆菌4.乳酸是属于什么,脂质,糖类,还是?5.肽键的化学连接结构可以简写成：-CO-NH- 请问为什么,或者说此类简写有何规律6.蛋白质和双缩尿试剂发生紫色反映的原理是什么（具体一点拉）关键是理由，越具体越好，另外，有什么相关说明也可以，比如类似此类的东西还有什么，相同水准的取前面的，如果后面有比前面好的取后面的补充好的在15分的基础上再添10~30分
1.A噬菌体是DNA病毒,碱基为ATGC,烟草为真核生物,含DNA和RNA,碱基有AUTGC,烟草花叶病毒为RNA病毒,碱基为AUGC2.D和斐林试剂生成砖红色沉淀的是还原糖（高中生物说的还原糖一般包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖,非还原糖包括淀粉、蔗糖等）.尿液里一般是没有的,有了就是糖尿病了；胃液里主要是盐酸和消化酶,唾液里也是消化酶；血清中有葡萄糖,就是常说的血糖.3.C 酵母菌是真菌,是真核生物记住像衣原体啊支原体啊颤藻啊细菌啊都是原核生物.有时候你会犹豫某个东西是不是细菌,判断是不是细菌的小窍门:凡是菌字前面有"杆"."球"."螺旋"."弧"等表示形态的字都是细菌,是原核生物,如大肠杆菌,肺炎双球菌,霍乱弧菌,红螺菌都是细菌...乳酸菌是个特例,他是真菌.乳酸菌它本属杆菌,但往往把杆字省略掉4.乳酸是α-羟基丙酸,是葡萄糖无氧呼吸代谢的产物.不是糖也不是脂类.5.肽键是一分子氨基酸的α－羧基和一分子氨基酸的α－氨基脱掉一分子水缩合形成的酰胺键.羧基是-COOH,氨基是-NH2,脱掉一个水（即两个H一个O）是从COOH上脱掉一个OH,从NH2上脱掉一个H,于是连起来就变成了-CO-NH- 6.双缩脲试剂由NaOH和CuSO4配制而成,双缩脲反应实质是在碱性环境下的Cu2+与双缩脲试剂发生反应,形成紫色或蓝紫色复合物.而蛋白质分子中含有很多与双缩脲（H2NOC-NH-CONH2）结构相似的肽键,所以蛋白质都能与双缩脲试剂发生颜色反应.
1.噬菌体只有DNA所以有A T G C烟草有DNA和RNA所以有A U T G C烟草花叶病毒只有RNA所以有A U G C2.
1、噬菌体 含DNA
含DNA和RNA
烟草花叶病毒
碱基种类共有5种ATCGU ,DNA是由ATCG，RNA是有AUCG
讲到这不必少说了吧，选4、5、4
像这种题还能衍生到“噬菌体、烟草和烟草花叶病毒中，构成遗传物质的核苷酸种类依次是”，那就是4、8、4，
因为DNA的脱氧核苷酸中有脱氧核...
1.A 因为噬菌体和TMV都是病毒,仅含一种核酸
(DNA/RNA),所以仅四种碱基,而烟草是高等植物,同时含有DNA和RNA,有五种碱基2.D 葡萄糖是通过血液运输的,血清里好友大量葡萄糖,可被菲林试剂检出3. C 酵母菌是真核生物,这没什么道理可讲,他本来就是.4.既然叫乳酸,那它就是一种有机酸,即2羟基丙酸.5.这是有机化学的规定,一两句说不清...
关键字1遗传物质:要么是DNA要么是RNA，但是在既有DNA又有RNA情况下，DNA才是遗传物质。噬菌体（DNA）烟草（DNA）烟草花叶病毒（RNA）。
关键字2碱基，四种。2，C 用斐林试剂鉴定,能生成砖红色沉淀是鉴定还原糖的（麦芽糖），故选C，唾液里含有唾液淀粉酶，将淀粉转化为麦芽糖。A，尿液 可能含有糖，但不是还原糖。B，胃液中只含胃蛋白酶。D，血清中含的是...
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