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细菌的遗传和变异-医学微生物学.ppt39页
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细菌的遗传和变异 遗传性变异（基因型变异）
非遗传性变异（表型变异）
细菌的变异现象 形态、结构变异 毒力变异 耐药性变异 菌落变异 形态结构变异
3-6%食盐鼠疫耶氏菌
多形态性????????
陈旧培基物
青霉素、溶菌酶正常形态细菌
抗体或补体
部分或完全失去胞壁  特殊结构的变异
42-43℃炭疽杆菌
失去形成芽胞能力, 毒性降低
0.1%石炭酸
迁徙生长（H）
点状生长、单个菌落（O） 毒力变异 增强
β棒状噬菌体白喉棒状杆菌
获得白喉毒素
胆汁、甘油、马铃薯培养基牛分枝杆菌
卡介苗???????????????????
13年 230代
耐药性变异
细菌对某种抗菌药物有敏感变成耐药的变异称为耐药性变异。 金黄色葡萄球菌 有些细菌还同时耐受多种抗菌药物，即多重耐药性，甚至产生药物依赖性。
含链霉素培基痢疾杆菌
依链株???????????
长期培养 菌落变异
在陈旧培养基中长期培养光滑型菌落
粗糙型菌落??? S?????? ????
?? R 原因：失去LPS的特异多糖 细菌遗传变异的物质基础 质粒（plasmid） 细菌染色体外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。带有遗传性息，能自行复制，随细菌分裂转移到子代细胞，并非细菌生长所必需。 特征 自我复制能力 编码产物赋予细菌某些性状特征 可自行丢失与消除 转移性 相容
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微生物的遗传变异和育种
第一节 遗传变异的概念及物质基础
遗传(heredity或inheritance)和变异(variation)是生物体最本质的属性之一。遗传，讲的是亲子间的关系，指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。
----在生物体中，是否存在着专门行使遗传变异功能的物质这个问题，曾是生物学界长期争论不
休的重大基本理论问题之一。直至连续利用微生物这一有利的实验对象进行了3个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是DNA才是遗传变异的真正物质基础。
一、遗传变异的基本概念
----1.遗传型(genotype)
----又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总和
。遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。具有某遗
传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。
----------------代谢----
遗传型+环境条件-------&表型
----------------发育----
----2.表型(phenotype)
----指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。所以，它与遗传型不同,是一种现实性。
----3.变异
----指在某种外因或内因的作用下生物体遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。变异的特点是在群体中以极低的几率(一般为10-5～10-10)出现；性状变化的幅度大；变化后的新性状是稳定和可遗传的。
----4.饰变(modification)
----指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。其特点是整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；因遗传
物质不变，故饰变是不遗传的。例如，Serratia marcescens(粘质沙雷氏菌)在25℃下培养时，会产生深红色的灵杆菌素，把菌落染成鲜血似的(因此过去称它为“神灵色杆菌”或“
灵杆菌”)；当培养在37℃下时，群体中的所有个体都不产色素。如重新降温至25℃
，所有细胞产色素能力又可以恢复。所以饰变是与变异有着本质差别的另一种现象。上述的S.marcescens产色素能力也会因发生突变而消失，但其几率仅10-4，且突变株的
遗传性是稳定的。
----从遗传学研究的角度来看，微生物有着许多重要的生物学特性：个体的体制极其简单；营养
体一般都是单倍体；易于在成分简单的合成培养基上大量生长繁殖；繁殖速度快；易于累
积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对微生物 群体
中各个体作用的直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；各种微生物一般都有相应的病毒；以及存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。因此，在研究现代遗传学和其
他许多重要的生物学基本理论问题时，微生物是最佳材料和研究对象。
----对微生物遗传变异规律的深入研究，不仅促进了现代生物学的发展，而且还为微生物育种工作提供了丰富的理论基础。
二、证明核酸是遗传变异物质的经典实验
----1.转化实验
图8-1 Griffith试验图解
(a)无毒菌系RII不使白鼠死亡，从鼠体内分离仍得无毒细菌；
(b)将SIII加热杀死，不使白鼠死亡，鼠体内无有毒细菌；
(c)混合活无毒的RII和加热杀死的SIII，使白鼠死亡，
并在死鼠体内发现活的SIII细胞
----转化现象是英国医生F.Griffith在1928年首次发现的。他以Streptococcus
pneumoniae(肺炎链球菌，原称“肺炎双球菌”)作为研究对象。S.pneumoniae是一种球形细菌，常成 双或
成链排列，可使人患肺炎，也可使小鼠患败血症而死亡。S.pneumoniae有许多不同的菌株，
有荚膜者具致病性，它的菌落表面光滑(smooth)，所以称S型；有的不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙(rough)，故称R型。少量的R型与大量加热杀死的S型细胞混合注射到小白
鼠体中，白鼠病死，在其尸体内发现有活的S型细胞。此实验说明，加热杀死的S型细菌，在
其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。
----1944年，Avery等人从热死的S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验(见图8―1和8―2)。
----从活的S菌中抽提各种细胞成分
DNA，RNA，蛋白质，荚膜多糖等。
----对各组分进行转化试验
活R菌 ①加S菌的DNA
②加S菌的DNA及DNA酶以外的酶〖JB)｝ 〗长出S菌 ③加S菌的DNA和DNA酶 ④加S菌的RNA ⑤加S菌的蛋白质
⑥加S菌的荚 膜多糖 〖JB)｝〗只长R菌〖KH*2〗
----从上述结果中可知,只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。而且,DNA纯度越高,转化效率也越高。只取微量纯DNA(6×10-8g),仍有转化能力。
这就说明,S型菌株转移给R型菌株的,决不是某一遗传性状(如荚膜多糖)本身,而是以DNA为物质基础的遗传因子。
图8-2 肺炎球菌体外转化试验图解
自菌系 SIII抽提的DNA与活R菌系细菌混合，少数R细胞转化成S细胞。加脱氧核糖核酸酶(DNase)可阻止转化作用
----2.噬菌体感染实验
----1952年,A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体遗传物质的著名实验――噬菌体感染实验。
----首先,他们将E.coli培养在以放射性32PO3-4或35SO2-4作为磷源或硫源的合成培养基中。结果,可以获得含32P-DNA(噬菌体核心)的噬菌体或含35S-蛋白质(噬菌体外壳)的两种实验用噬菌体。
----接着,他们作了以下两组实验(图8―3和8―4)。
----从以上两组实验中可清楚地看到,在噬菌体的感染过程中,其蛋白质外壳未进入宿主细胞
入宿主细胞的DNA经增殖、装配后,能产生一大群既有DNA核心又有蛋白质外壳的完整噬菌体颗粒。这就有力地证明,在其DNA中,含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。通过电
子显微镜的观察也证实了这个论点。
图8-3 用含32PDNA(核心)的噬菌体作感染实验
图8-4 用含35S蛋白质(外壳)的噬菌体作感染实验
----3.植物病毒的重建实验
----为证明核酸是遗传物质,H.Fraenkel-Conrat(1956年)用含RNA的烟草花叶病毒进行了著名的
植物病毒重建实验。把TMV放在一定浓度的苯酚溶液中振荡,就能将它的蛋白质外壳与RNA核
相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下,也能感染烟草并使其患典型症状,而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。但由于RNA是裸露的,所以感染频率较低。在实验中,还选用了另一株与TMV近缘的霍氏车前花叶病(HRV,Holmes
ribgrass mosaic virus)。整个实验的过程和结果见图8-5。
图8-5 TMV重建实验示意图(粗线 箭头表示遗传信息的去向)
----从图8―5可以看出,当用TMV的RNA与HRV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草时,
烟叶上出现的是典型的TMV病斑,从中分离出来的新病毒也是典型的TMV病毒。反之,用HRV的RNA与
TMV的蛋白质外壳进行重建时,也可获得相同的结论。这就充分说明,核酸(这里为RNA)是病毒 的遗传物质。
----至此,我们可确信无疑地得出结论,只有核酸才是贮存遗传信息的真正物质。
三、遗传物质在细胞中的存在方式
----遗传物质在生物体中有多种多样的存在方式。下面从7个方面加以叙述。
----1.细胞水平
----不论是真核微生物还是原核微生物,它们的大部或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。不同的微生物细胞或同种微生物的不同类型细胞中,细胞核的数目是不同的。例如,Sa
ccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)、Aspergillus niger(黑曲霉)、A.nidulans
(构巢曲霉)和Penicillium chrysogenum(产黄青霉)等真菌一般是单核的;有的如Neurospora
crassa(粗糙脉孢菌)和A.oryzae(米曲霉)是多核的;藻状菌类真菌和放线菌类的菌丝细胞是多核的,而孢子则是单核的;在细菌中,杆菌细胞内大多存在两个核质体,而球菌一般只有一个。
----2.细胞核水平
----真核生物与原核生物之间存在着一系列明显的差别:前者的核有核膜包裹,形成有完整形态的核,核内DNA与组蛋白结合成显微镜下可见的染色体;而后者的核则无核膜包裹,呈松散的核质体状态,DNA不与蛋白质相结合。
----除了它们具有集中着大部分DNA的核或核质体外,在细胞质中还存在着一些能自主复制的核外遗传物质。微生物核内及核外染色体的种类如下:
遗传物质〖JB(｛Z〗核内染色体(核基因组)核外染色体〖JB(｛Z〗真核生物的质粒〖JB(｛Z
〗〖SX(B〗细胞质基因(质体)〖JB(｛Z〗线粒体叶绿体中心体共
生生物:卡巴颗粒原核生物的质粒〖JB(｛Z〗F因子R因子Col质粒Ti质粒 巨大质粒降解性质粒
----3.染色体水平
----在不同生物体的每个细胞核内,往往有不同数目的染色体。真核微生物常有较多的染色体,如Saccharomyces(酵母属)为17,Hansenula(汉逊酵母属)为4,Neurospora(脉孢菌属)为7等;而在原核生物中,每一个核质体只是由一个裸露的、光学显微镜下无法看到的环状染色体所组成。对原核生物来说,染色体水平实际上就是核酸水平。
----除染色体的数目外，染色体的套数也不同。如果在一个细胞中只有一套相同功能的染色体，它就是一个单倍体。在自然界中发现的微生物，多数都是单倍体的；包含有两套相同功能
染色体的细胞，就称为双倍体。只有少数微生物如一般的Saccharomyces
cerevisiae(酿酒酵母)的营养细胞以及由两个单倍体的性细胞通过接合或体细胞融合而形成的合子，才是双倍体。在原核生物中，通过转化、转导或接合等过程而获得外源染色体片段时，只能形成一种不稳定的称作部分双倍体的细胞。
----4.核酸水平
----从核酸的种类来看，绝大多数生物的遗传物质是DNA，只有部分病毒(其中多数是植物病毒，还有少数是噬菌体)的遗传物质才是RNA。在真核生物中，DNA总是缠绕着组蛋白，两者一起
构成了复合物――染色体；而原核生物的DNA都是单独存在的。在核酸的结构上，绝大多数
微生物的DNA是双链的，只有少数病毒为单链结构，例如E.coli的Φ×174和fd噬菌体 等；RN
A也有双链(大多数真菌病毒)与单链(大多数RNA噬菌体)之分。从DNA的长度来看，真核生物的DNA比原核生物的长得多，但不同生物间的差别很大。如酿酒酵母的DNA长约6.5mm，E.coli约1.1～1.4mm，枯草芽孢杆菌约1.7mm，Haemophilus
influenzae(嗜血流感杆菌)约
0.832mm。此外，同是双链DNA，其存在状态也不同：在原核生物中都呈环状；在病毒粒子中呈环状或线状；在细菌质粒中，DNA是呈超螺旋(或“麻花”)状。
----5.基因水平
----在生物体中，一切具有自主复制能力的遗传功能单位，都可称为基因。基因的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段。每一个基因的分子量约为6.7×105Da，约含1000bp(
碱基对)，每个细菌一般含有5，000―10，000个基因。
----从基因的功能上来看，原核生物的基因是通过组成以下调控系统而发挥作用的：
基因调控系统〖JB(｛Z〗操纵子〖JB(｛Z〗启动基因操纵基因结构基因调节基因〖KH*2〗
----由上可知，原核生物的基因调控系统是由一个操纵子(operon)和它的调节基因(regulator
g ene)组成的。一个操纵子又包含3种基因，即结构基因(structure gene)、操纵基因(opera
tor)和启动基因(promotor)。结构基因是通过转录和翻译过程来执行多肽(酶及结构蛋白)合
成的，操纵基因是与结构基因紧密连锁在一起的，是阻遏蛋白的附着部位，它能控制结构基
因转录的开放或关闭。启动基因是转录的起始部位，是RNA多聚酶附着和启动的部位。操纵基因和启动基因不能转录RNA，不产生任何基因产物。调节基因一般与操纵子有一定间隔距离(一般小于100个碱基)，它是调节操纵子中结构基因活动的基因。调节基因能转录出自己的mRNA,并经翻译产生阻遏蛋白,后者能识别和附着在操纵基因上。由于阻遏蛋白与操纵基因的相互作用可使DNA双链无法分开，阻挡了RNA聚合酶沿着结构基因移动，从而关闭了结构基因的转录。
----6.密码子水平
----遗传密码就是指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序。每个密码子(codon)是由3个核苷酸顺序所决定的，它是负载遗传信息的基本单位。各种生物都遵循着一套共同的密码。由于DNA上的三联密码子要通过转录成mRNA密码后才能与氨基酸相对应，因此，三联密码子一般都用
mRNA上的3个核苷酸顺序来表示(表8―1)。
表8-1 mRNA上的三联密码子
甲硫氨酸或
甲酰甲硫氨酸
----从上表中可以看出,由4种核苷酸组成三联密码子的方式可多达64种(43=64),它们对用于决定20种氨
基酸来说已是绰绰有余了。在生物进化过程中早已解决了这一问题:有些密码子的功能是重复的(如决定亮氨酸的就多达6个密码子),此种情况称做兼并(degeneracy),即由一种以上密
码子编码同一种氨基酸的现象。对应于同一种氨基酸的密码子称为同义密码子(synonymous
codon)。而另一些则被用作“起读”(AUG,代表甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸,是一个起始信号)或“终止”信号(UAA、UGA和UAG,在表中以“。”表示)。
----7.核苷酸水平
----上面讲的基因水平,实际上是一个遗传的功能单位,密码子水平是一个信息单位,而核苷酸水
平(即碱基水平)则可认为是一个最低突变单位或交换单位。在绝大多数生物的DNA组分中,都只含腺苷酸(AMP)、胸苷酸(TMP)、鸟苷酸(GMP)和胞苷酸(CMP)4种脱氧核苷酸,但也有少数例
外,它们含有一些稀有碱基。例如E.coli的T偶数噬菌体的DNA上就含有少量的5-羟甲基胞嘧啶。
四、原核生物的质粒
----质粒指游离于原核生物染色体外,具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子,即cccDNA(circular
covalently closed DNA)。1984年以后,在天蓝色链霉菌等放线菌中又发现携
带有抗生素合成基因的线形质粒。质粒分子量一般在106～108Da间,大小约为1%核基因
组。质粒上携带着某些染色体上所没有的基因,使细菌等原核生物被赋予了某些对其生存并可有可无的特殊功能。例如接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解有毒物质等功能。所以质粒的消失不会造成菌体死亡。
----质粒是一种复制子(replicon)。如果其复制与核染色体的复制同步,称为严紧型复制控制(st
ringent replication control)。在这类细胞中,一般只含1～2个质粒;另一类质粒的复制与
核染色体的复制不同步,称为松弛型复制控制(relaxed replication control),在这类细胞
中,一般含10～15个或更多质粒。少数质粒可以在不同菌株间发生转移,如F因子和R因子等。含质粒的细胞在正常的培养基上遇吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子
或高温等因素处理时,由于质粒的复制受到抑制而核染色体的复制仍继续进行,故可使子代细胞中的质粒消失(curing或elimination)。某些质粒具有与核染色体整合和脱离的功能,如F因子,这类质粒就称附加体(episome)。质粒还具有重组的功能,可在质粒与质粒间及质粒与核染色体间发生重组。最有代表性的几种细菌质粒简介如下:
----1.F因子(fertility factor)
----又称致育因子或性因子。是E.coli等细菌中决定性别的质粒。约等于2%核染色体DNA的小型cccDNA。分子量为6.2×107Da,94.5kb,其中有1/3的基因(tra区)与接合作用有关。
----2.R因子(resistance factor)
----又称R质粒。多数R因子是由相连的两个DNA片段组成。其一称RTF质粒(resistance
transfer factor,抗性转移因子),它含有调节DNA复制和拷贝数的基因及转移基因,有时还有四环素抗
性基因(tet)。RTF的分子量为11×106Da。其二为抗性决定质粒(r-determinant),大小不
固定,从几百万直至100×106Da以上。其上含有其他抗生素的抗性基因,例如抗青霉素(Pen)、安比西林(Amp)、氯霉素(Cam)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)和磺胺(Sul)等基因。由RTF质粒和r决定质粒结合形成R因子的过程见图8-6。
图8-6一种可通过接合而转移 的R因子的形成
(IS因子是转座因子，它可使RTF质粒和r决定质粒结合)
----R因子对多种抗生素有抗性,因此可作为筛选时的理想标记,也可用作基因载体。
----3.Col因子(colicinogenic factor)
----产大肠杆菌素因子。许多细菌都能产生使其他原核生物致死的蛋白质类细菌毒素(bacteriocin)。大肠杆菌素(colicin)是一种E.coli的某些菌株所分泌的细菌毒素,具有通过
抑制复 制、转录、翻译或能量代谢等而专一地杀死其他肠道细菌的功能。其分子量约4×104～8 ×
104Da。大肠杆菌素是由质粒――Col因子编码的。凡带Col因子的菌株,由于质粒本身编码一种免疫蛋白,从而对大肠杆菌素有免疫作用,不受其伤害。
----4.Ti质粒(tumor inducing plasmid)
----诱癌质粒。根癌土壤杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)可引起许多双子叶植物的根癌,它是由该菌的Ti质粒所引起的。当细菌侵入到植物细胞中后,把细菌的DNA
释放至植物细胞中,此时,含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体组发生整
合,破坏控制细胞分裂的激素调节系统,从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长200kb,是一大型质粒。Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可
借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中,并进一步使之整合到植物染色体上,以改变该植物的遗 传性,达到培育植物优良品种的目的。
----5.巨大质粒(mega质粒)
----为近年来在根瘤菌属(Rhizobium)中发现的一种质粒,分子量为200～300×106Da,比
一般质粒大几十倍至几百倍,故称巨大质粒,其上有一系列固氮基因。
----6.降解性质粒
----只在假单胞菌属(Pseudomonas)中发现。它们的降解性质粒可编码一系列能降解复杂物质的酶,从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。这些质粒以其所分解的底物命名,例如有分解CAM(樟脑)质粒,OCT(辛烷)质粒,XYL(二甲苯)质粒,SAL(水杨酸)质粒,MDL(扁桃酸)
质粒,NAP(萘)质粒和TOL(甲苯)质粒等。
　第二节 基因突变与基因重组
突变(mutation)指遗传物质核酸(DNA或RNA)中的核苷酸顺序突然发生了稳定的可遗传的变化。突变包括基因突变(gene
mutation,又称点突变)和染色体畸变(chromosomal aberration)
两类,其中以点突变为常见。基因突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起
的。染色体畸变则是DNA的大段变化(损伤)现象,表现为染色体的插入(insertion)、缺失(deletion)、重复(duplication)、易位(translocation)和倒位(inversion)。由于重组或附加体等外源遗传物质的整合而引起的DNA改变,则不属突变的范围。突变几率一般在10~-6～10~-9范围内。
一、基因突变
----1.基因突变的类型
----基因突变的类型极为多样。人们可从不同的角度进行分类,并给以不同的名称。按突变体表型特征,可把突变分成以下几种类型:
----形态突变型--指突变引起细胞形态变化或引起菌落形态改变。
如细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无,菌落的大小、外形的光滑(S型)、粗糙(R型)和颜色等的变异;放线菌或真菌产孢子的多少、外形或颜色的变异等。
----生化突变型--指一类发生代谢途径变异但形态没有明显变化的突变型。该突变型可进一步细分为营养缺陷型、抗性突变型和抗原突变型3种类型。
----营养缺陷型--是一类重要的生化突变型。由基因突变而引起代谢过程中某酶合成能力丧失的突变型,必须在原有培养基中添加细胞不能合成的营养成分才能正常生长。
----抗性突变型--是一类能抵抗有害理化因素的突变型。据其抵抗的对象可分抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等突变类型。它在遗传学基本理论的研究中十分有用,常作为选择性标记菌种。
----抗原突变型--指细胞成分尤其是细胞表面成分(细胞壁、荚膜、鞭毛)的细微改变而引起抗原性变化的突变型。
----致死突变型--由于基因突变而导致个体死亡的突变型。
----条件致死突变型--某菌株或病毒经基因突变后,在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型,而在另一条件下却无法生长、繁殖的突变类型。温度敏感突变株(temper
ature-sensitive
mutant,Ts突变株)是一类典型的条件致死突变株。例如,E.coli的某些菌株可在37℃下正常生长,却不能在42℃下生长等。某些T4噬菌体突变株在25℃下有感染力,
而在37℃下则失去感染力等。产生Ts突变的原因是突变引起了某些重要蛋白质的结构和功能改变,以致在某特定的温度下能发挥其功能,而在另一温度(一般为较高温度)下则该功能丧失。
----其他突变型--如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突变型等。
----以上分类仅是为了讨论方便而提出的。实际上,它们之间是密切联系或是交叉的。如果从研究者能否在巨大群体中迅速检出和分离出个别突变体的目的来看,则只有选择性突变和非
选择性突变两类。前者具有选择性标记,可通过某种环境条件使它们得到优势生长,从而取代原始菌株。例如营养缺陷型或抗性突变型等;后者没有选择性标记,而只有一些性状的数量差别。例如菌落大小、颜色深浅及代谢产物量的多少等。
----2.基因突变的特点
----整个生物界,由于它们的遗传物质是相同的,所以显示在遗传变异的本质上都遵循着同样的规律,这在基因突变的水平上尤为明显。以下以细菌的抗药性为例说明基因突变的一般特点。
----不对应性--即突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。例如,细菌在有青霉素的环境下,出现了抗青霉素的突变体;在紫外线的作用下,出现了抗紫外线的突变体;在较高的培养温度下,出现了耐高温的突变体等。从表面上看,会认为正是由于青霉素、紫外线或高温的“诱变”,才产生了相对应的突变性状。事实恰恰相反,这类性状都可通过自发的或其他任何诱变因子诱发得到。这里的青霉素、紫外线或高温仅是起着淘汰原有非突变型(敏感型)个体的作用。
----自发性--各种性状的突变,可以在没有人为的诱变因素处理下自发产生。
----稀有性--指自发突变的频率较低,而且稳定,一般在10-6～10-9
间。所谓突变率,一般指每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的机率,也可用单位群体在
繁殖一代过程中所形成突变体的数目表示。例如,突变率为1×10-8,就意味着108个细胞群体分裂成2×108个细胞时,平均会形成一个突变体。
----独立性--突变的发生一般是独立的,即在某一群体中,既可发生抗青霉素的突变型,也可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性。某一基因的突变,即不提高也不降低其他任何基因的突变率。突变不仅对某一细胞是随机的,且对某一基因也是随机的。
----诱变性--通过诱变剂的作用,可提高自发突变的频率,一般可提高10～105倍。
----稳定性--由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化。所以产生的新性状也是稳定和可遗传的。
----可逆性--由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程称为正向突变(forw
ard mutation),相反的过程则称为回复突变或回变(back mutation或reverse
mutation)。实验证明,任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。
----3.基因突变的自发性和不对应性的证明
----在过去的很长一段时间中,对常见抗性突变产生的原因争论很大。一种观点认为,突变是通
过适应而产生的,各种抗性就是由其环境所含的抵抗因子诱发出来的,即突变的原因和突变的
性状间是相对应的,并认为这就是“定向变异”,也有人称它为“驯化”或“驯养”。另一种
看法则认为,基因突变是自发的,且与环境不相对应。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起,所以难以探究问题的实质。从1943年起,通过几个严密的科学实验证明了自发突变的存在。
----变量试验(fluctuation
test)又称波动试验或彷徨试验。1943年,Luria和 Delbrück据统计学的原理,设计了如下实验(图8-7)。
图8-7 Luria等的变量试验
----实验要点:取对噬菌体T1敏感的大肠杆菌对数期肉汤培养物,用新鲜培养液稀释成浓度为10
3/ml的细菌悬液,然后在甲、乙两试管中各装10ml。接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中(每管装0.2ml),保温24～36小时后,即把各小管的菌液分别倒在50个预先涂有T1的平板上,
经培养后计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数;乙管中的10ml菌液不经分装先整管保温24 ～
36小时,然后才分成50份加到同样涂有噬菌体的平板上,适当培养后,同样分别计算各皿上产生的抗性菌落数。
----结果表明,来自甲管的50皿中,各皿间抗性菌落数相差极大(图8-7,左),而来自乙管的则各
皿数目基本相同(图8-7,右)。这就说明,E.coli抗噬菌体性状的突变,不是由所抗的环境 因素―
―噬菌体诱导出来的,而是在它接触到噬菌体前,在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的
。这一自发突变发生得越早,则抗性菌落出现得越多,反之则越少,噬菌体在这里仅起着淘汰
原始的未突变的敏感菌和鉴别抗噬菌体突变型的作用。利用这一方法,还可计算出突变率。
----涂布试验(Newcombe experiment)--1949年,Newcombe曾设计了一种与变量试验相似,但方法更为简便的证实同一观点的实验,即涂布试验。与变量试验不同,他用的是固体平板培养法。先在12只培养皿平板上各涂以数目相等(5×104)的大量对噬菌体T1敏感的大肠杆菌,经5小
时的培养,约繁殖12.3代,于是在皿上长出大量微菌落(这时每一菌落约含5100个细胞)。取其中6皿直接喷上T1噬菌体,另6皿则先用灭菌玻棒把上面的微菌落重新均匀涂布一次,然后同样喷上相应的T1。经培养过夜后,计算这两组培养皿上所形成的抗噬菌
体菌落数。结果发现,在涂布过的一组中,共有抗性菌落353个,要比未经涂布过的(仅28个菌
落)高得多(图8-8)。这也意味着该抗性突变发生在未接触噬菌体前。噬菌体的加入只起甄别这类突变是否发生的作用，而不是诱导突变的因素。
图8-8 Newcombe的涂布试验
----影印培养(replica plating)试验--1952年,Lederberg夫妇
设计了一种更为 巧妙的影印培养法,直接证明了微生物的抗药性突变是自发产生,与相应的环境因素毫不相
关的论点。所谓影印培养法,实质上是使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一
种接种培养方法。其基本过程是:把长有许多菌落(可多达数百个)的母种培养皿倒置于包有
灭菌丝绒布的木圆柱(直径略小于培养皿)上,然后可把这一“印章”上的细菌一一接种到不
同的选择性培养基平板上,待培养后,对各皿相同位置上的菌落作对比后,就可选出适当的突
变型。据报道,用这种方法,可把母平板上10～20%的细菌转移到绒布上,并可利用它接种8
个子培养皿。因此,通过影印培养法,可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中,分离出各 种类型的突变种。
----图8-9就是利用影印培养技术证明大肠杆菌K12自发产生抗链霉素突变的实验。大致方
法是:首先把大量对链霉素敏感的大肠杆菌K12涂布在不含链霉素的平板(1)的表面,待
其长出密集的小菌落后,用影印法接种到不含链霉素的培养基平板(2)上,随即再影印到含有
链霉素的选择性培养基平板(3)上。影印的作用可保证这3个平板上所生长的菌落的亲缘和相
对位置保持严格的对应性。经培养后,在平板(3)上出现了个别抗链霉素的菌落。对培养皿(2
)和(3)进行比较,就可在平板(2)的相应位置上找到平板(3)上那几个抗性菌落的“孪生兄弟”。然后把平板(2)中最明显的一个部位上的菌落(实际上是许多菌落)挑至不含链霉素的培养
液(4)中,经培养后,再涂布在平板(5)上,并重复以上各步骤。上述同一过程几经重复后,只要涂上越来越少的原菌液至相当于平板(1)的培养皿(5)和(9)中,就可出现越来越多的抗性菌落,最后甚至可以得到完全纯的抗性菌群体。由此可知,原始的链霉素敏感菌株只通过(1)→
(2)→(4)→(5)→(6)→(8)→(9)
→(10)→(12)的移种和选择序列,就可在根本未接触链霉素的情况下,筛选出大量的抗链霉素的菌株。
图8-9 J.Lederberg等设计的平板影印培养法
----影印培养法不仅在微生物遗传理论研究中有重要应用,而且在育种实践和其他研究中均有应用。
----4.突变的机制
----基因突变的原因是多种多样的,它可以是自发的或诱发的。诱变又可分为点突变和畸变。它们的各种具体类型概括如下:
在DNA上的初级效应遗传效应
碱基类似物
AT与GC转换
与胞嘧啶起反应
GC→AT转换
A、G、C的氧化脱氨作用
AT与GC转换
烷化碱基(主要是G)
烷化磷酸基团
丧失烷化的嘌呤
糖-磷酸骨架的断裂
AT与GC转换
AT→TA颠换
GC→CG颠换
巨大损伤(缺失、重复、倒位、易位)
碱基之间的相互作用(双链变形)
码组移动(+或-)
形成嘧啶的水合物
形成嘧啶的二聚体
GC→AT 转换
码组移动(+或-)
碱基的羟基化和降解
糖-磷酸骨架的断裂
AT与GC转换
码组移动(+或-)
巨大损伤(缺失、重复、倒位、易位)
CG→TA转换
结合到一个基因中间
----现以亚硝酸为例来说明碱基转换的分子机制。亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用,故它能使腺嘌呤(A)变成次黄嘌呤(H),以及使胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U),从而发生转换。它也可使鸟嘌
呤(G)变成黄嘌呤(X),但这时不能引起转换。以下仅举其中的A→H引起的转换反应(图8-11)。
图8-11 亚硝酸使腺嘌呤氧化脱氨形成次黄嘌呤
----由亚硝酸引起的使A∶T转换成G…C过程的简式见图8-12。
图8-12 由亚硝酸引起的A∶T→G…C转换过程(简式)
----从图8-12中可以看出转换过程的几个环节:①腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤(He);
②由He通过自发产生的互变异构效应而形成酮式次黄嘌呤(HK);③DNA双链第一次复制,结果H
K因其在6位上含有酮基,故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶(C)配对;④DNA双链的第二次复制,
这时其中的C按常规与G配对,因而最终实现了转换。这种变化的反应细节见图8-13。
图8-13 由亚硝酸引起的A∶T转换成G…C的反应细节
间接置换诱变：引起这类变异的诱变剂是一些碱基类似物,如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤(6-CP)等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中引起的,故是间接的。现以5-溴尿嘧啶为例来加以说明
----5-BU是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的培养液中时,细胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5-BU一般以酮式状态存在于DNA中,因而仍可正常地与A配对［图8
-14(2)］,这时并未发生碱基对的转换;有时5-BU会以烯醇式状态出现在DNA中,于是当DNA进
行复制时,在其相对位置上出现的就是G,而不是原来的A［图8-14(3)］,因而引起碱基对从A
∶T至G…C的转换［图8-14(1)］。
图8-14 5BU在以酮式或烯醇式状态存在时引起的A∶T→G…C的转换
(5BUk为酮式的5BU;5BUe为烯醇式的5-BU)
5BU掺入后DNA分子的三次复制过程及其可能引起的碱基对转换
(BUk为酮式5BU；BUe为烯醇式5BU)
----从图8-15(2)中,还可以看到5BU的掺入所引起的G…C回复至A∶T的过程。通过这两个图示,就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成突变,又可使它产生回复突变的原因。另外,
也可知道,为什么象5BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖的微生物才起作用,而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。
----移码突变(frame-shift
mutation或phase-shift mutation)--指诱变剂使DNA分子中一个或少数几个核苷酸的增添(插入)或缺失,从而使该部位后面的全
部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株,称为移码突变株( frame shift
mutant)。与染色体畸变相比,移码突变只能算是DNA分子的微小损伤。
----吖啶类染料,包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和α-氨基吖啶等,以及一系列称为ICR类的化合物［由美国的肿瘤研究所(Institute
for Cancer
Research)合成,它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物］,都是移码突变的有效诱变剂(图8-16)。
图8-16 能诱发移码突变的几种代表性化合物
----吖啶类化合物的诱变机制至今还不很清楚。有人认为,由于它们是一种平面型三环分子,结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似,故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间,造成双螺旋的部分解开(两个碱基
对原来相距0.34nm,当嵌入一个吖啶分子时,就变成0.68nm),从而在DNA复制过程中,会使链上
增添或缺失一个碱基,结果就引起了移码突变。
----在DNA链上增添或缺失一、二、或四、五个碱基时,均可引起移码突变,而增添或缺失三或六个时,则不影响读码,只引起短的缺失或增添(插入)。染色体畸变(chromosomal
aberration)某些理化因子,如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等,除了能引起点突变外,还会引起DNA的
大损伤(macrolesion)――染色体畸变,它既包括染色体结构上的缺失(deletion)、重复(dup
lication)、插入(insertion)、易位(translocation)和倒位(inversion),也包括染色体数
目的变化。
----染色体结构上的变化,又可分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化,例如发生染色体的部分缺失或重复时,其结果可造成基因的减少或增加;又如发生例位或易位时,则可造成基因排列顺序的改变,但数目却不改变。其中的倒位,是指断
裂下来的一段染色体旋转180°后,重新插入到原来染色体的位置上,从而使其基因顺序与其
他的基因顺序方向相反;易位则是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其他部位上。至于染色体间畸变,则是指非同源染色体间的易位。
----40年代B.McClintock对玉米的遗传研究发现了染色体易位。自1967年以来,已在微生物和
其他 生物中得到普遍证实,并已成为分子遗传学研究中的一个热点。过去,人们总认为基因是固定
在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段。近年来,发现有些DNA片段不但可在染色体上
移动,而且还可从一个染色体跳到另一个染色体,从一个质粒跳到另一个质粒或染色体,甚至
还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA片段的跳跃过程中,往往导致DNA链的断裂或 重接,从而产生重组交换或使某些基因启动
或关闭,结果导致突变的发生。这似乎就是自然界所固有的“基因工程”。目前把在染色体
组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA称作转座因子(transposible
element),也称作跳跃基因(jumping gene)或可移动基因(movable gene)。
----转座因子主要有3类,即插入序列(Is,insertion
sequence)、转座子(Tn,transposon,又称 转位子,易位子)和Mu噬菌体(即mutator
phage,诱变噬菌体)。
----以上讨论的染色体畸变类型在高等真核生物中很容易观察。在微生物中,尤其在原核生物中,是近年来才证实的。
----至此,我们已初步分析了碱基置换和移码突变的分子机制,并初步介绍了染色体畸变的类型和
特点。需注意的是,许多理化诱变剂的诱变作用都不是单一功能的。例如,亚硝酸既能引起碱
基对的转换作用,又能诱发染色体畸变;一些电离辐射也可同时引起基因突变和染色体 畸变。若干诱变剂的作用机制可见表8-2。
----自发突变机制--自发突变指微生物在没有人工参与下所发生的突变。随诱变机制的研究,对自发突变的原因已有所认识,下面讨论几种自发突变的可能机制。
----背景辐射和环境因素的诱变--不少“自发突变”实质上是由于一些原因不详的低剂量诱变因素长期综合诱变导致。例如,充满宇宙空间的各种短波辐射或高温诱变效应,以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变
物质(在微环境中有时也可能是高浓度)的作用等。
----微生物自身代谢产物的诱变--过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。它对Neurospora(脉孢菌)有诱变作用,这种作用可因同对加入过氧化氢酶而降低,如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN,则又可提高突变率。这就说明,过氧化氢很可能是“自发突变”中的一种内源性诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株,可能也是同样的原因。
----互变异构效应
DNA链中,T以烯醇式出现,则在复制时,其相对位置不再是A,而是G;C以亚氨基形式出现时,就
和A配对,这样就使基因发生突变,造成自发突变。由于在任何一瞬间,某一碱基是处于酮式或
烯醇式,还是氨基式或亚氨基式状态,目前还无法预测,所以要预言在某一时间、某一基因发
生自发突变仍是不可能的。但人们运用数学方法对这些偶发事件作了大量统计分析后,统计出了碱基对发生自发突变的几率约为10~-8～10~-9。
图8―17 通过环出效应引起自发突变的设想图
----环出效应--在DNA复制过程中,如果其中某一单链上偶而产生一个小环,则会因其上的基因越过复制而发
生遗传缺失,从而造成自发突变。图8-17就是环出效应的设想机制。在上链中,标记B处发生
“环出”,故只有A及C能获得复制,从而发生自发突变。而在下链中,则复制仍正常进行。
二、基因重组
----凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起,经过遗传物质分子重新组合,形成新遗传型个体的方式,称基因重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下,产生新遗传型个体
----重组可理解为遗传物质在分子水平上的杂交。而一般所说的杂交,则是细胞水平上的一个概念。真核微生物中的有性杂交、准性杂交及原核生物中的转化、转导
、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映(表8-3)。
表8-3 在微生物中各种形式基因重组的比较
整套染色体
供 体 和 受 体 间 的 关 系
部分染色体
个别或少数基因
细胞融合或联结
真菌的有性生殖
真菌的准性生殖
细胞间暂时沟通
细菌的接合
细胞间不接触
吸收游离DNA片段
噬菌体携带DNA
由噬菌体提供
完整噬菌体
*虽不属重组,但与转导和转化有某些相似处,可供比较。
----基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本
,因此不论在方向性还是自觉性方面,都比诱变育种前进了一大步。但由于杂交育种的方法较
复杂,工作进度较慢,因此还很难象诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用。
----1.原核微生物的基因重组
----在原核微生物中,基因重组主要有转化、转导、接合和原生质体融合4种形式(原生质体融合在第三节中详细介绍)。
----转化(transformation)--受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段,通过交换
,把它整合到自己的基因组中,从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象称为转化。转化后的受体菌,称为转化子。来自供体的DNA片段称为转化因子,其一般是双链DNA片段。
----两个菌种或菌株间能否发生转化,与它们在进化过程中的新缘关系有着密切的联系。但即使在转化率极高的菌种中,不同菌株间也不一定都可发生转化。能进行转化的细胞必须是感
受态的。受体菌最易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。处于感受态的细胞,其吸收DNA的能力,有时可比一般细胞大一千倍。感受态的出现受该菌的遗传性、菌龄、生理状态和培养条件等的影响。例如,肺炎双球菌的感受态在对数期的后期出现,而芽孢杆菌属则出现在对数期末及稳定期。
----伴随感受态的出现,细胞表面有新的蛋白质成分形成,该蛋白质称为感受态因子，它的分子量为5,000―10,
000Da。这种蛋白质可能是细胞膜上的一种组分,它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞 表
面某种成分,以让细胞表面的DNA受体显露出来;也可能是一种自溶酶。对不同的细菌而言,其每个细胞表面上可与DNA结合的位点数不同。在流感嗜血杆菌上有4～10个,而在肺炎双
球 菌上则有30～80个。由肺炎双球菌所产生的感受态因子,可使同菌株的非感受态细胞变成感
受态细胞。而枯草杆菌的感受态因子则没有这一作用。
图8―18 转化过程示意图
----用革兰氏阳性的肺炎双球菌作材料,发现转化过程大体可分以下几个阶段(见图8-18):①双链
DNA片段与感受态受体菌细胞表面的特定位点(主要在新形成细胞壁的赤道区)结合,此时,一
种细胞膜的磷脂成分――胆碱可促进这一过程；②在吸附位点上的DNA被
核酸内切酶分解,形成平均分子量为4～5×106的DNA片段；③DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除,另一条单链逐步进入细胞,这是一个耗能过程。分子量小于5×105的DNA片段不能进入细胞(对于转化作用来说，转化DNA片段必须具有一定的大小，片段过小，受体细胞便不能吸收)。这时如用低浓度溶菌酶处理,因它提高了细胞壁的通透性,故可提高
转化频率；④转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对,接着受体染色体组的相应单链片段被切除,并被外来的单链DNA所交换和取代,于是形成了杂合DNA区段(它们间的DNA顺序
不一定互补,故可呈杂合状态)(图8-19)；⑤受体菌染色体组进行复制,杂合区段分离成两个,
其中之一类似供体菌,另一类似受体菌。当细胞分裂后,此染色体发生分离,于是就形成了1个转化子。
转化中单链外基因组片段与双链内基因组间的交换与整合过程示意图
a.带abc标记的单链外基因组的DNA片段靠拢带ABCDE标记的内基因组双链DNA分子，AB间出现裂口；b.部分双链解开，单链与双链相互配对；c和d.外切核酸酶从DNA分子的3′末端进行酶解；e.通过聚合酶和连接酶形成重组后的DNA分子，其中有一条链是带有ABcDE标记的新基因组合
----如果把噬菌体或其他病毒的DNA(或RNA)抽提出来,让它去感染感受态的宿主细胞,并进而产生正常的噬菌体或病毒后代,这种现象称为转染(dtransfection)。
----它与转化不同之处是病毒或
噬菌体并非遗传基因的供体菌,中间也不发生任何遗传因子的交换或整合,最后也不产生具有杂种性质的转化子。
----转导(transduction)--通过缺陷噬菌体的媒介,把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中,从而使后者获得了前者部分遗传性状的现象,称为转导。获得新遗传性状的受体细胞,称为转导子。
----转导现象最早(1952年)是在鼠伤寒沙门氏杆菌中发现的。以后在许多原核微生物中都陆续发现了转导,如大肠杆菌(E.coli),芽孢杆菌属(Bacillus),变形杆菌属(Proteus),假单胞菌属(Pseudomonas),志贺氏菌属(Shigella)和葡萄球菌属(Staphylococcus)等。
----目前所知道的转导已有多种,现分别介绍如下。
----普遍转导(generalized
transduction)--噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒),并使受体菌实现各种性状的转导,此即普遍性转导。普遍转导又可分为完全普遍转导和流产普遍转导两种类型。
----完全普遍转导：简称完全转导(complete
transduction)。在鼠伤寒沙门氏菌的完全普遍转导实验中,曾以其野生型菌株作供体菌,营养缺陷型为受体菌,P22噬菌体作为转导媒介。当P22在供体菌内增殖时,宿主的染色体组断裂,待噬菌体成熟之际,极少数(10-5-10-8)
噬菌体的衣壳将与噬菌体头部DNA芯子相仿的供体菌DNA片段(在P22情况下,约为供体
菌染色体组的1%)误包入其中,因此,形成了完全不含噬菌体本身DNA的假噬菌体(一种完全缺陷的噬菌体)。当供体菌裂解时,如把少量裂解物与大量的受体菌群相混,这种误包着供体菌
基因的特殊噬菌体就将这一外源DNA片段导入受体菌内。由于1个细胞只感染了1个完全缺陷的假噬菌体(转导噬菌体),故受体细胞不会发生溶原化,更不会裂解;还由于导入的供体DNA片段可与受体染色体组上的同
源区段配对,再通过双交换而重组到受体菌染色体上,于是就形成了遗传性稳定的转导子(图8-20和8-21)。
图8-20 由P22噬菌体引起的完全普遍转导图
外源染色体片段(双链DNA)通过双交换而形成一个稳定的转导子图示
----除鼠伤寒沙门氏杆菌P22噬菌体外,大肠杆菌的P1噬菌体和枯草杆菌的PBS1和SP10等噬菌体都能进行完全转导。
----流产普遍转导：简称流产转导。在许多获得供体菌DNA片段的受体菌内,如果转导DNA不能与受体菌DNA进行重组并复制,其上的基因仅经过转录而得到了表达,就称流产转导。当这一细胞进行分裂时,只能将这段DNA分配给一个子细胞,而另一子细胞只获得供体基因的产物――酶,因此仍可在表型上出现供体菌的特征,每经过一次分裂,就受到一次“稀释”。所以,能在选择性培养基平板上形成微小菌落就成了流产转导的特点。(图8-22)。
图8-22 流产转导示意图
----局限转导(restricted或specialized
transduction)--最初于1954年在E.coli
K12中发现。指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中,并获得表达的转导现象。它有以下特点:①只能转导供体菌的个别特定基因(一般为噬菌体整合位点两侧的基因);②该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带;③缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率(10-5左右)“误切”,或由于双重溶源菌的裂
解而形成,在后一情况下可形成50%缺陷噬菌体。E.coli
K12的λ噬菌体可进行局限转导。据转导频率的高低可把局限转导分低频转导和高频转导两类。
----低频转导(LFT ,low frequency
transduction)：已知当温和噬菌体感染受体菌后,其染色体会开环,并以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上,从而使宿主细胞发生溶原化,并获得对相同温和噬菌体的免疫性。如果该溶原菌因诱导而发生裂解时,就有极其少数(～10-5)的前噬菌体发生不正常切离,其结果会将插入位点
两侧之一的少数宿主基因(如E.coliλ前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生
物素的bio基因)连接到噬菌体DNA上(而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上)
,通过衣壳的“误包”,就形成了一种特殊的噬菌体――缺陷噬菌体(图8-23)。在E.coli K12中,可形成λdgal
或λdg(带有供体菌gal基因的λ缺陷噬菌体,其中的“d”表示缺陷)或λdbio(带有供体菌bi
o基因的λ缺陷噬菌体),它们没有正常λ噬菌体所具有的使宿主发生溶原化的能力。当它感 染
宿主细胞并整合在宿主的核基因组上时,可使宿主细胞成为一个局限转导子(即获得了供体菌
的gal或bio基因),而不是一个溶原菌,因而对λ噬菌体不具有免疫性。
图8-23 低频转导(LFT)裂解物的形成
----由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低,因此在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比
例是极低(10-4～10-6)的,这种裂解物称LFT(低频转导)裂解物。LFT裂解物在低m.o.i(感染复数)情况下感染宿主,可获得极少量的局限转导子,这就是低频转导。
----高频转导(HFT,high frequency
transduction)：
当E.coligal-(不发酵半乳糖的营养缺陷型)这种受体菌用高感染复数的LFT裂解物进行感染时
,则凡感染有λdgal噬菌体的任一细胞,几乎同时都感染有正常的λ噬菌体。这时,这两种噬
菌体可同时整合在一个受体菌的核染色体组上,从而使它成为一个双重溶原菌。当双重溶原
菌被紫外线等诱导时,其中的正常λ噬菌体的基因可补偿λdgal所缺失的部分基因功能,因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以,在双重溶原菌中的正常λ噬菌体被称为助体(或辅
助)噬菌体。据以上的特点可以知道,由双重溶原菌所产生的裂解物中,含有等量的λ和λdgal粒子,这就称HFT(高频转导)裂解物。如用低m.o.i的HFT裂解物去感染另一个E.coligal-
受体菌(不能发酵半乳糖的受体菌)的话,则可高频率地把它转化为能发酵半乳糖E.coligal+转导子。这种转导方式称高频转导。
----溶原转变(Lysogenic
conversion)--是一种表面上与转导相似但本质上却不同的特殊现象。当温和噬菌体感染其宿主而使之发生
溶原化时,因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上,而使后者获得了除免疫性以外的新性状的
现象称为溶原转变。当宿主丧失这一噬菌体时,通过溶原转变而获得的性状也同时消失。溶原转变与转导有本质上的不同,首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因;其次,这种
噬菌体是完整的,而不是缺陷的。
----溶原转变的典型例子是不产毒素的白喉棒杆菌(corynebacterium
diphtheriae)菌株在被β噬菌体感染而发生溶原化时,会变成产白喉毒素的致病菌株。另一例是鸭沙门氏菌(Salm
anatum)用E15噬菌体感染而引起溶原化时,细胞表面的多糖结构会发生相应的变化。最近,国内有人发现,在红霉素链霉菌(Streptomyces
erythreus)中的P4噬菌体也具有溶原转变能力,它决定了该菌的红霉素生物合成及形成气生菌丝等能力。
----接合(conjugation)--通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大
段DNA的过程称为接合(有时也称“杂交”)。由于在细菌和放线菌等原核生物中出现基因重组的机会极为少见(如大肠杆菌K12约为10-6),而且由于它们比较缺少形态指标
,所以关于细菌接合的工作直至Lederberg等1946年采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验
后,才奠定了方法学上的基础。研究细菌接合方法的基本原理见图8-24。
图8-24 研究细菌接合方法的基本原理
----在细菌和放线菌中都存在着接合现象,在细菌中,以革兰氏阴性细菌如大肠杆菌以及沙门氏菌
(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、赛氏杆菌(Serratia)、弧菌(Vibrio)
、固氮菌(Azotobacter)、克氏杆菌(Klebsiella)和假单胞杆菌(Psudomonas)等属生活在动物肠道内的一些种最为常见。在放线菌中,研究得最多的是链霉菌属(Streptomyces)和诺卡氏菌属(
Nocardia)等,尤以天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)研究得最为详细。此外,
接合还可发生在不同属的一些种间,如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌间或鼠伤寒沙门氏菌与痢疾志贺氏菌之间。
----在细菌中,接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌。大肠杆菌有性别分化,决定它们性别的
因子称为F因子(即致育因子或性质粒)。F是一种独立于染色体外的小型的环状DNA,一般呈超螺旋状态,它具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力。此外,还带有一些对细胞生命活动关系较小的基因。F因子的分子量为5×107。在大肠杆菌中,F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%。每个细胞含有1～4个F因子。即F因子是一种属于附加体的质粒,它既可脱离染色体在细胞内独立存在,也可插入(即整合)到染色体组上;同时,它既可
经过接合作用而获得,也可通过一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、丝裂霉
素C、硫酸+二酯钠、亚硝基胍、利福平、溴化乙锭、环已亚胺和加热等)的处理,使其DNA复
制受抑制后而从细胞中消失(图8-25)。
图8-25 F因子的存在方式及其相互关系
----凡有F因子的菌株,其细胞表面就会产生1～4条中空而细长的丝状物,称为性菌毛(sex
pili) 。它的功能是在接合过程中转移DNA。从图8-25可以看出，据F因子在细胞中的有无和存在方
式不同,可把大肠杆菌分为以下4种接合类型:
----F+(“雄性”)菌株--在这种细胞中存在着游离的F因子,在细胞表面还有与F因子数目相当的性菌毛。当F+菌株与F-菌株相接触时,前者通过性菌毛将F因子转移到后者细胞中,并使F-菌株也转变成F+(一般达到100%)。F因子的传递过程为:①F因子上的一条DNA单链在特定的位置上发生断裂
;② 断裂的单链逐渐解开,同时以留下的另一条环状单链作模板,通过模板的旋转,一方面将解开
的一条单链通过性菌毛而推入F-中,另一方面,又在供体细胞内,重新合成一条新的环状单链,以取代解开的单链,此即“滚环模型”(rolling
circle model);③在F-细胞中,外来的
供体DNA单链上也合成了一条互补的新DNA链,并随之恢复成一条环状的双链F因子,因此,F- 就变成了F+。
----F-(“雌性”)菌株--在这种细胞中没有F因子,表面也不具性菌毛。它可通过与F+菌株或F′菌株的接合而接受外来的F因子或F′因子,从而使自己成为“雄性”的菌株,同时还可接受来自Hfr菌株的
部分或全部染色体信息。如属后一种情况,则它在获得一系列Hfr菌株性状的同时,还获得了处于转移染色体末端的F因子,使自已从原来的“雌性”转变成“雄性”菌株。有人统计,从自然界分离的2,000个大肠杆菌菌株中,F-约占30%。
----Hfr(高频重组,high
frequency recombination)菌株--它与F-接合后的重组频率比F+与F-接合后的重组频率高出几百倍以上,
在Hfr细胞中,存在着与染色体特定位点相整合的F因子(产生频率约10-5)。当它与F
-菌株发生接合时,Hfr染色体在F因子处发生断裂,由环状变成线状。整段线状染色体转移到F-
细胞的全过程约需100分钟。在转移时,由于断裂发生在F因子中,所以必然要等Hfr的整条染色体组全部转移完成后,F因子才能完全进入F-细胞。可是,由于种种原因,这种线状染色体在转移过程中经常会发生断裂,所以Hfr的许多基因虽可进入F-,但越在前端的基因,进入的机会就越多,故在F-中出现重组子的时间就越早,频率也高。而F因子因位于最末端,故进入的机会最少,引起性别转化的可能性也最小。因此,Hfr与F-接合的结果重组频率虽高,但却很少出现F+的菌株。
----Hfr菌株的染色体转移与F+菌株的F因子转移过程基本相同。所不同的是,进入F-的单链
染色体片段经双链化后,形成部分合子,然后两者的同源染色体进行配对,一般认为要经过两次或两次以上的交换后才发生遗传重组(图8-26)。
图8-26 Hfr与F-菌株间的接合中断试验
F因子用波线表示，虚线表示
新合成的DNA单链，双环表示
细菌染色体的DNA双链
----由于上述转移过程存在着严格的顺序性,所以在实验室中可以每隔一定时间利用强烈搅拌(例
如 用组织捣碎器或杂交中断器)等措施,使接合菌中断接合,从而可以获得呈现不同数量Hfr性状
的F-接合子。根据这一实验原理,就可选用几种有特定整合位点的Hfr菌株,在不同时间使
接合中断,最后根据在F-中出现Hfr中各种性状的时间早晚(用分钟表示)画出一幅比较完整
的环状染色体图(chromosome map)。这就是1955年由Wollman和Jacob创造的中断杂交法(int
errupted mating
experiment)的基本原理;同时原核微生物染色体的环状特性也是从这里开始认识的(图8-27)。据报道,,至1983年,在E.coli染色体上已定位的基因数已多达1，027个。
图8-27 Hfr菌株中F因子的整合、断裂和转移
a.环状F因子，在1与6位间可以裂开，它以箭头
所示方向转移入受体细胞；b.F因子在受体细胞
核染色体组的特定位点(met与thr间)配对；c.F
因子与受体核染色体组发生交叉而成环状；d.两
者整合，形成单环；e.在F因子的特定位点上发生
断裂，产生有一定方向和基因顺序的可进行转移的
线状染色体(注意在其末端的4、5、6基因表示在
F因子中与形成性菌毛和转移有关的基因)
----F′菌株--当Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离其染色体组时,可形成游离的但携带一小段(最多可携带三分之一段染色体组)染色体基因的F因子,特称F′因子。携带有F′因子的菌株,其性状介于F+与Hfr之间,这就是初生F′菌株。通过初生F′菌株与F-菌株的接合,就可以使后者转变成F′菌株,这就是次生F′菌株,它即获得了F因子,又获得了来自初生F′菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式称为F因子转导(F-duction)、性导(s
exduction)或F因子媒介的转导(F-mediated
transduction)。这时,受体菌的染色体和由F′因子所携带来的细菌基因间,通过同源染色体区(即双倍体区)的交换,实现了重组。在次生
的F′群体中,大约有10%F′因子重新整合到染色体组上,而恢复成Hfr菌,故该群体显示出来的特征介子F+和Hfr供体菌之间。
----2.真核微生物的基因重组
----有性杂交--杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交,一般
指性细胞间的接合和随之发生染色体重组,并产生新遗传型后代的一种方式。凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌,原则上都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。现以工业上常用的酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)为例来加以说明。
图8-28 酿酒酵母的生活史
----酿酒酵母有其完整的生活史(图8-28)。从自然界中分离到的,或在工业生产中应用的酵母,一般都是它们的双倍体细胞。将不同生产性状的甲、乙两个亲本(双倍体),分别接种到产孢子培养基(醋酸钠培养基等)斜面上,使其产生子
囊,经过减数分裂后,在每个子囊内会形成4个子囊孢子(单倍体)。用蒸馏水洗下子囊,经机械法(加硅藻土和石蜡油,在匀浆管中研磨)或酶法(如用蜗牛酶处理)破环子囊,再经离心,然后用获得的子囊孢子涂布平板,就可以得到单倍体菌落。把两个亲体的不同性别(如图8-28中的“+”和
“-”)的单倍体细胞密集在一起就有更多机会出现双倍体的杂交后代。它们的双倍体细胞和单倍体细胞有很大不同,易于识别(表8-4)。有了各种双倍体的杂交子代后,就可以进一步从中筛选出优良性状的个体。
表8-4 S.cerevisiae的双倍体和单倍体细胞的比较
在产孢培养基上
大,形态均一
繁殖较快,细胞较分散
小,形态变化较多
繁殖较慢,细胞常聚集成团
不形成子囊
----生产实践中利用有性杂交培育优良品种的例子很多。例如,用于酒精发酵的酵母和用于面包发酵的酵母虽属同一种酿酒酵母,
但两者是不同的菌株
,表现在前者产酒精率高而对麦芽糖和葡萄糖的发酵力弱,后者则产酒精率低而对麦芽糖和葡萄糖的发酵力强。两者通过
杂交,就得到了既能生产酒精,又能将其残余的菌体综合利用作为面包厂和家用发面酵母的优良菌种。
----准性生殖--是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式。它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后,不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。准性生殖常见于某些真菌,尤其是半知菌中,其主要过程见图8-29。
图8-29 半知菌的准性生殖示意图
----菌丝联结(anastomosis)--它发生于一些形态上没有区别,但在遗传性上有差别的两个同种亲本的体细胞(单倍体)间。发生菌丝联结的频率很低。
----形成异核体(heterocaryon)--两个体细胞经联结后,使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中,形成双相异核体。异核体能独立生活。----
----核融合(nuclear
fusion)或核配(caryogamy)--在异核体中的双核偶尔可以发生核融合,产生双倍体杂合子核。如构巢曲霉(Aspergillus
nidulans)和米曲霉(Aspergillus oryzae)核融合的频率为10-5～10-7 。某些理
化因素如樟脑蒸汽、紫外线或高温等的处理,可以提高核融合的频率。
----体细胞交换(somatic
crossing-over)和单倍体化--体细胞交换即体细胞中染色体的交换,也称有丝分裂交换(mitotic
crossingover)。双倍体杂合子性状极不稳定,在其进行有丝分裂过程中,其中极少数核中的染色体会发生交换和单倍体化,从而形成了极个别具有新性
状的单倍体杂合子。如对双倍体杂合子用紫外线、γ射线等进行处理,就会促进染色体断裂
、畸变或导致染色体在两个子细胞中分配不均,因而有可能产生各种不同性状组合的单倍体杂合子。从表8―5中,可以看出准性生殖与有性生殖间的主要区别。
表8―5 准性生殖和有性生殖的比较
准 性 生 殖
有 性 生 殖
参与接合的亲本细胞
独立生活的异核体阶段
接合后双倍体的细胞形态
双倍体变为单倍体的途径
接合发生的几率
形态相同的体细胞
与单倍体基本相同
通过有丝分裂
偶然发现,几率低
形态或生理上有分化的性细胞
与单倍体明显不同
通过减数分裂
正常出现,几率高
----准性生殖对一些没有有性过程但有重要生产价值的半知菌育种工作来说,提供了重要的手段。国内在灰黄霉素生产菌――荨青霉(Penicillium
urticae)的育种中,曾用准性杂交的方法取得了较大的成效,其主
要步骤(图8―30)为：①选择亲本:即选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作杂交亲本。由于在荨青霉等不产生有性孢子的霉菌中,只有极个别的细胞间才发生联结,且联结后的细胞在形态上无显著的特征可找,因此,必须供助于营养缺陷型来作为杂交亲本(例如在图8―31中的A-B+与A+B-
②强制异合:即强制形成异核体。将A-B+和A+B-菌株所产生的分生孢子(约106～
107)混合,用基本培养基［-］倒培养皿,同时对单一亲本的分生孢子分别倒［-］培养皿。
经培养后,要求前者只出现几十个菌落,而后者却不长菌落。这时,出现在前者上的便是由A
-B+和A+B-体细胞联结所形成的异核体或杂合二倍体菌落;
③转移单菌落:将培养皿上长出的这种单菌落移种到基本培养基的斜面上;④检验稳定性:检验新菌株是不稳定的异核体还是稳定的杂合二倍体。先把斜面菌株的孢子洗下,用基本培养基倒夹层平板,经培养后,加上一层完全培养基［+］。如果在基本培养基上不
出现或出现少数菌落,而当加上完全培养基后却出现大量菌落,那么,这便是下不稳定的菌株
―异核体(如图8―30中的Ⅱ)。如果在基本培养基上出现多数菌落,而加上完全培养基后。菌落数并无显著增加,那么,这就是一个稳定菌株――杂合二倍体(如图8―30中的Ⅰ)。在具体工作中,发现多数菌株属于不稳定的异核体；
⑤促进变异:把稳定菌株产生的分生孢子用紫外线、γ射线或氮芥等理化因子进行处理,
以促进其发生染色体交换、染色体在子细胞中分配不均、染色体缺失或畸变以及点突变等,
从而使分离后的杂交子代(单倍体杂合子)增加新性状的可能性。
图8-30Penicillum urticae的准性杂交步骤
----在上述工作的基础上,再经过一系列生产性状的测定,就可能筛选到比较理想的菌种。
X射线+紫外线
氮芥(0.1%)
氮芥+紫外线
紫外线+γ射线
金色链霉菌
二乙烯三胺
硫酸二乙酯
二乙稀三胺+紫外线
硫酸二乙酯+紫外线
灰色链霉菌
紫外线+可见光照射1次
紫外线+可见光照射6次
二、原生质体融合育种
----1.原生质体融合技术的发展
----原生质体(protoplast)一词最初是由Hanstein用来表示植物细胞壁内的原生质。1952年，Salton用它来表示动植物和微生物细胞去除细胞壁以后的一种细胞结构。1953年，Weibull等人首先用溶菌酶溶解细胞壁获得了原生质体。1958年，Brenner等人提出了细菌原生质体的
3条标准，即没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感。按照同样的标准，Eddy、Emerson、Bachmann等人用蜗牛酶配合其它条件分别从酵母菌或丝状真菌中释放出原生质体。Douglas首先用溶菌酶从链霉菌菌丝中制备出原生质体，并用噬菌体吸附及血清学
试验证明细胞壁确实溶解。日本的岗西等人对链霉菌原生质体的形成和再生的条件进行了系统的研究，其结果至今仍为不少实验室所引用。Landman等人以及Wyrick和Rogers对枯草杆菌的原生质体的形成和再生进行了研究。所有这一切，都为原生质体融合技术的创立提供了必要的条件准备。
----膜的融合是生物界中的普遍现象，如受精、胞饮、肌纤维的形成等均涉及到膜的融合。在1954年，Stahelin就曾用连续照像追踪了炭疽杆菌的原生质体融合。1985年，日本的冈田善雄发
现灭活的仙台病毒可以诱发细胞融合，从而奠定了细胞融合的技术基础。目前普遍采用的化学融合方法是在1974年才建立起来的，当时，高国楠发现聚乙二醇(PEG)在Ca2+存在下能促使植物原生质体融合，并显著提高融合频率。接着，PEG的促融作用很快在微生物中得到证实，成功地实现了酵母菌、霉菌、放线菌和细菌等多种微生物在株内、株间、种间以及属间的融合，从而使原生质体融合技术在微生物方面形成了一个系统的实验体系。目前，原生质体融合已成为微生物遗传育种的一种新工具。
----2.原生质体融合育种的特点
----原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。原生质体融合技术具有7个方面的优点：
----杂交频率较高--由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又
加入了融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。已知霉菌与放线菌的融合频率为10-3～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10-3～10-6。
----受接合型或致育性的限制较小--由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体
的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制
----重组体种类较多--由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换
，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
----遗传物质的传递更为完整--由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的
交换更为完整。原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起
的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或
稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
----可获得性状优良的重组体--与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。例如，唐
氵尺昌彦等将氨基酸生产菌AJ3 419(AECr+ile-)与Bl-4(AHVr+l
ys-)的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AECr+AHVr+ile-+lys-)，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1倍。
----可提高育种效率--采用温度、药物或紫外线照射等处理纯化一方亲株的原生体，然后再与另一亲株的活原
生质体融合，因此就可以在筛选中除去一方亲株，从而提高筛选效率。
----可采用产量性状较高的菌株作为融合亲株--由于遗传标记如缺陷型往往影响工业微生物的某些生物合成能力，而进行一般基因重组时又
必须采用较多的遗传标记，因此势必使出发菌株的生产性能下降而影响杂交子代的生产水平。但由于原生质体融合频率较高，所以可以采用较少标记或不带标记的菌株进行融合，这对改良生产菌株性能更为有效。
除此以外，原生质体融合技术还具有存在着两株以上亲株同时参与融合以形成融合子的可能，以及提高菌株产量潜力机率较大等特点。因此，利用原生质体融合选育新菌株已受到国内外的普遍重视。
----3.原生质体融合育种的步骤
----原生质体融合育种一般包括如下步骤：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备；③原生质体的再生；④原生质体的融合；⑤融合子的选择；⑥实用性菌株的筛选。原生质体融合的基本过程如图8―33所示。
图8―33 原生质体融合基本过程示意图
----标记菌株的筛选--在原生质体融合的过程中，通常所用的亲株均要有一定的遗传标记以便于筛选。当然，所需的目的基因并不一定与标记基因连锁，但它毕竟可以大大减少工作量，提高育种效率。融合亲株获得遗传标记的方法可采用常规的诱变育种方法，一般可以以营养缺陷和抗药性等遗传性状为标记。在此必须注意的是标记必须稳定。采用抗药性菌株时，抗药性除可以作为标记外，在实验
中还可以排除杂菌污染的干扰。至于标记的数量，Schaeffer指出，每个亲株都各带有两个隐性性状的营养缺陷标记就可以排除以后实验结果中获得的原养型融合子是回复突变的可能。所以选择性标记也无须过多。如果已知融合频率较高，为了减少标记对菌株正常代谢的干扰，也可以采用仅有一个标记的菌株作为融合亲本。当然，最好选择对菌株生产性能没有影响的标记。特别是对于工业生产菌来说，用诱变方法获得标记，往往对该菌株的生产性能影响甚大。因此，在选择标记时，尽可能采用该菌株自身已带的各种遗传标记。
----原生质体的制备--获得有活力和去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种技术的先决条件。在细菌和放线菌中制备原生质体主要采用溶菌酶；在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维素
酶。影响原生质体制备的因素有许多，主要有以下几个方面。
----菌体的前处理--为了使酶的作用效果更好，可对菌体作一些前处理。例如，可在细菌中加入EDTA、甘氨酸、青霉素和D-环丝氨酸等；在放线菌的培养液中加入1%～4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入ED
TA和巯基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入2-脱氧葡萄糖等。加入这些物质的目的，就是使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。以细菌为例，甘氨酸可以使细胞壁肽聚糖中的L-丙氨酸和D-
丙氨酸残基为甘氨酸所取代，结果干扰了正常的交叉键合。青霉素能干扰甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D-丙氨酸之间的联结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的细胞壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。环丝氨酸的结构与D-丙氨酸相似，可竟争性抑制丙氨酸消旋酶的作用，使L-丙氨酸不能转变为D-丙氨酸，结果细菌就不能合成N-乙酰胞壁酸五肽，细胞壁难以形成。
----菌体培养时间--为了使菌体细胞易于原生质化，一般选择对数生长期的菌体。这时的细胞正在生长，代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。此时的原生质体形成率高，再生率亦很高。一般地说，对于细菌采用对数生长后期为好，对于放线菌，Baltz建议采用对数生长期到平衡期之间的转换期最为合适。
----酶浓度--对于不同种属的微生物来说，不仅对酶的种类要求不同，就是酶的浓度也有差异。一般地说
，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。由于影响原生质体形成和再生的因素相互有关，若原生质体形成率很高而再生率很低，对于原生质体融合育种来说不大适合。因此，有人建议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度。
----酶解温度--温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度的提高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度的增加，酶蛋白逐渐变性而使酶失活。因此，最适温度是这两种效应的共同结果。另外
，人们发现酶解温度对原生质体的再生影响甚大。因此，在选择最佳酶解温度时，除了要考虑酶的最适温度外，还要以原生质体再生率加以校正。一般地说，酶解温度应控制在20～40
----酶解时间--随着酶解时间的延长，菌体去壁程度愈完全，表现为原生质体形成率逐渐上升。当酶解达到一定时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成大量原生质体破裂，从而使原生质体失活，表现为原生质体再生率急剧降低。即原生质体的质量与酶解时间密切相关。酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体的再生率降低，最终亦不利于原生质体融合。因此，必须选择合适的酶解时间。
----渗透压稳定剂--渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，而且还有助于酶和底物的结合。渗透压稳定剂多采用KCl、NaCl等无机物和甘露醇、山梨醇、蔗糖、丁二酸钠等有机物。菌株不同，最佳稳定剂亦有差异。在细菌中多用蔗糖、丁二酸钠、NaCl等，在酵母菌
中多用山梨醇、甘露醇等，在霉菌中多用KCl和NaCl等。稳定剂的使用浓度一般均在0.3～0. 8mol/L之间。
----除此以外，破壁时的pH值、培养基成分、培养方式、离子强度和种类等对原生质体的形成亦有一定的影响。
----细胞壁溶解后，原生质体即以球状体的形态开始释放。杆状细菌的原生质体释放一般是从杆菌的一端进行的，棒状杆菌八字型排列细胞的原生质体释放是从棒状杆菌裂殖断裂一
端开始。由于原生质体比菌体细胞对渗透压更为敏感，所以在蒸馏水这样的低渗溶液中即可立即破裂，在一般培养基平板中也无法形成菌落。根据这一原理，原生质体形成率可按下式进行计算：
------------破壁前菌数-剩余菌数
原生质体形成率=-----------------------×100%
-------------破壁前菌数
----原生质体的再生--酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂，这是原生质体融合育种的必要条件。由于原生质体已经失去了坚韧的外层细胞壁，仅有一层100厚的细胞质膜，是失去了原有细胞形态的球状体。因此，尽管具有生物活性，但它毕竟不是一种正常的细胞，在普通培养基平板上也不能正常地生长、繁殖。为此，必须想办法使其细胞壁再生出来，以恢复细胞原有形态和功能。
----由于仅有细胞质膜的原生质体对渗透压很敏感，很容易破裂致使原生质外流而使细胞死亡，所以，再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中加入具有一定渗透压的基质即渗透压稳定剂，这与原生质体制备一样。对于不同的微生物来说，其原生质体的高渗再生培养基的主要成分是不同的。表8-7列出了几种常用的微生物再生培养基中的主要成分。
表8-7 几种常用的微生物再生培养基成分
微生物种类
再生培养基成分
钝齿棒杆菌
弗氏链霉菌
0.5mol/L，顺丁烯二酸0.02mol/L，MgCl2?6H2O0.02mol/L
丁二酸钠 135g，MgCl2?6H2O2g,EDTA 1.9g
蔗糖 12.5%，CaCl2?2H2O 0.368%，MgCl2?6H2O 0.51%
蔗糖 0.3～0.5mol/L(或琥珀酸钠0.55mol/L)，MgCl2?6H2O0.05mol
/L，CaCl2?2H2O 0.025mol/L
KCl0.4～0.8mol/L，NaCl0.3～1.0mol/L
多种糖及糖醇
----原生质体的再生是一个十分复杂的过程，至今了解不多。据一些学者研究认为
，若原生质体的 细胞壁剥离不彻底，则有助于细胞壁的再生。残留的细胞壁尤如结晶时的“晶种”一
样。大量实验亦证明，破壁太彻底往往会引起原生质体再生率的大大降低。影响原生质体再
生的因素主要有菌种本身的再生特性、原生质体制备条件、再生培养基成分及再生培养条件等。
----一般在进行融合实验前首先要对原生质体再生率进行测定，否则就很难确定不能融合或融合
频率低的原因是由于双亲原生质体本身没有活性或再生率很低，还是由于融合条件不适合所致。
因此，测定原生质体形成率和再生率不仅可作为检查、改善原生质体形成和再生条件的指标
，而且也是分析融合实验结果、改善融合条件的一个重要指标。原生质体再生率可用下式进行计算：
----------------------再生菌数-剩余菌数
----原生质体再生率=--------------------→×100%
----------------------破壁前菌数-剩余菌数
----一般地说，原生质体再生率通常在百分之零点几到百分几十，有的甚至可达100%。
----原生质体的融合
--仅仅将原生质体等量地混合在一起，融合频率仍然很低，只有加入表面活性剂聚乙二醇(PEG)，融合频率才会出现突破性的提高。融合促进剂PEG具有强制性地促进原生质体融合的作用
，其分子量有多种，从1，000到12，000，但在微生物原生质体融合时多用分子量为1，000至6，000的PEG，特别是4，000和6，000两种。在原生质体融合过程中，除了要加入PEG外，还要加入C
a2+、Mg2+等阳离子，它们对融合亦有促进作用。
----PEG诱导融合的机制
--君家德郎认为，PEG可以使原生质体的膜电位下降，然后，原生质体通过Ca2+离子交联而促进凝集。另外，由于PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质胶粒的流动性，从而促进了原生质体的相互融合。人们通过对植物原生质体融合的研究发现，融合的程序开始是由于强烈脱水而引起原生质体的粘合，不同程度地形成聚集场，原生质体收缩并高度变形，大量粘着的原生质体
形成非常紧密的接触。接着，接触处的膜间蛋白颗粒发生转位和聚集，然后邻近的脂质分子发生相互反应。由于Ca2+等强烈地促进脂质分子的扰动和重新组合，结果使接触处的膜形成小区域的融合，产生小的原生质桥。原生质桥逐渐增大，直至两个原生质体融合。
----影响原生质体融合的因素
--主要有融合剂的浓度、作用时间、阳离子浓 度及pH值等，
更为重要的是亲株本身特性的选择以及原生质体的活力。据报导，PEG的分
子量以为好，由于PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率。因此，融合时PEG的
最终 浓度常采用30%～40%。由于PEG一加入，原生质体间的粘着即强烈地发生，融合就能较长时
间有效地进行，所以PEG的处理时间不需太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也要求融合
时间不宜过长。阳离子浓度对融合频率亦有很大的影响。已知融合时Ca2+离子的浓度
以0.01mol/L为最佳，而K+、Na+离子会降低融合频率。这是因为K+、Na+可优先结合到质膜上，从而降低了Ca2+离子的刺激作用。关于融合时的pH值，人们发现在有
Ca2+存在的条件下，pH为碱性条件能刺激产生最大的融合频率。这是因为，融合时的
pH能够改变体系的电性状态，进而影响原生质体的融合。
----Hopwood指出，若采取先用紫外线照射原生质体再进行融合，则可以大大增加融合频率(表8-
紫外线照射对原生质体融合频率的影响
所 用 菌 株
融合频率(%)
----未 照 射---------------照
天蓝链霉菌 S.coelicolor
弗氏链霉菌 S.fradiae
灰褐链霉菌 S.griseofuscus
委内瑞拉链霉菌 S.venezuelae
----融合子的选择--按照Schaeffer的观点，有两个遗传标记互补就可以确定其为融合子。因此，就可以通过选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体
。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定。
----为了提高融合子中基因重组的频率，可以将PEG处理的原生质体悬液直接培养于高渗选择培养基上，而不采用先培养于高渗培养基上然后再转接到选择培养基上的方法。这是因为，若早期就在完全培养基上再生，二倍体细胞于两条染色体复制之前就会发生分裂，结果重组机率下降。因此，为了获得较多的重组体，有些学者建议选择性地调节重组体再生的环境，可以稳定杂核子的形成和增加下一步的遗传重组能力。
----实用性菌株的筛选--微生物原生质体融合是一种新的基因重组技术，它具有定向育种的含义。但是，融合所产生的融合子类型仍然是各种各样的，性能和产量不同的情况仍然存在。例如，丁友日方等以纯齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866为亲株进行原生质体融合，对所获得的融合子进行了初筛，结果如表8-9所示。
表8-9 融合子初筛结果
谷氨酸产率(g/dl)
谷氨酌情产(g/dl)
TG-866(亲株)
----由表8-9可见，在所获得的融合子中，有的根本不产生谷氨酸，如F5、F38、F220等；有的虽积累谷氨酸，但其产酸率很低，如F12、F268、F300等；有的谷氨酸产率介于两亲株之间，如F70；有的谷氨酸产率较两亲株都高，如F263、F288等。因此，人为定向筛选融合子是整个原生质体融合育种的重要环节。
----4.原生质体融合育种的应用
----随着原生质体融合育种技术的发展，育种成果不断涌现。丁友日方等以球形芽孢杆菌TS-1和苏云金芽孢杆(Bacillusthuringiensis)H4为亲株(前者对淡
色库蚊有高毒力，后者对粘虫及玉米螟等有高毒力)，在2～3mg/ml溶菌酶浓度下，42℃酶解45min，获得了原生质体。其原生质体形成率和再生率分别为91.02%、37.6%及93.3%、31.2%。然后将获得的原生质体以1∶1比例混合，加入40%的PEG于42℃保温5min。结果获得了既
杀双翅目又杀鳞翅目幼虫的融合子。日本的唐氵尺昌彦等 将赖氨酸生产菌AJ11082与谷氨酸生产菌A
J11638进行融合，从融合子中选育出生长最快的AJ11794和AJ11793，该融合子在积累等量赖
氨酸(5.28g/dl)的情况下，其培养时间(31.5h)不到亲株(72h)的1/2。
----在链霉菌原生质体融合育种方面，邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新霉素产生菌的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产生原养型重组体的频率为10-4。其中58%产生巴龙霉素，并从中获得了巴龙霉素产量比原始菌株(300μg/ml)提高5～6倍的融合子。杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株进行融合，以自身抗
菌素抗性为标记选择种间融合子，从中获得了一株正定霉素产量较亲株提高了2.5倍的融合子。古巴的Valin等以土霉素产生菌龟裂链霉菌为亲株进行种内融合，结果大多数融合子产生土霉素的效价均超过了100μg/ml，比亲株提高了4～5倍。
----在真菌原生质体融合育种方面，蔡金科等以酒精酵母和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces
lactis)为亲株进行属间融合，获得了在以乳糖为碳源的培养基中乙醇产率较亲株提高了2.5倍的融合子。焦瑞身等以产生D-氨基酸氧化酶的三角酵母(Trigonopsis
variabilis)为亲株进行种内融合，结果获得了D-氨基酸氧化酶的活力比亲株酶活力提高了2倍的融合子。Kirimura等以柠檬酸生产菌黑曲霉(Aspergillusniger)为亲株进行种内融合，获得了柠檬酸产量比亲株提高了1.2倍的融合了。由此可见，原生质体融合已成为微生物遗传育种的有效工具，必将为应用微生物工业带来勃勃生机。