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人肺癌细胞株中沉默MTA1基因可导致细胞体外侵袭能力的抑制及相关microRNA表达谱的改变
肺癌是一种常见的恶性肿瘤，肺癌的发病率在世界范围内呈上升趋势。随着人类生活环境的污染与破坏，人们的不良生活方式等各种因素，肺癌的高发病率与高死亡率已经成为关注的热点问题。尽管近来在诊断和治疗取得了进展，肺癌的预后仍然很差，其5年生存率一直在9％-14％左右，复发和转移是影响肺癌患者治疗效果和导致患者死亡的最主要原因。　　
肿瘤的转移是一个复杂的过程，目前的研究发现，肿瘤的转移是一个动态的过程，涉及到肿瘤细胞、机体、靶组织的相互影响和作用，涉及到一系列肿瘤侵袭转移相关基因的结构或/和功能的异常，最终导致肺癌转移。因此，探索研究新的基因功能与肺癌转移恶性特征的关系，对于提升肺癌进展相关分子机制的了解、设计合理的治疗药物及改善肺癌的临床预后非常关键。近年来，大量研究表明转录调节因子MTA家族蛋白对肿瘤转移有着重要影响。　　
MTA基因家族，最初是在鼠转移性乳腺癌中经cDNA库差异筛选技术发现而命名。目前的研究热点集中在MTA1基因上面。近五年来，MTA1在各种肿瘤发生发展中的重要性被广泛认知。MTA1具有可以抑制或激活肿瘤基因的双重作用，在肿瘤生物学上扮演重要角色。在人类肿瘤中有广泛的过表达，并且与肿瘤的转移和侵袭有密切的联系，但具体的机制并不清楚。对子宫内膜癌、胰腺肿瘤、喉癌等肿瘤组织的分析发现MTA1mRNA或MTA1蛋白的过度表达均与肿瘤侵袭和/或淋巴结转移正相关，且在乳腺癌、肝癌、食道癌中，MTA1表达亦与预后呈负相关。我们的前期研究发现，MTA1是一种重要的肺癌相关基因，其过表达具有促进癌细胞分裂增殖和侵袭迁移等功能，可能是肺癌细胞特征性行为表现的关键环节或本质原因之一。　　
microRNA是近年来发现的与基因表达调控相关的一类非编码小分子单链RNA，长度约21-22个碱基对构成，可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤进程中的多个环节，但迄今对microRNA参与肿瘤转移的机制尚未完全明确。大量研究显示同种microRNA在不同类型肿瘤中可通过作用于不同编码基因，经不同的信号通路发挥不同的作用。因此需要对特定microRNA在特定环境下的靶基因进行更多、更详尽的研究，为肿瘤的诊断和治疗开发特异性药物。　　
为此，本项目拟以体外培养的、来自同一细胞系(PLA-801)具有相同遗传背景的人肺癌高低转移株95D和95C为研究对象，采用生物信息学方法及MTA1基因转染或RNA干扰、microRNA过表达或抑制、靶基因表达检测、细胞功能分析等技术手段，结合肺癌临床组织样本分析，研究MTA1基因促进肺癌细胞侵袭转移的作用机理与其调节表达的microRNA之间的关系，旨在阐明MTA1促进肺癌细胞侵袭转移作用的分子靶点，阐明受MTA1调节表达的microRNA的功能。为进一步明确肺癌侵袭转移的分子机制，寻找潜在治疗靶点进行有益的探索。　　
研究目标：　　
研究MTA1基因促进肺癌细胞侵袭转移的作用机理与其调节表达的microRNA之间的关系，旨在阐明MTA1促进肺癌细胞侵袭转移作用的分子靶点，同时也阐明受MTA1调节表达的microRNA的功能，进一步明确肺癌转移的分子机制，寻找可能的抗肺癌转移治疗靶点。　　
方法：　　
1.慢病毒包装载体的构建　　
设计三段MTA1siRNA及非特异性干扰片段，采用TCTCTTGAA茎环结构，在5'端和3'端分别加上MluI和ClaI酶切位点，3'端加上TTTTT终止序列，设计合成其shRNA的DNAOligo寡核苷酸序列。设计合成的上游链和下游链退火形成寡核苷酸双链，将pLVTHM载体采用内切酶ClaI和MluI进行双酶切，获得粘性末端线性化片段，双酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳1.5h，胶回收方法获得线性化片段，用于后续连接反应。将目的片段回收纯化后，将回收的pLVTHM线性化片段与MTA1双链oligo进行连接反应，构建重组慢病毒干扰载体pLVTHM/shMTA1及pLVTHM/vector。从-70℃拿出分装好的Sta13大肠杆菌感受态(每管200μl)，冰上溶解，加入10μpLVTHM-shMTA1连接产物进行转化，将连接产物进行转化后，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种到5ml氨苄青霉素抗性的LB培养基中进行培养，对菌液进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性者送测序。　　
2.稳定沉默MTA1肺癌细胞株的构建　　
pLVTHM/shMTA1重组载体及非特异性、空白对照载体构建成功后，中量提取质粒，并进行慢病毒包装、测定病毒滴度。将含有MTA1-shRNA的慢病毒(pLVTHM/shMTA1)和非特异性干扰片段pLVTHM/vector的慢病毒及空载对照慢病毒(pLVTHM)分别感染高表达MTA1的95D，次日去除含病毒的培养基，更换为完全培养基，感染72h后荧光显微镜下观察GFP的发光情况。由于载体pLVTHM只带有绿色荧光标记(GFP)而不带抗性标记，因而病毒感染后稳定细胞株的建立不能采用常规的抗生素筛选单克隆的方法。鉴于慢病毒感染效率较高，本研究依据GFP标记，对多克隆细胞进行96孔板有限稀释，进行单克隆细胞的挑选。选取稳定发光的单克隆细胞进行总RNA的提取，逆转录成cDNA，通过荧光定量PCR鉴定干扰后单克隆细胞中MTA1的表达。提取细胞蛋白质后，通过Westernblot鉴定干扰单克隆细胞中MTA1在蛋白水平的表达。通过这两个试验，观察MTA1的沉默效率。　　
3.CCK-8法检测MTA1沉默后对肺癌细胞生长特性的影响　　
1×103个指数生长期细胞接种于96孔板中，每孔细胞悬液量为200ul，置于培养箱中分别培养1、2、3、4、5、6、7天，每孔加入10ul的CCK-8溶液，将培养板置于培养箱中孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的OD值，以相对应OD值表示细胞增殖能力大小。每组设6个重复孔，取平均值，绘制体外生长曲线。　　
4.划痕实验　　
将95D/NC，95D/CTL-si，95D/MTA1-si1#3组细胞分别接种1×105个细胞于6孔板，每组细胞作3个重复孔，待细胞长至约90％汇合时，用200ul枪头垂直在培养孔中部轻轻划过，垂直和水平方向各交错划3条线，力度以划落细胞而不在培养板上留下痕迹为准。用PBS冲洗干净脱落的细胞，加入培养基后继续培养。每个孔随机选取9个有划痕穿过的视野，分别观察0h，12h，24h时3组细胞划痕处细胞的运动变化，并拍照取样，应用ImageJ软件测划痕相对宽度，绘制迁移力量值曲线，独立实验重复3次。　　
5.克隆形成试验　　
取95D/NC，95D/CTL-si，95D/MTA1-si1#3组细胞对数期分别接种100个于六孔板中，每组细胞作3个重复孔，轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀，37℃、5％CO2培养箱中培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，PBS液洗3次后，置于室温中空气干燥;甲醇固定15min，弃甲醇后室温空气干燥;用苏木紫应用染液染色15min，流水缓慢洗去染液，室温空气干燥后显微镜下计数形成的克隆数(≥50个细胞为一个克隆)。实验重复3次。　　
平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100％　　
6.流式细胞术检测细胞周期　　
收取对数生长期的细胞，细胞密度约为1-10×105个/ml，按下述方法进行PI染色:收集细胞，用预冷的PBS离心(800pm，5min)，洗涤细胞两次，去除残留培养基;预冷的70％乙醇4℃固定过夜。用4°预冷的PBS离心(800rpm，5min)洗涤2次，加入400μlPBS重悬细胞，加入RNaseA至终浓度0.5mg/ml，碘化丙啶(PI，10μg/ml)染色30分钟;避光冰上放置15分钟，上机检测;经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取全部数据;全部实验重复3次。用单因素方差分析对三种细胞中各期细胞的比例进行统计学分析。　　
7.Transwell小室细胞迁移实验　　
本实验所用Transwell小室购自美国Corning公司，小室孔径为8.0μm。取对数期的生长细胞，PBS洗1-2遍，胰酶消化后吹打均匀，终止消化后离心弃去培养液，PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬，细胞计数，调整细胞密度至1-10×105，加200μl细胞悬液于内室，然后加500μl含10％胎牛血清的完全培养基于下室，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失，若出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板，37℃培养12h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，甲醇固定15min，弃甲醇后室温空气干燥，用苏木紫染液染色15min，用去离子水轻轻地冲洗数次，室温空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。重复3次。　　
8.Transwell小室体外侵袭实验　　
本实验所用Transwell小室购自美国Corning公司，小室孔径为8.0μm。实验用的人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原。铺设基底胶前将枪头，Transwell小室，等放于4°冰箱预冷后，用50mg/LMatrigel1:10稀释液均匀铺设在Transwell小室底部膜的上室面，置于37°培养箱中孵育1-2h，使基质胶凝固成膜后，吸出小室中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。取对数期的生长细胞，胰酶消化后吹打均匀，制成单细胞悬液，用无血清培养基洗涤细胞2次，细胞计数，调整细胞浓度为(1～2)×105/ml。加200μl细胞悬液于内室，然后加500μl含10％胎牛血清的完全培养基于下室，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失，若出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板，37℃培养12h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，甲醇固定15min，弃甲醇后室温空气干燥，用苏木紫染液染色15min，用去离子水轻轻地冲洗数次，室温空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。重复3次。　　
统计学分析：　　
采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，结果用平均数±标准差((x)±s)表示。运用One-WAYANOVA进行统计分析，组间的多重比较方差齐用LSD进行多重比较，方差不齐用Dunnett'sT3进行多重比较;细胞体外生长实验采用析因设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。　　
结果：　　
1.成功构建了重组慢病毒干扰载体pLVTHM/shMTA1，非特异片段干扰慢病毒载pLVTHM/vector，空白对照慢病毒载体(pLVTHM)，并成功转入高表达MTA1的人肺癌95D细胞中，构建了干扰效率较高的稳定沉默MTA1的人肺癌细胞株、非特异性干扰及空白对照细胞株。　　
2.沉默MTA1基因后，人肺癌细胞95D的体外增殖能力没有明显变化，而细胞的迁移及侵袭能力有明显的降低。稳定沉默MTA1的细胞株95D/MTA1-si1#的体外增殖能力与空白对照95/NC及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si相比没有显著差异(F=3.064，P=0.057)，且细胞组别与天数之间无交互效应(F=1.172，P=0.334)，说明MTA1基因沉默后细胞增殖能力未有明显改变，三组细胞增殖速度随时间变化趋势相同。平板克隆形成实验显示MTA1基因沉默后细胞的克隆形成能力未有明显改变(F=3.085，P=0.095)。细胞周期试验显示，MTA1沉默后的肺癌细胞95D/MTA1-si1#与空白对照细胞株95/NC，及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si相比，G0/G1(F=0.998,P=0.423);G2/M期(F=0.998,P=0.315)期;S(F=3.778，P=0.087)期比例改变无统计学意义。在细胞划痕实验中，随着培养时间的延长，MTA1沉默后的肺癌细胞95D/MTA1-si1#迁移距离明显小于空白对照组及非特异性干扰组细胞(F=139.429，P＜0.01)，析因设计的方差分析结果显示，细胞组间与时间之间存在交互效应(F=20.703，P＜0.01)，说明随着时间的变化，两组细胞体外迁移距离的变化趋势不同，MTA1沉默后95D细胞的迁移能力有所减弱。Transwell小室检测细胞体外迁移能力的变化，结果显示，MTA1稳定沉默后的细胞株95D/MTA1-si1#的迁移能力明显弱于空白对照细胞株95/NC，及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si(F=333.902，P＜0.01)。Transwell小室分析细胞体外侵袭能力的变化，结果发现，与空白对照细胞株95/NC，及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si相比，MTA1稳定沉默后的细胞株95D/MTA1-si1#穿过基质胶的细胞数显著减少，其体外侵袭能力显著降低(F=173.561，P＜0.01)。综合以上结果表明，沉默MTA1基因抑制了肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力，但对细胞的增殖能力没有明显影响，亦并未导致细胞周期的改变。进一步验证了MTA1在肺癌中的生物学功能。　　
3.沉默MTA1基因后，用基因芯片检测到肺癌细胞40种microRNA的表达谱发生改变，其中6种microRNA的表达差异倍数＞2，分别是分别是miR103、miR125b、miR194、miR210、miR500、miR744。其中，MTA1基因沉默后，表细胞株中miR125b、miR194的表达量显著上升，miR210、miR500、miR103的表达量显著降低，miR-744的表达量没有明显改变。　　
1.MTA1基因干扰后，对肺癌细胞95D的体外增殖能力没有明显影响。　　
2.MTA1基因干扰后，肺癌细胞95D的体外迁移和侵袭能力有显著降低。　　
3.MTA1基因干扰后，肺癌细胞95D的体外迁移和侵袭能力有显著降低。　　
4.在分别稳定转染了MTA1干扰载体，非特异性干扰载体和空载体的人肺癌细胞中用基因芯片检测了发现了40种microRNA的表达谱发生改变，其中6种microRNA的表达差异倍数＞2，分别是分别是miR103、miR125b、miR194、miR210、miR500、miR744.　　
5.经过Real-timePCR验证，MTA1基因沉默后，细胞株中miR125b、miR194的表达量显著上升，miR210、miR500、miR103的表达量显著降低，miR-744的表达量没有明显改变。
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谢金玲, 赵川, 李俊萱, 韦燕飞. 白花丹醌对人肝癌细胞HepG2侵袭和凋亡的影响[J]. 中国药理学通报, ): 687-691
XIE Jin-ling, ZHAO Chuan, LI Jun-xuan, WEI Yan-fei. Effect of plumbagin on invasion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, ): 687-691.
白花丹醌对人肝癌细胞HepG2侵袭和凋亡的影响
谢金玲, 赵川, 李俊萱, 韦燕飞
广西中医药大学基础医学院生理教研室,广西 南宁 530001
基金项目: 国家自然科学基金地区项目(No )； 广西自然科学基金面上项目(No 2013GXNSFAA019154)；广西高等学校优秀中青年骨干教师培养工程资助项目.
作者简介: 谢金玲(1990-)，女，硕士生，研究方向：生化药理学，E-mail:
韦燕飞(1976-)，女，博士，教授，研究方向：中医药防治肝脏疾病基础,通讯作者，E-mail:
摘要: 目的 探讨白花丹醌对人肝癌HepG2细胞侵袭和凋亡的影响。方法 人肝癌HepG2细胞进行体外培养，经不同浓度的白花丹醌处理后，MTT法检测细胞的增殖抑制作用；Transwell细胞体外侵袭实验观察细胞的侵袭能力；流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况；免疫组化法检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白的表达水平。结果 MTT结果显示，与对照组比较，白花丹醌干预组抑制HepG2细胞增殖，并呈剂量-效应关系(P<0.05)；Transwell细胞体外侵袭实验显示，随白花丹醌用药浓度的递增，细胞侵袭能力明显下降，尤其以4、8 μmol·L-1明显(P<0.01)；流式细胞术结果显示，白花丹醌作用HepG2细胞48 h，4、8 μmol·L-1组细胞凋亡率均明显高于对照组；免疫组化显示，随着白花丹醌浓度增加，Bax蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱，并呈剂量依赖性(P<0.01)。结论 白花丹醌能够抑制HepG2细胞增殖，促进HepG2细胞凋亡，同时具有抑制HepG2细胞侵袭的能力。
白花丹醌&&&&人肝癌细胞HepG2&&&&增殖&&&&侵袭&&&&细胞凋亡&&&&Bax&&&&Bcl-2&&&&
Effect of plumbagin on invasion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2
XIE Jin-ling, ZHAO Chuan, LI Jun-xuan, WEI Yan-fei
Dept of Phsiology,Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning,Guangxi 530001,China
Abstract: Aim To investigate the effect of plumbagin on invasion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma(HepG2).Methods HepG2 cells were cultured in vitro with different concentrations of plumbagin, then cell proliferation was observed by MTT cell invasion was observed by tran cell apoptosis was detected by flow cytometry, and the protein expression of Bax, Bcl- 2 was detected by immunocytochemistry.Results MTT results showed that plumbagin could significantly inhibit cell proliferation compared with the control group, and in a dose-dependent manner (P<0.05). Transwell invasion assay showed that cell invasion was significantly decreased with increasing concentrations of plumbagin(P<0.01). Flow cytometry showed that apoptosis rate was significantly higher in 4, 8 μmol·L-1 group of plumbagin compared with that of the control group(P<0.01). Immunocytochemistry showed that, with the increasing concentration of plumbagin, Bax protein expression increased, Bcl-2 protein expression was decreased, both
in a dose-dependent manner (P<0.01). Conclusion Plumbagin can inhibit HepG2 cell proliferation and accelerate apoptosis of HepG2 cells, but also has the ability to inhibit HepG2 cell invasion.
Key words: plumbagin&&&&human hepatocellular carcinoma cells HepG2&&&&cell proliferation&&&&invasion&&&&cell apoptosis&&&&Bax&&&&Bcl-2&&&&
近年来研究表明，白花丹的主要活性成分白花丹醌(plumbagin)具有明显的抗肝纤维化作用[, , ]，其抗肿瘤也被临床实践所验证，是一种很有潜力且十分具有应用前景的抗肿瘤天然药物，对人乳腺癌细胞侵袭和迁移有较好的抑制作用[]，能够诱导人肺癌细胞发生凋亡和自噬作用[]。白花丹醌对人肝癌细胞HepG2的增殖有抑制作用[]，但其抗肝癌的具体机制未明，目前报道很少。本实验以人肝癌细胞株(HepG2)为研究对象，采用MTT法检测白花丹醌对HepG2细胞增殖的影响，Transwell细胞体外侵袭实验观察HepG2细胞的侵袭能力，应用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的情况，免疫组化检测白花丹醌对HepG2细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响，探讨白花丹醌抗肝癌的可能机制。
材料与仪器
人肝癌细胞HepG2，购自南京凯基生物科技发展有限公司。
药物与试剂
白花丹醌(批号：SLBG3436V)购自Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，制备成0.1 mol·L-1的白花丹醌溶液，置于4 ℃避光保存，用时稀释成不同浓度的工作液，DMSO在各组工作液的总浓度均低于0.1%；高糖DMEM培养基购自Hyclone公司，新生牛血清购自四季青公司；MTT试剂盒，购自Vazyme公司；鼠抗人Bax、Bcl-2单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自Santa Cruz 公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自美国BD公司。
细胞培养箱(Sanyo MCO-18AIC，日本)；高速离心机(Thermo Fisher Sorvall ST 16R，美国)；酶标仪(Epoch Biotek，美国)；电热恒温培养箱(DNP-9162，中国)；光学显微镜(Olympus BX53，日本)；倒置生物显微镜(Leica DM2500，德国)；流式细胞仪(BD LSRFortessa，美国)。
人肝癌细胞HepG2，在37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下，于10%新生牛血清的高糖DMEM培养液中培养，观察细胞生长情况，每2~3 d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。
MTT细胞增殖抑制实验
取对数生长期的人肝癌细胞HepG2细胞进行细胞计数，调整细胞浓度为4×107·L-1，以每孔100 μL接种于96孔培养板中，设置空白孔(无细胞)、对照孔(培养基不加药，有细胞)、实验孔(不同浓度的白花丹醌干预)，每组设定5个复孔。细胞常规培养24 h后完全贴壁，去除孔中培养液，分别加入1、2、4、8 μmol·L-1 的白花丹醌工作液。干预24、48 h后，每孔加入10 μL MTT (5 g·L-1)，孵育4 h，小心吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO，微型混合器上水平震荡5 min后于酶标仪上测定570 nm处的OD值。按下列公式计算不同浓度白花丹醌对HepG2细胞的增殖抑制率：抑制率(IR)/%=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。根据不同浓度的白花丹醌对细胞增殖的能力，选择最佳作用时间(后续实验以此作为时间条件)。
Transwell体外侵袭实验观察细胞的侵袭能力
冰上将融化后的BD Matrigel用冰高糖DMEM稀释4倍，混匀，往预冷的Transwell板上室加稀释后的Matrigel，每孔50 μL，均匀铺平，并置于细胞培养箱中孵育3~4 h。消化已用无血清高糖DMEM饥饿20 h的HepG2细胞，并细胞计数，调整细胞浓度为4×108·L-1，离心弃上清液后，分别用100 μL 0.1% BSA的培养液配制的不同浓度的白花丹醌重悬细胞，加入Matrigel已成胶的Transwell上室中，下室加入600 μL 10%新生牛血清培养液，每组设3个复孔，置于培养箱中孵育。20 h后，取出Transwell板，移去培养液，PBS清洗Transwell小室2次，4%多聚甲醛固定20 min，无水甲醛透化20 min，0.1%结晶紫染色15 min，每步均用PBS清洗2次，用棉签轻轻拭去没有侵袭的细胞及基质胶，封片，倒置显微镜下随机取5个视野观察、拍照并细胞计数。
流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况
各白花丹醌用药组细胞严格按照凋亡检测试剂盒说明书进行操作。药物与细胞共孵育48 h后，细胞消化成单个细胞悬液，离心后完全培养基清洗细胞2次，进行Annexin V、PI联合标记，加入5 μL Annexin V，20 μL PI，混匀，以3 000 r·min-1离心5 min，洗涤后，加入500 μL完全培养基重悬细胞，随即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
免疫细胞化学检测Bax、Bcl-2蛋白水平
采用免疫组化SP法，将对数生长期的HepG2细胞接种于放有盖玻片的6孔板中，24 h待细胞贴壁生长后，白花丹醌分组干预。药物与细胞共孵育48 h后，取出盖玻片置于载玻片上，用4%多聚甲醛固定，3% H2O2消除内源性过氧化氢酶，正常血清封闭后分别加入鼠抗人Bax、Bcl-2单克隆抗体，4℃孵育过夜，随后加入生物素二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液，经DAB显示，脱水、封片，光学显微镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照。检测方法严格按照试剂盒说明书进行操作。Bax、Bcl-2表达阳性的细胞，光学显微镜下可观察到细胞的胞质内呈现特异性棕褐色，阳性表达率/%=(500个细胞内阳性细胞数/500个细胞数)×100%。
统计学处理
实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，各均数两两比较采用q检验。
白花丹醌对HepG2细胞增殖的影响
采用不同浓度白花丹醌干预不同时间(24、48 h)后，MTT分析(Fig1)发现，各浓度白花丹醌干预24 h对HepG2细胞的增殖无明显抑制作用(P>0.05)，而干预48 h，白花丹醌呈剂量依赖性抑制HepG2细胞的增殖，以8 μmol·L-1浓度最为明显，与对照组比较差异最具明显(P<0.01)，后续实验采用48 h干预时间。
Effect of plumbagin on proliferation of HepG2 cells(x±s,n=5)
*P<0.05,**P<0.01 vs control group
白花丹醌对HepG2细胞侵袭能力的影响
Transwell侵袭实验显示，白花丹醌干预HepG2细胞后，细胞侵袭能力明显减弱，白花丹醌4,8 μmol·L-1尤其明显(P<0.01，Fig2，Tab1)。
The microscopic images of invasion amount of HepG2 cells at different concentrations of plumbagin(×200)
A:CB:Plumbagin 1 μmol·L-1C:Plumbagin 2 μmol·L-1D:Plumbagin 4 μmol·L-1E:Plumbagin 8 μmol·L-1 group
Effect of plumbagin on invasion ability of HepG2 cells(x±s,n=5)
GroupInvasion
amountInvasion
Control194.00±6.000/
Plumbagin 1 μmol·L-1180.00±8.185*92.78
Plumbagin 2 μmol·L-1175.00±5.000*90.21
Plumbagin 4 μmol·L-181.00±4.583**41.75
Plumbagin 8 μmol·L-145.67±2.517**23.19 *P<0.05,**P<0.01 vs control group
流式细胞仪Annexin
V/PI双染法检测细胞凋亡 与对照组比较，白花丹醌4、8 μmol·L-1 组凋亡最为明显，差异均具有显著性(P<0.01，Fig3，Tab2)。
Annexin V-FITC show HepG2 apoptosis case at different concentrations of plumbagin
A:CB:Plumbagin 1 μmol·L-1C:Plumbagin 2 μmol·L-1D:Plumbagin 4 μmol·L-1E:Plumbagin 8 μmol·L-1 group
Table 2 Effect of plumbagin on apoptosis of HepG2 cells(x±s,n=3)
GroupApoptosis rate/%
Control21.200±1.054
Plumbagin 1 μmol·L-123.800±0.625
Plumbagin 2 μmol·L-128.067±0.950
Plumbagin 4 μmol·L-145.067±4.910**
Plumbagin 8 μmol·L-149.367±4.884 ** **P<0.01 vs control group
白花丹醌对Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
不同浓度的白花丹醌作用48 h后，HepG2细胞内均出现不同程度的棕褐色颗粒物，随着浓度增加，促凋亡基因Bax蛋白表达明显上调，抗凋亡基因Bcl-2表达明显降低，即能明显下调Bcl-2/Bax蛋白的比值，与对照组比较差异均有显著性(P<0.01，Fig4，Fig5，Tab3)。
Effect of plumbagin on expression of Bax protein in HepG2 cells(×200)
A:CB:Plumbagin 1 μmol·L-1C:Plumbagin 2 μmol·L-1D:Plumbagin 4 μmol·L-1E:Plumbagin 8 μmol·L-1 group
Effect of plumbagin on expression of Bcl-2 protein in HepG2 cells(×200)
A:CB:Plumbagin 1 μmol·L-1C:Plumbagin 2 μmol·L-1D:Plumbagin 4 μmol·L-1E:Plumbagin 8 μmol·L-1 group
Table 3 Effect of plumbagin on expression of Bax、 Bcl-2 protein in HepG2 cells(x±s,n=5)
GroupBax protein
expression rate/%Bcl-2 protein
expression rate/%
Control35.800±1.31149.733±2.120
Plumbagin 1 μmol·L-144.400±1.44237.133±1.514*
Plumbagin 2 μmol·L-154.067±1.747*30.800±1.200*
Plumbagin 4 μmol·L-167.933±1.747**21.500±1.323**
Plumbagin 8 μmol·L-194.533±1.405**11.867±0.808***P<0.05,**P<0.01 vs control group
肝细胞癌是临床常见的恶性肿瘤之一，肿瘤细胞的转移和侵袭是恶性肿瘤的基本特征，尤其在肿瘤发展的最后阶段，控制转移是决定患者预后的关键因素。肿瘤细胞的运动性在侵袭转移中的作用已被众多实验所证实，迁移运动能力与侵袭之间的关系呈正相关。如何阻断肿瘤细胞的侵袭和转移是目前肿瘤治疗研究的热点之一。已有研究表明，某些中草药具有抑制肿瘤侵袭和迁移的作用。白花丹醌是白花丹的主要活性成分，是从植物白花丹中提取的一种小分子萘醌化合物，具有广泛的药理活性，包括抗菌消炎、抗生殖、抗凝、抗动脉粥样硬化、强心、抗肝纤维化、抗癌等作用[, ]，其抗癌活性引起了广泛的关注，研究显示，白花丹醌对白血病、骨肉瘤、乳腺癌等有明显的杀伤和抑制作用[, , ]。本研究以MTT法检测白花丹醌对HepG2细胞增殖的影响，发现随着药物浓度的增加，其抑制作用增强，并呈剂量-效应关系。Matrigel包被的小室实验是模拟人体内基质环境来研究肿瘤细胞的侵袭能力的实验，本实验观察到，与对照组相比，白花丹醌4、8 μmol·L-1干预组可以明显降低HepG2细胞穿透人工基底膜的细胞数量，说明白花丹醌具有明显抑制HepG2细胞侵袭能力。
细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制细胞自主有序的死亡，这一过程受多种促凋亡和抗凋亡的蛋白调节，其中Bcl-2家族蛋白担任着重要的角色，Bcl-2家族成员主要定位在核膜、细胞器膜上，与膜结合是其发挥生物功效的保障[]。Bax和Bcl-2通过形成同源二聚体或异源二聚体，来改变线粒体外膜各种通道的开放程度，从而调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体是诱导细胞凋亡，特别是大于80%时，且在适当信号诱导下，细胞凋亡作用增大；Bax和Bcl-2形成异源二聚体时则抑制细胞凋亡，因而认为Bcl-2/Bax比率是启动细胞凋亡的“分子开关”，其数值越低说明凋亡趋势越明显[]。本实验研究发现，白花丹醌能诱导HepG2细胞发生凋亡，白花丹醌作用HepG2细胞48 h，4、8 μmol·L-1组细胞凋亡率均明显高于对照组。并且使HepG2细胞Bax蛋白水平上调，下调Bcl-2蛋白水平，即Bcl-2/Bax比值下降，并存在剂量依赖性，这可能是白花丹醌诱导肝癌细胞凋亡的分子机制之一。
综上所述，白花丹醌能够抑制HepG2细胞增殖，促进HepG2细胞凋亡，抑制HepG2细胞的侵袭，说明白花丹醌具有抗肝癌的作用。白花丹醌调控肝癌细胞的侵袭及凋亡的具体分子机制，有待进一步研究，为白花丹醌临床治疗肝癌提供实验依据。
(致谢：本文全部实验均在广西中医药大学科学实验中心完成，特此致谢！)
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中国科协主管，中国药理学会主办
谢金玲, 赵川, 李俊萱, 韦燕飞
XIE Jin-ling, ZHAO Chuan, LI Jun-xuan, WEI Yan-fei
白花丹醌对人肝癌细胞HepG2侵袭和凋亡的影响
Effect of plumbagin on invasion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2