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一、原理与目的多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。二、材料与（1）马铃薯（大约每小组100-200g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置时配（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机三、操作步骤1：粗酶提取：水果肉组织按1：1（W/V）比例与003M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。四、实验结果获得PPO粗酶液。
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从引物设计到实验全程服务莲藕多酚氧化酶的纯化及环境因素对其溶液构象的影响--《华中农业大学》2008年硕士论文
莲藕多酚氧化酶的纯化及环境因素对其溶液构象的影响
【摘要】：
采用磷酸缓冲液为提取溶剂从莲藕中提取莲藕多酚氧化酶(PPO),通过考察提取方式、提取缓冲液保护剂、提取时间及料液比等因素对酶活性及酶量的影响确定了莲藕PPO的最佳提取方法;采用硫酸铵分级沉淀结合Sephadex DEAE A-50及Sephadex G-75柱层析等纯化步骤实现了莲藕PPO的分离纯化,并通过SDS-PAGE电泳进行了纯度鉴定和分子量测定。研究了莲藕PPO的酶学性质,用氨基酸自动分析仪测定了其氨基酸组成,并采用圆二色谱(CD)、荧光光谱(FP)及傅立叶红外光谱(FT-IR)研究了莲藕PPO的溶液构象。重点研究了溶液微环境效应(包括温度和pH值)对莲藕PPO溶液构象的影响,莲藕PPO与外源性底物、自身底物相互作用以及莲藕PPO与抑制剂相互作用的光谱学分析。主要研究结果如下:
1.莲藕PPO的提取条件及纯化方法
新鲜藕肉去皮打浆后,采用pH值为5.4的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液(含5%PVPP和10%NaCl)提取,料液比为1:2.2,置4℃冰箱中浸提4h,提取的莲藕PPO活性最大。提取液经30%饱和度的硫酸铵除杂,经80%饱和度的硫酸铵粉沉淀后,经溶解、透析、除盐后,经DEAE Sephadex A-50及Sephadex G-75凝胶柱,收集PPO活性峰,透析除盐后经SDS-PAGE电泳,呈单一染色带。
2.莲藕多酚氧化酶的酶学性质、分子量及结构表征
莲藕PPO以邻苯三酚为最适底物,其最适pH为7.0,最适温度为50℃,Km值为11mmol/L。
经SDS-PAGE电泳,比较标准蛋白分子量,得出莲藕PPO的分子量约为21kD。
将莲藕PPO进行氨基酸组成分析,根据各氨基酸相对含量和酶的分子量可推算出莲藕PPO中的氨基酸总和约164个。其中非极性氨基酸残基(Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Trp)为39.62%,极性氨基酸(Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asp,Glu,Lys,Arg,His)为57.92%,酸性氨基酸(Asp,Glu)为18.32%,碱性氨基酸(Lys,Arg,His)为10.39%。
采用圆二色谱、荧光光谱及红外光谱研究了莲藕PPO的构象,结果表明,浓度为0.3mg/ml的莲藕PPO,其圆二色谱显示在209nm和222nm处有双负峰,分子中α-螺旋构象和β-折叠构象分别占43%和57%。荧光光谱显示最大荧光强度在329nm处,荧光强度为370。结合氨基酸组成分析,荧光光谱表明Trp残基和Tyr残基同时被激发后,发生了从Tyr残基到Trp残基之间的能量转移。红外吸收中有明显的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带,分别位于1658cm~(-1)和1544cm~(-1)处,酰胺Ⅲ带在1240 cm~(-1)处有归属于α-螺旋构象的吸收峰。
3.微环境效应对莲藕多酚氧化酶溶液构象的影响
不同pH值下莲藕PPO的二级结构变化:莲藕PPO在中性pH环境中活性最高,圆二色谱显示在209nm和222nm处有双负峰,分子中α-螺旋构象和β-折叠构象分别占43%和57%。荧光光谱显示最大荧光强度在329nm处,荧光强度为370。随着pH值的升高或降低,莲藕PPO的活性和二级结构都发生显著变化,在pH＜5和pH＞10的条件下,其活性显著降低,分子中α-螺旋构象显著降低,同时β-折叠和无规则卷曲构象明显增加;荧光λmax发生红移;荧光强度随着pH值的升高而增强。pH值通过微扰莲藕PPO的二级结构而影响其活性,莲藕PPO的活性中心可能位于α-螺旋结构中,莲藕PPO中α-螺旋构象和β-折叠构象的合理配置可能是保持其活性的适宜构象。
不同温度下莲藕PPO的二级结构变化:随着温度的升高,莲藕PPO活性上升,当温度升高至60℃并保温数分钟后,发生了热变性,活性开始下降,其二级结构中,其α-螺旋构象从42.4%降至0.8%,β-折叠构象从56.7%上升至83%,无规则卷曲含量上升至16.2%。其荧光强度随着温度的升高而下降,最大发射波长蓝移了3nm。红外光谱中各酰胺带均发生不同程度的位移,且其红外吸收减小,酰胺Ⅲ带中1240 cm~(-1)处归属于α-螺旋构象的吸收峰移至1245 cm~(-1)。综上可推知,莲藕PPO的热变性温度为60℃。
4.莲藕PPO与底物之间的相互作用
活性实验结果表明,以邻苯三酚做底物,莲藕PPO活性最高。圆二色谱结果表明,莲藕PPO与邻苯三酚、邻苯二酚、没食子酸作用后,其α-螺旋构象均显著降低,β-折叠构象升高,无规则卷曲含量上升至16.5%左右。邻苯三酚与PPO相互作用后,其荧光强度下降,峰位不变。邻苯二酚与PPO相互作用后,其荧光强度显著上升,没食子酸与PPO作用后,Trp残基红移最显著,可能是Trp过度地暴露所致。从溶液构象的变化可知,Trp残基的过度暴露不利于莲藕PPO维持活性构象。
应用圆二色谱、荧光光谱研究莲藕自身底物与莲藕PPO相互作用的二级结构变化。结果表明,莲藕PPO的二级结构中出现了10.3%的β-转角,其α-螺旋构象从37.1%降为12.3%,β-折叠构象从62.9%下降至58.5%,无规则卷曲含量上升至18.9%。荧光光谱中,Trp残基的荧光强度增加,最大发射波长红移至348nm,可知Trp残基暴露于部分疏水环境所致,可推知β-转角结构为PPO进行催化反应的重要的中间构象,Trp暴露于部分疏水环境有利于维持PPO催化活性构象。
5.莲藕PPO与抑制剂之间相互作用的研究
测定了莲藕PPO在不同酶活抑制剂作用下的酶活性变化情况。比较了几种常用酶活抑制剂抑制剂A、氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸、EDTA-2Na等对莲藕PPO活性的抑制效应。结果表明:抑制剂A、半胱氨酸及氯化钙对莲藕PPO活性的抑制效果较强,抑制率分别为96.2%,86.8%及82.4%。柠檬酸及EDTA抑制效果较低。
圆二色谱结果表明,抑制剂A严重破坏了莲藕PPO二级结构中的α-螺旋,其α-螺旋构象含量降为0。氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸及EDTA也破坏了莲藕PPO二级结构中的α-螺旋,但α-螺旋构象仍有残留。加入抑制剂后,莲藕PPO二级结构中的β-折叠构象含量及无规则卷曲含量普遍升高。荧光光谱结果表明,氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸及EDTA与莲藕PPO结合后,其荧光发射光谱峰位及峰型变化较相似,当加入抑制剂A后,其发射峰型发生显著变化,红移最显著,说明其Trp残基在亲水的环境中暴露程度最大。
【关键词】：
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：TS255.1【目录】：
ABSTRACT9-13
缩略语表13-14
第一章 前言14-23
1 莲藕褐变研究进展14-17
1.1 莲藕多酚类化合物的研究进展14-15
1.2 莲藕褐变控制研究进展15-16
1.3 莲藕多酚氧化酶的研究进展16-17
2 蛋白质溶液构象的研究进展17-22
2.1 蛋白质的结构理论18-19
2.2 研究蛋白质溶液构象的方法19-22
3 研究目的、意义及内容22-23
第二章 莲藕多酚氧化酶的分离纯化23-36
1 材料与方法24-28
1.1 试验材料和仪器设备24-25
1.2 试验方法25-28
2 结果与分析28-34
2.1 莲藕多酚氧化酶的酶活测定方法的比较28
2.2 莲藕多酚氧化酶提取方法的比较28-29
2.3 莲藕多酚氧化酶提取条件的优化29-31
2.4 粗酶液的硫酸铵分级沉淀分析结果31-32
2.5 莲藕多酚氧化酶的柱层析纯化32-34
2.6 莲藕多酚氧化酶纯度的SDS-PAGE鉴定结果34
3 讨论34-36
第三章 莲藕多酚氧化酶的酶学性质及结构表征36-49
1 材料与方法36-39
1.1 试验材料和仪器设备36-38
1.2 试验方法38-39
2 结果与分析39-47
2.1 莲藕多酚氧化酶酶学特性的分析39-42
2.2 莲藕多酚氧化酶的分子量42-43
2.3 莲藕多酚氧化酶的结构表征43-47
3 讨论47-49
第四章 微环境效应对莲藕多酚氧化酶溶液构象的影响49-62
1 材料与方法50-51
1.1 试验材料和仪器设备50
1.2 试验方法50-51
2 结果与分析51-60
2.1 环境pH值对酶溶液构象的影响51-55
2.2 环境温度对酶溶液构象的影响55-60
3 讨论60-62
3.1 环境pH值对PPO溶液构象的影响60-61
3.2 环境温度对PPO溶液构象的影响61-62
第五章 莲藕多酚氧化酶与底物及抑制剂相互作用的研究62-77
1 材料与方法63-65
1.1 试验材料和仪器设备63
1.2 试验方法63-65
2 结果与分析65-74
2.1 莲藕多酚氧化酶与外源底物相互作用65-69
2.2 莲藕多酚氧化酶与内源底物相互作用69-71
2.3 莲藕多酚氧化酶与抑制剂相互作用71-74
3 讨论74-77
3.1 莲藕PPO底物之间的相互作用74-75
3.2 莲藕PPO与抑制剂之间的相互作用75-77
第六章 结论与展望77-80
1 结论77-79
2 展望79-80
参考文献80-91
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