PEI转染手册-上海起发实验试剂有限公司
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PEI转染手册
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&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& PEI转染手册&转染操作流程：&&&1、细胞传代：转染前24h内分离293T细胞至含10％胎牛血清的DMEM培养基 中进行传代培养，接种密度如下：&&&&&&&& 6孔板：0.5x106细胞&&&&&&&& 10cm培养皿：4.0x106细胞&&&&&&&& 15cm培养皿：9.0x106细胞2、转染转染前将所有试剂置于室温。2.1质粒DNA的稀释在无菌试管中，用无血清的DMEM W / O酚红培养基（浓度为10％）稀释质粒DNA（ug）。病毒包装体（psPAX2）：病毒包膜（pMD2G）和重组质粒DNA的稀释比例分别为4:2:1。&&&&&&& 6孔板：200ul+3ug的DNA&&&&&&&&10cm培养皿：1ml+7-8ug的DNA&&&&&&&&15cm培养皿：2ml+11-12ug的DNA&& 2.2 转染复合体形成将PEI（1ug/uL）加入已稀释的总DNA中，PEI与DNA（ug）的混合比率为3:1。加入后立即涡旋混合。&&&&&& &6孔板：9ul PEI复合体（1ug/ul）=9ug&&&&&&&&10cm培养皿：21ul PEI复合体（1ug/ul）=21ug&&&&&&&&15cm培养皿：33ul PEI复合体（1ug/ul）=33ug将添加到细胞的DNA/ PEI的混合物在室温下孵育15分钟。4、收获转染细胞转染后48小时内收获转染细胞/或病毒上清。&试剂的配制：PEI（1ug/ul） Polysciences（CAT＃23966-2配制成储液：)1、将无内毒素的无菌水加热至80℃左右溶解PEI，冷却到室温。2、调整pH值至7.0，用0.22um的滤器过滤消毒，分装后储存在-20℃。工作液可保持在4℃订货信息&货号品名价格￥规格品牌备注23966-2POLYETHYLENIMINE LINEAR28642 gpolysciences大量现货24765-2POLYETHYLENEIMINE 'MAX'31842 gpolysciences转染效率高30% 更好溶解CEZ Trans细胞转染液2001mlLife iLab23966配制CEZ Trans细胞转染液180050mlLife iLab23966配制CEZ Trans细胞转染液5500500mlLife iLab23966配制CEZ Trans细胞转染液2001mlLife iLab24765配制CEZ Trans细胞转染液180050mlLife iLab24765配制CEZ Trans细胞转染液5600500mlLife iLab24765配制78004qf01POLYETHYLENIMINE LINEAR14321g78bio23966分装78005qf01POLYETHYLENEIMINE 'MAX'(40 000M.W.*15921g78bio24765分装友情提醒：Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) 23966-2为Polysciences公司生产的化合物产品，每批产品出厂前都经过严格的检测,保证每批产品都100%合格、稳定且高品质,但由于作为转染试剂使用过程中有很多实验室因素(PH,水纯度,称量的准度,dna纯度&)造成溶解出现问题或者转染效率出现差异,所以厂家只受理该产品纯度，分子量及重量缺失破损等相关投诉，针对极个别客户溶解问题和转染效率问题我们只能友善解决,所以不能保证您能获得满意答复，对于产品应用方法的问题，不作为评价我们售后工作的依据。如果我们提供的PEI手册都无法解答您的问题,建议您可以多看文献,多调整一下转染条件,找出适合自己细胞的转染方法。如果无暇摸索条件,您也可以直接购买我们EZ Trans细胞转染液,这样免去您很多烦恼,谢谢理解&改进的PEI转染试剂EZ Trans细胞转染液 96孔细胞培养板用量 &现实中浓度请调整，MAX请适当调整浓度细胞型号培养基每孔细胞数DNA的量&转染试剂量和培养基混合 4-6h293HDMEM3&1040.2&g0.5&LDMEM+10%FBS293FTDMEM3&1040.2&g0.5&LDMEM+10%FBS293EDMEM3&1040.2&g0.5&LDMEM+10%FBS293FDMEM3&1040.2&g0.5&LDMEM+10%FBSCOS7DMEM1.5&1040.4&g0.5&LDMEM+10%FBShelaDMEM2&1040.3&g0.5&L1640+15%FBSCaco2MEM3.5&1040.3&g0.75&LMEM+10%FBSBHK21MEM2&1040.2&g0.5&LMEM+10%FBSCHO-DG44DMEM+HT+pro2&1040.5&g0.5&LDMEM+HT+pro +10%FBSRAW264.7DMEM3&1040.2&g0.5&LDMEM +10%FBSMCF7MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat2&1040.1&g0.25&LMEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat+10%FBSSW480IMDM3&1040.4&g0.5&LIMDM +10%FBSMDCKDMEM4&1040.6&g1&LDMEM+10%FBSCHO-K1IMDM+Pro3&1040.2&g0.5&LIMDM+Pro +10%FBSHepG2DMEM3&1040.5&g0.75&LDMEM+10%FBSA549DMEM2&1040.3&g0.5&LDMEM+10%FBSNIH/3T3DMEM1.5&1040.1&g0.75&LDMEM+10%FBSveroDMEM3&1040.3&g0.75&LDMEM+10%FBSsf9SIM SF5&1040.4&g0.75&LSIM SF+10%FBS改进的PEI转染试剂Sinofection和其他产品的对比Transfection with Sinofection has been proved to provide higher levels of protein expression in several cell lines than leading competitor&s products. For large-scale production of recombinant proteins, Sinofection is the best choice to achieve the optimum yield. In addition, Sinofection also exhibits high transfection efficiency to ensure successful transfections.&Fig. 1 Protein expression levels by transient transfection using Sinofection and other competitors were compared in 9 cell lines, 6 of which showed superior results transfected by Sinofection （A~F）. Protein expression level was determined by Elisa assay. The transfection by competitor transfection reagents followed the manufacturers& protocols.&Excellent transfection of both adherent and suspension cells for a broad range of cell lines&Hundreds of recombinant antibodies and proteins have been successfully expressed by transient or stable transfection with Sinofection at various scales, from 0.1ml in a 96-well plate to 50L in a bioreactor. Utilizing EZ Trans细胞转染液 for all scales of transfection application will save the cost of research and production to a great extent.&Striking stability at 37&C&&Long-term stability test showed Sinofection remained its activity at 37&C for at least 4 months. Storage at -20&C~RT can maintain stable for at least 6 months. Exceptional stability resulted from rigorous screening and reliable investigation for a long time. Thus the stability of Sinofection can outperform any other transfection reagent.&Fig. 2. Stability test for Sinofection at 4 temperatures during 26 weeks. One recombinant antibody and recombinant VEGF-Fc were tested for expression level by transient transfection with Sinofection stored under different conditions. Expression level was assayed by Elisa.&Easy and fast procedure&&Transfection protocol （35-mm dish）:&Preparation of cellsAdherent cells One day before transfection, plate 0.2&2&106 cells in medium per 35-mm dish. Incubate at 37&C （5% CO2） overnight. The confluency of cells should be 50&80% before transfection.Suspension cells Plate 2 ml freshly passaged cells at a density of 5 & 104/ml to 1 & 106/ml in a 35-mm dish. The suspension cells should be in log growth phase at the time of transfection. Incubate cells at 37&C （5% CO2） overnight. The cell number depends on your needs and the cell type to be transfected.Preparation of EZ Trans细胞转染液&DNA complexesDilute DNA with appropriate diluents, such as PBS, NaCl solution, glucose solution, DMEM, medium with or without serum, whichever is isotonic, to a concentration of 20 &g/ml （optimization recommended） and a total volume of 250 &l.Dilute EZ Trans细胞转染液 of appropriate amount in 250 &l of medium.Combine the diluted DNA with the diluted Sinofection （total volume = 500 &l）. Mix gently and incubate for 20 minutes at room temperature （solution may appear cloudy）.TransfectionAdd the 500 &l complexes drop-wise to cells and medium. Gently rock the dishes or wells to ensure even distribution.Incubate cells at 37&C in a CO2 incubator for 18-48 hours （normally high expression is achieved after 72 hours） prior to protein expression assay.Transfection protocol （flask）:Transfecting Cells for Protein ExpressionThis protocol is typically used to transfect DNA into 293 EBNA or CHO cells cultured in flasks. Use sterile DNA or filter-sterilize DNA before use （re-quantify your DNA after filtration）.All amounts are on a per flask basis for 30 ml cultures in a 125 for other formats, see Table 2. Scaling up or Down Transfections.Table 2. Scaling up or down transfections with Sinofection. Note: the actual conditions should be optimized by experiments.&Pass 293 cells at 0.3 & 105 cells/ml, shake at 175 rpm. After 72 hours, dilute cells to 1.0& 106 cells/ml, shake at 175 rpm. Transfect after 4 hours.Pass CHO cells at 0.3 & 105 cells/ml, shake at 175 rpm. After 48 hours, dilute cells to 1.0& 106 cells/ml, shake at 175 rpm. Transfect after 4 hours.Dilute the required plasmid DNA amount with appropriate diluent, such as PBS with Mg2+, 150mM NaCl, 300mM glucose, DMEM medium with or without serum, whichever is isotonic. Incubate for 5 min at room temperature. Add the required Sinofection volume to the diluted DNA and mix gently to assure a total volume of 1.5~3ml.Incubate the mixture for 10-20 minutes at room temperature to allow complexes to form. Do not incubate for longer than 20 minutes.Slowly add 1.5~3ml of DNA-lipid mixture into the 125ml flask containing cells while slowly swirling the flask.Incubate transfected cell cultures at 37&C, 8% CO2 on an orbital shaker set to 175 rpm for both 293 cells and CHO cells.&Low cytotoxicity&&EZ Trans细胞转染液 demonstrates very low cytotoxicity which is tested and verified by in-house WST-8 assay for each lot. The WST-8 assay is based on the colorimetric reduction of water soluble tetrazolium （WST） by mitochondrial dehydrogenaseThe absorbance of formazan dye solution is in direct proportion to the number of viable cells. Compared with the prev alent WST-1 method, the sensitivity of WST-8 assay is higher meanwhile the solubility and stability of formazan dye is better.&Fig. 3. Microscopy comparison of HeLa cells and DG44 cells transfected with L2K and Sinofection respectively. Transfections were performed following the manufacturer&s recommendations.&Fig. 4. Cytotoxicity comparison of Sinofection and L2K for 4 cell lines. Transfections were performed following the manufacturer&s recommendations.&常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，&半乳糖苷酶等来帮助检测。稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。EZ Trans细胞转染试剂是一种阳离子聚合物（PEI）细胞转染液，是新一代的转染试剂，带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过胞吞作用进入细胞。除了具有阳离子脂质体（如：Lipo）的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点。EZ Trans细胞转染试剂一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的&质子海绵&体。其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低.EZ Trans细胞转染试剂与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（也写作：BPEI, 24765-2）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件情况下，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，转染效率比BPEI高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率。本公司两种PEI转染液均可提供，您可根据文献选择使用。几种细胞转染方法（试剂）特点比较表&转染方法原理主要应用特点厂家及产品阳离子聚合物带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团 形成带正电的 复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过胞吞作用进入细胞。稳定转染瞬时转染所有细胞除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。李记生物：EZ Trans细胞转染试剂Qiagen：SuperFect，Polyfect阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电 核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)稳定转染瞬时转染所有细胞使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转 染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染 中有很高的效率，但在体 内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了 其应用Invitrogen：Lipofectamine 2000，3000等Lipo系列产品Roche：Dosper，DOTAP，FuGENE 6CPG& Biotech：（GeneLimo Plus，GeneLimo Super）Promega（Transfast，Tfx，Transfectam）DEAE-葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时转染相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副 作用,转染时需除血清且一 般只用于BSC-1,CV-1,COS&细胞系Sigma-Aldrich：(DEAE-Dextran& Transfection Kit)磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染染瞬转染不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简 便但重复性差,有些细胞不 适用&&细胞建议用CSCL梯度离心，转染是拷贝数较多GIBCO BRLPromega逆转录病毒(RNA)通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受 体相互作用而 进入宿主细胞，之后反转入酶 启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中稳定转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等,但携 带基因不能太大（&8kb）,&细胞需处分裂期,需考虑安 全因素&腺病毒(双链&DNA)先和细胞表面 的受体结合，继 而在&v整合 素介导下被细 胞内吞瞬时转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞,需考虑安全因素&Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）将DNA用显微重金属颗粒沉 淀，再将包被好 的颗粒用弹道 装置投射入细 胞，DNA在胞内逐步释放，表达瞬时性转染稳定转染可用于：人的表皮细胞， 纤维原细胞，淋巴细胞系以 及原代细胞&显微注射法用显微操作将&DNA直接注入靶 细胞核稳定转染瞬时转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的 胚胎细胞&电穿孔法高脉冲电压破 坏细胞膜电位，DNA通过膜上形 成的小孔导入稳定转染瞬时转染所有细胞适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组 （&65kb）但细胞致死率高，&DNA和细胞用量大，&&需根 据不同细胞类型优化电穿 孔实验条件，拷贝数较少&1-20&&&运输与保存方法常温运输，4℃保存，保质期12个月。使用注意事项:质粒质量：请务必使用高质量转染级无内毒素质粒（推荐使用QIAGEN或者MN公司去内毒素质粒提取试剂盒）。通过&260 nm&光吸收测定&DNA&浓度，260 nm / 280 nm&比值确定&DNA&纯度（比值应该在&1.8~2.0&的范围之内）。如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。细胞条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保培养基没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。建议使用GIBCO或者78bio公司血清培养细胞。?使用方法：瞬时转染方法1.&接种细胞：转染前一天，用胶原酶消化细胞并计数（不建议用胰酶）。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到&70~80%。2.&准备&DNA-PEI&复合物：&DNA、PEI&试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据下表所示，用&Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量&DNA。用同样的培养基稀释PEI&试剂。每&1&&g DNA&需用2-5&&L&线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有&DNA&溶液的试管，一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置&10~25 min&以形成DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如&Falcon 5 mL /14 mL&离心管。3.&转染细胞：直接向每个孔中加入&DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染&3 h&后，添加1/2体积的包含&30%血清的生长培养基。4.&孵育细胞和分析结果：在&CO2培养箱中&37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后最快&7h&即可检测到转入基因的表达。请自行确定最适合检测时间。?稳定转染方法1.&接种细胞：转染前一天，用胰酶消化细胞并计数。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，总体积如表&1&所示，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到&70~80%。2.&准备&DNA-PEI&复合物：&DNA、PEI&试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据表&1&所示，用&Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量&DNA。用同样的培养基稀释PEI&试剂。每&1&&g DNA&需用2-5&&L&线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有&DNA&溶液的试管，一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置&10~25 min&以形成&DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如&Falcon 5 mL /14 mL&离心管。3.&转染细胞：直接向每个孔中加入&DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染&3 h&后，添加½体积的包含&30%血清的生长培养基。4.&孵育细胞和分析结果：在&CO2培养箱中&37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后最快&7h&即可检测到转入基因的表达。5.转染&24 h&后，将细胞传代至新鲜的生长培养基中（将细胞稀释&10&倍以上），在&CO2培养箱中&37℃孵育12小时。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约&1~2&周可筛选到耐药性克隆，在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。?特别提醒:1.&对于某些类型的细胞如&HEK-293、HEK293T、NIH/3T3&和&COS&细胞，在转染前两天铺板可显著提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板，可适当降低铺板密度，以确保转染时细胞的汇合度仍为&70~80%。2.&对于接触抑制敏感的细胞，可适当降低铺板密度。3.&即使在有蛋白（如&10%的血清）存在的情况下，DNA-PEI复合物仍能转染细胞，但是&DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。我们推荐使用&Opti-MEM ITM&培养基以达到最佳转染效率。其他的无蛋白培养基则需测试与线性PEI转染试剂的兼容性。4.&对大多数细胞来而言，每&1&&g DNA&使用&3.0&&LEndoFectinTM&试剂都能获得较高转染效率。使用者也可尝试每&1&&g DNA&使用&1~4&&L&体积线性PEI转染试剂进行优化。
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慢病毒包装体系使用说明
? ? ? 慢病毒包装体系使用说明? ? ?本说明书适用于以下产品： 名称 慢病毒包装体系 慢病毒包装体系（含 293V 细胞） 慢病毒包装体系（含转染试剂） 慢病毒包装体系（含 293V 细胞、转染试剂） 货号 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504北京英茂盛业生物科技有限公司? Web site：http://www
.产品说明书产品内容?KLV3501慢病毒载体（过表达或 RNA 干扰载体任选一种） 辅助载体 pH1 辅助载体 pH2 HEK293V 细胞 Polyfect-V 转染试剂 3?KLV35023?KLV35033?KLV35043?3? 3? ? ?3? 3? 3? ?3? 3? ? 3?3? 3? 3? 3?载体采用质粒形式发货， 请在收到质粒后放-20℃冻存， 也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。慢病毒载体?慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克 隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网 站
或本说明书后面的附表。1 北京英茂盛业生物科技有限公司 /产品说明书慢病毒包装载体?慢病毒包装载体包括 pH1 和 pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：产品说明书HEK293V 细胞?包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的 293V 细胞为低次代 293V 细胞，细胞性状 稳定。在高密度下生长 3 天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装 实验成本。Polyfect\V 转染试剂?Polyfect-V 转染试剂专为 293V 细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包 装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量 是普通转染试剂的 1/3 到 1/2 等显著优点；包装病毒时转染效率接近 100%，能提高病毒产量 3-5 倍。? ? ?3 北京英茂盛业生物科技有限公司 /产品说明书慢病毒包装?概述：? 病毒包装前需制备转染级慢病毒载体及两种包装载体。为保证转染效率，请采用 Qiagen 转染级试剂盒 或类似质量级别试剂盒制备质粒。 以下采用我公司的 Polyfect-V 转染试剂（货号 P2010）为例说明慢病毒包装过程。您也可以采用其它品 牌转染试剂进行慢病毒包装。转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。无 论采用哪种转染试剂，3 种载体的相对比例应保持不变。 本例中病毒包装采用 10cm 培养皿。如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相 对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。 试剂 293V 培养基：DMEM 高糖培养基+10%FBS 病毒培养基：DMEM 高糖培养基+10%FBS，丙酮酸 1mM。 Polyfect-V 转染试剂 转染级慢病毒载体，包装载体 pH1 及 pH2。快速转染法?在此方法中质粒转染和细胞铺板一次完成， 传统病毒制备一次需要 72 至 96 小时， 采用本方法仅需 48 小时。 制备病毒滴度和传统方法没有差别。 1、 2、 漩涡震荡混匀 Polyfect-V 转染试剂。 准备 2 个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。 离心管 1（质粒 DNA）? 离心管 2（转染试剂）? 慢病毒载体 5μg Polyfect-V 转染试剂 20 μl pH1 载体 3.75μg DMEM 无血清培养基 480 μl pH2 载体 1.25μg DMEM 无血清培养基 X μl 总体积 500μl 3、 4、 充分混匀。 将转染试剂稀释液（离心管 2）加入质粒 DNA 溶液（离心管 1）中，立刻充分混匀。注意加入顺 序非常重要。 室温孵育转染混合液 15 分钟。 在孵育转染混合液时，消化 HEK293V 细胞，用 293V 培养基制备成 0.6×10^6/ml 细胞悬液。根据 需要制备的病毒量，将细胞悬液放入 15ml 或 50ml 离心管备用。 将每 1ml 转染混合液加入 10ml 细胞悬液，轻轻吹吸细胞混匀。 将细胞悬液加入 10cm 培养皿，放入 37℃培养 24 小时。 去除含有转染试剂的培养基，用 10ml 病毒培养基换液。 总体积 500μl5、 6、7、 8、 9、产品说明书10、 转染后 48 小时收集细胞培养上清。500g 离心 10min 去除细胞碎片。该上清可以直接用于慢病毒 感染，也可以进行病毒滴度测定或病毒浓缩。如需长时间保存，可-80℃冻存。注意每次冻融将 导致病毒滴度下降 2-4 倍。常规转染法?1、 转染前 24 小时，将 293V 细胞以 4-5×106/10cm 平皿密度接种，加入 10ml 293V 培养基 37℃，5% CO2 培养。细胞转染前密度应达到 90%。 漩涡震荡混匀 Polyfect-V 转染试剂。 准备 2 个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。 离心管 1（质粒 DNA）? 离心管 2（转染试剂）? 慢病毒载体 5μg Polyfect-V 转染试剂 20 μl pH1 载体 3.75μg DMEM 无血清培养基 480 μl pH2 载体 1.25μg DMEM 无血清培养基 X μl 总体积 500μl 4、 5、 充分混匀。 将转染试剂稀释液（离心管 2）加入质粒 DNA 溶液（离心管 1）中，立刻充分混匀。注意加入顺 序非常重要。 室温孵育转染混合液 15 分钟。 将 1ml 转染混合液逐滴加入步骤 1 准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。 37℃培养。 4-6 小时后，用 10ml 新鲜的 293V 培养基换液。转染后 24 小时，用 10ml 病毒培养基换液。 总体积 500μl2、 3、6、 7、 8、 9、10、 转染后 48 小时收集细胞培养上清。500g 离心 10min 去除细胞碎片。该上清可以直接用于慢病毒 感染，也可以进行病毒滴度测定或病毒浓缩。如需长时间保存，可-80℃冻存。注意每次冻融将 导致病毒滴度下降 2-4 倍。5 北京英茂盛业生物科技有限公司 /产品说明书慢病毒滴度测定?在需要用确定的感染复数获得稳定的感染效果时，需要对病毒滴度进行测定。病毒滴度测定最好直接 用收获和纯化的病毒液进行，也可以用冻存的病毒液。值得注意的是采用不同的细胞系和方法测定的病毒 滴度会存在很大差异。测得的病毒滴度值和感染靶细胞所需的病毒滴度相差可能很大。但是每次采用相同 的方法测定病毒滴度还是可以对病毒包装效果进行一个较为准确的衡量标准。 病毒滴度测定可以采用 Realtime-PCR、 抗生素筛选细胞克隆法以及流式细胞对荧光细胞进行直接计数等。 也可以采用商业的病毒滴度测定试剂盒。具体实验方法可以参考(R. H. Kutner, 2009)中的方法进行。? 慢病毒感染靶细胞?以下方法可用于感染一般贴壁细胞如 293V 细胞，CHO 细胞等。在病毒感染时添加 polybrene 可以增加 病毒感染效率。 但是 polybrene 可能对某些细胞系产生毒性。 在使用前可以通过预实验确定合适的 polybrene 浓度，一般为 4-12μg/ml。 1、 感染病毒前 18-24 小时将细胞以合适的密度接种到培养皿。 2、 室温溶解病毒液，混匀。 3、 将适量病毒液和 polybrene 用细胞培养基稀释，加入细胞培养皿中。 4、 继续培养 24 小时， 用新的完全培养基替换病毒感染液。 如果病毒液或 polybrene 对细胞生长有较大 影响可以将病毒感染时间缩短至 6-8 小时。 5、 病毒感染后 48-72 小时可以观测到外源基因表达。这时细胞可用于荧光检测或加入抗生素筛选稳定 细胞株。产品说明书?慢病毒载体?货号? RNA 干扰慢病毒载体? VL3101? VL3102? VL3001? VL3002? VL3003? VL3211? VL3212? VL3213? VL3214? VL3215? VL3216? VL3217? VL3218? VL3219? VL3311? VL3312? VL3313? VL3314? VL3315? VL3316? VL3317? VL3318? VL3319? pLVshRNA-EGFP pLVshRNA-Puro pLV-Puro pLV-IRES-Puro pLV-IRES-Neo pLV-EGFP-N pLV-ECFP-N pLV-EYFP-N pLV-mCherry-N pLV-EGFP-C pLV-ECFP-C pLV-EYFP-C pLV-mCherry-C pLV-mTomato-C pLV-EF1α-EGFP-N pLV- EF1α-ECFP-N pLV- EF1α-EYFP-N pLV- EF1α-mCherry-N pLV- EF1α-EGFP-C pLV- EF1α-ECFP-C pLV- EF1α-EYFP-C pLV- EF1α-mCherry-C pLV- EF1α-mTomato-C EGFP EGFP ECFP EYFP mCherry EGFP ECFP EYFP mCherry mTomato EGFP ECFP EYFP mCherry EGFP ECFP EYFP mCherry mTomato Puromycin Puromycin Puromycin Neomycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin Puromycin 名称? 荧光标签? 抗性基因?CMV 启动子基因过表达载体?EF1α 启动子基因过表达载体?查询更详细的产品信息请访问本公司网站：7 北京英茂盛业生物科技有限公司 /
回收 A. 酶切产物的胶回收:一般做 50-100ul 体系,然后跑电泳回收,回收量...测定质粒 DNA 纯度的方法 琼脂糖凝胶电泳 四、慢病毒包装流程 4.1 实验材料 ...YRGene 慢病毒包装试剂盒(精简版)说明书产品编号:LPKS005 产品规格:5 个 10cm 皿 产品简介:赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分: (1)优化配比的慢病毒...慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒, 三种质粒载体分别进行高纯度无内毒 素抽提,共转染 293T 细胞,转染后 6 h ...慢病毒包装简介及应用_生物学_自然科学_专业资料。慢病毒包装系统简介及应用 一...慢病毒包装步骤 1页 免费
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