重叠延伸pcr原理求助

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-11-19 07:55 标签： 重叠延伸pcr
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重叠延伸PCR简介
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重叠延伸 PCR 技术 (gene splicing by overlap extension PCR, 简称 SOE PCR) 由于采用具有互补末端的引物 , 使 PCR 产物形成了重叠链 , 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸 , 将不同来源的扩增片段重叠拼接起来 . 此技术利用 PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组 , 而且不需要内切酶消化和连接酶处理 , 可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物 . 重叠延伸 PCR 技术成功的关键是重叠互补引物的设计 . 重叠延伸 PCR 在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
以下是重叠延伸 PCR 的原理及两基因的引物设计：
上游（ F1 ）与 开放阅读框起始密码子附近的序列相对应 ，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补 ，并去除
A 基因 的终止密码子TAA
上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应 ，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补 ，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
先分别用 F1 、 R1 ， F2 、 R2 扩增出 A 和 B 基因，然后再用 F1 和 R2 将两基因连接起来，得到融合基因。
相关实验方法
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[求助]何谓重叠延伸PCR？
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这个帖子发布于11年零117天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请高手指点，看书上的讲解还不甚明白，3Q！
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SOE法（Gene splicing by over lap extension）,又叫做重叠延伸PCR，是一种通过复制时DNA链的交错延伸来实现基因拼接的方法。PCR片段拼接的SOE和SDL方法　　PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、 大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效 拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操 作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。SOE法　　1989年，Horton等人提出了SOE法（Gene splicing by over lap extension），即通 过复制时DNA链的交错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。　　（1）引物设计：引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引 物序列；c同理；则b和c的部分碱基可互补配对。　　（2）基因I、Ⅱ分别扩增，产物相应为片段A、B和C、D。　　（3）两种产物混合，经变性及退火处理，A链和D链部分碱基互补配对，成杂交链。　　（4）在DNApolymeraseI作用下，A和D链互为引物和模板，合成出A'D'链，即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列，则在接接产物中，将按预先 设计要求出现定点突变。SDL法　　1991年下半年，Lebedenko等人提出SDL方法（Gene splicing by directed liga- tion），即直接拼接法，它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下：　　（1）限制性内切酶，EcoRI核酸内切酶（或其它Ⅱs类限制性内切酶）能专一性识别 6bp的非回文序列，并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸，产 生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关， 而是由切点附近的序列决定的。　　（2）扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例：5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列；3'链引物包括常规3'链引物和AC及EcoRI 识别位点。　　（3）唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5，它的右 侧突出末端TCAC中，TC为原始exon5的一部分，AC为原始exon6的一部分，且TCAC与 exon6的AGTG互补配对，其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259，故可被视作 “唯一性末端”。　　（4）把经扩增的exon5、exon6和exon7混合，依据碱基互补配对原则，它们就能按顺 序依次拼接。　　显而易见，在SOE法中，退火时的最希望产物是AD，杂交链，但A链和B链，C链和D链 配对的可能性更大，另外还有B、C链的配对，这些都是不利的；而SDL法中就不存在 这个问题。另一方面，由于不需DNApolymeraseI，避免了它在复制中可能带来的错 误，所以，SDL法更优越。
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3Q...........................
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【求助】重叠延伸PCR
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这个帖子发布于9年零249天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好！我目前做一个基因的表达载体的构建。该基因包括内含子共有4262bp（内含子1400bp），低组成型表达。原来打算用RT-PCR法拿该基因，但是做了两个多月一直不成功。后来又用长片段PCR法阔增其全序列，也没有成功。实验室的一个博士建议我分两段来扩增（扩增的两段之间有1000多bp的重叠区），原后把两段扩增的结果用重叠区的酶切位点相连接。我目前已经分段扩增出了两个目的片段。从网上看到用重叠延伸PCR法将两个基因融合，我想请问下，我的这个基因可以不可以用重叠延伸PCR法进行连接一起。
如果可以恳请做过重叠延伸PCR的高手指教具体的实验操作。谢谢！
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怎么没有人说话呀！ 请大家不吝赐教。
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给一点建议吧！ 我也正在用这种方法。用非重叠部分的两个引物进行扩增一下。
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理论上说是完全可以的,一般来说也是可以的.但具体到某个序列这个实验就难说了,会涉及多个因素重叠区的长短?以及重叠配对的效率?两个PCR底物的用量?以及终产物的长度(短的相对容易成功)?......
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原则上可以，要注意两个片段浓度的比例，两头引物加入的时间（我做的时候一般18个循环加入）、循环数的多少（长片段PCR我一般设置38个循环），以及退火温度的摸索，这些都需要你摸索，别人只能给你个建议。我个人认为重叠延伸PCR一般对短片段很有效，对长片段难度较大。其实你博士师兄说的方法挺好的，在重叠区设计酶切位点，来搭桥，得到全长基因。
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tonyoak edited on
谢谢tonyoak网友的支持!经过你的指点,我决定用博士师兄的建议:在重叠区设计酶切位点,得到全长基因!但是这样会有内含子在基因里面,我想问下如果有完整的内含子在基因里面,把这个基因做真核表达,内含子对其表达有没有影响?
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其实你一边用重叠延伸的方法做，，一边按照你在重叠区域设计合适的引物位点（设计合适酶切位点时候，切记不要改变这个基因的编码蛋白），得到全长基因。做真核表达时候,有内含子没关系。
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重叠延伸pcr技术
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