跑pcr时pcr退火温度与tm值可以低于50℃吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-02 18:42 标签： pcr退火温度的选择
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pcr引物退火温度低时没有产物,高温就有，为什么呢
pcr是梯度pcr，引物退火温度51,52，53，54，55度等都没有产物,58度就有,这是为什么啊
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不是啊，因为高温都能p出来，低温应该更可以p出来啊，就算是特异性不强也会有多带啊，而不会没有带啊
不是啊，因为高温都能p出来，低温应该更可以p出来啊，就算是特异性不强也会有多带啊，而不会没有带啊
非也。如果Tm值很高，在较低温时模板双链大部分都未解开（你该知道Tm之意思吧），如何扩增？
在你所用的温度条件下（高于50C），是否出现非特异性扩增要取决于你的引物顺序，可以出现但并非一定出现。而且你为什么希望有非特异性扩增呢？我刚开始的时候也像你一样迷茫，同学给我推荐了，上面很多牛人分享的科研经验，对新手很有帮助，你也可以下载来试试！
我知道要高温在能解链啊，不过每个循环不是都有95度的解链了吗，那个是退火温度啊，就是模板与引物结合的温度啊。
我不是眼非特异性扩增，就是觉得55度p不出来，而58度能p出来，好奇怪，想不明白，因为55度时候引物应该更容易与模板结合啊，就是58才是最适Tm值，那55度也应该有条带啊，不管特异的还是非特异的
我知道会P出乱七八糟的带，但是现在是什么带都没有啊
可能，不是一定啊。没条带也正常啊。温度低，引物配对不上，当然P不出了啊
恩，好，谢谢这位朋友
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摘要 : 在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个)的时候，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
另一种说法：熔解温度(Tm)是引物的一个重要参数。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的，适用于小于18碱基的引物。 有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
Tm值除了用软件之外，还可以这个公式：2(A+T)+4(C+G)，然后减5&10度
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
另外，由于的不同，注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。
具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度;否则可以设置58-70度的梯度;如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
作者：Snail 点击：次
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在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA&比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。
温度与时间/退火温度
取决于引物的长度、组成及其浓度，还有序列的长度。对于20个，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下帮助选择合适的温度： Tm值()=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。在金属加工领域，退火温度是指退火时金属应加热达到的温度。据有关文献介绍，不同金属材料的退火温度为：铂，900—1000℃；铜，650℃；黄铜，600—650℃；镍银，650—680℃；铝，283—350℃等。
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