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联合饲喂微绿球藻和淡水小球藻对连续培养的褶皱臂尾轮虫脂肪酸组成的影响
【来源/作者】肖莹 【更新日期】 19:38:29
（作者：集美大学 王文俊、晁眉、陈庭）
近年来，已有许多关于发展用微颗粒饲料饲喂海洋有机体早期生命阶段的研究。然而，到目前为止，有效的人工微颗粒饲料还没有得到充分开发。轮虫作为最初的必须食物也是不可或缺的。至于轮虫培养方法，有分批培养和连续培养两种传统方法。由于需要减少对空间和劳动力的需求，并提高轮虫的质量，高密度培养和连续培养则越来越多地被用于饲养管理。特别是，由于轮虫可以在连续培养系统中保持在对数增殖阶段，质量改进的高活性和高营养价值的轮虫可连续生产，可用于仔稚鱼的培养。此外，已知轮虫培养的稳定受种或者族的影响，连续培养S型轮虫比连续培养L型轮虫容易。
在以前的研究中，连续培养30天，以浓缩淡水小球藻和高密度微绿球藻作为食物，培养的L型褶皱臂尾轮虫，比S型轮虫更难保持生产稳定。人们发现，微绿球藻饲喂轮虫的水负荷低于淡水小球藻的水负荷，因此长期连续饲养轮虫时，微绿球藻饲养优于淡水小球藻的饲养。还发现，二十二碳五烯酸（DPA）存在于微绿球藻饲喂的轮虫中，而在微绿球藻中则没有检测到DPA。
然而，值得关注的是，饲喂微绿球藻的轮虫是否可以保持在一个足够高的密度来满足仔鱼的实际需要。在S形轮虫的连续培养中，根据相关研究，高密度的微绿球藻或淡水小球藻可以提高轮虫的生产率。然而，根据作者所知，混合投喂微绿球藻和淡水小球藻的高密度L型轮虫的培养效果尚未被公诸于世。
在最近的研究中，以藻类连续喂养轮虫由三个步骤组成：投喂微绿球藻→投喂淡水小球藻和微绿球藻→投喂淡水小球藻，这是为了检验连续培养的轮虫在连续改变饵料的情况下的稳定性，以此来确认连续高密度喂养的轮虫在改变饵料饲喂的情况下不需要重新培养。此外，也监测到轮虫脂肪酸组成的变化。在不同饲喂方法中不同饵料对轮虫日生产率的影响也被监测到。这是首份有关试验连续投喂不同饵料对轮虫连续培养的影响的报告。
进一步研究，在使用新型套管式水温调控装置的基础上，微绿球藻的培养旨在获得高密度且富含EPA的藻类。而EPA是海洋生物早期阶段的必需脂肪酸之一。
材料与方法
高密度微绿球藻培养
用于培养微绿球藻的光生物反应器是采用腈纶纤维的建于室外简易水箱（5.5厘米*140厘米*50厘米，容积为37 L）。取the Aburatsubo Marine Park的海水以沙过滤，并用自来水稀释至盐度26，然后通过中空纤维膜过滤。微绿球藻的培养条件如Table1中所示。使用安装在水箱底的冷却/加热夹套把水温调节到20-25℃。换气设备安装在水箱底部以4 L/min的速度进行换气，并伴随着18 L/天的二氧化碳的交换。
半持续性的微绿球藻培养进行了15天。每3天收获藻类一次（17升），同时要添加含有相应营养的海水17升。每天监测藻类的密度，每次收获的微藻用于轮虫的连续培养。
连续轮虫培养
褶皱臂尾轮虫连续培养的情况如Table2所示。这个连续培养系统包括一个培养池，收获池（材质是聚乙烯，容量2000mL），还有一个饵料池（由玻璃制成，2000mL）。换气孔是设置于每个池底的巴斯德吸管，速率是1L /分钟。在该系统中，过滤后的含有藻类饵料的海水通过管泵从饵料池以0.7毫升/分钟的速率被连续地供给到培养池，与此同时同等容量的养殖水通过水管被转移到收获池，这样我们就能收获大量的轮虫。通过水浴，我们可以把培养池和收获池的水温维持在24℃。光照则保持室内自然光照射（50-1000勒克斯）。
前期饲喂微绿球藻20天，然后进行轮虫饲喂，开始时密度为每毫升500个。饲喂实验有三个步骤：首先，微绿球藻饲喂期（N期），然后是微绿球藻和淡水小球藻共同饲喂（N+FC期)，最后是淡水小球藻饲喂期(FC期)。每个时期要持续7天。在N期，每天饲喂要在饲喂罐里加入1000ml的微绿球藻（190-210*106细胞数/毫升）。N+FC期，在饲料的微绿球藻中添加3ml的淡水小球藻。在FC期，每天在饲料中添加1000ml的海水和8ml淡水小球藻的混合物。在收获罐中，N期每天要准备200ml微绿球藻；N+FC期每天要加入200ml海水；在FC期要加入200ml海水和0.5ml压缩的淡水小球藻。饲喂和收获罐中的轮虫的密度和蛋白含量要每天测量两次。轮虫的收获4，5，6和7天之后，每个饲养周期的开始汇集到各自的三个样品。
脂质含量的分析和脂肪酸组成
分析培养的微绿球藻，实验中使用的商业用淡水小球藻和收获的不同食物饲喂的轮虫的脂质含量和脂肪酸组成。
悬浮微绿球藻在离心作用（6200g,20°C,10min)下浓缩，轮虫用浮游生物网（40μm）从收获罐中收集并在-80°C保存以便分析。商业用淡水小球藻不进行预处理然后分析。粗脂肪含量测定使用Folch的氯仿-甲醇(2:1 v/v)提取法进行分析。另外，分离非极性与极性的脂肪由使用二氧化硅分离柱完善。脂肪酸组成的分析，粗脂肪中的非极性与极性脂肪用50%KOH乙醇溶液皂化，在甲醇溶液中制备甲酯与7%三氟化硼。脂肪酸的测定则使用先前的研究中描述的汽液色谱法。
日常生产轮虫比的数据使用方差分析法(ANOVA)分析。每日轮虫比的差异通过Tukey的多范围测试在5%显著性水平内进行评估。
微绿球藻的培养
高密度微绿球藻养殖的结果在图表1中展示。
开始时接种密度为每毫升120×106 个细胞。通过15天的培养，可完成5倍的收获量，大约在每毫升200×106 个细胞。微绿球藻的半连续培养维持在高密度水平，尽管45%体积的水每3天更换一次。
连续饲喂轮虫
连续轮虫饲喂的结果在图表2中展示，轮虫的生产率总结在表格3中。
N期饲喂期，培养罐中轮虫的密度保持在460-700个/毫升。N期饲喂期在收获罐中，观察密度范围在310-840个/毫升，是由于轮虫生产的范围为（400-1000）×103个/天。培养罐中受精卵率为22-67%，收获罐中受精率为22-56%。
N+FC饲养时期，饲养罐中轮虫密度维持在630-1050个/毫升，在收获罐中维持在430-740个/毫升，收获轮虫（520-890）×103个/天。培养罐中受精率为23-73%，收获罐中受精率为21-59%。
FC饲喂期培养罐中轮虫密度维持在750-1000个/毫升，收获罐中为520-700个/毫升，每天收获轮虫（620-840）×103个/天。培养罐中受精率为39-58%，收获罐中受精率为30-51%。
此外，每日轮虫生产比率（收获罐轮虫数/培养罐轮虫数）最高为N期饲喂期，N+FC期为中间水平，在FC期最低。
微绿球藻和轮虫化学分析
商业淡水小球藻，培养的微绿球藻和收获的轮虫粗脂肪含量和脂肪酸组成在表格4中显示。球藻，淡水小球藻，N期收获轮虫，N+FC期收获轮虫和FC期收获轮虫的的脂肪含量（占干物质百分比）分别为21.4%，9.5%，13.3%，13.0%和10.7%。分析脂肪酸的组成结果表明，球藻的极性与非极性脂肪酸成分中棕榈酸（16：0)，16：1n-7和二十碳五烯酸(EPA)异常丰富。此外，还存在一定数量的18：1，亚油酸(LA)（18：2n-6），α-亚麻酸(LNA)（18：3n-3)和花生四烯酸(AA)。淡水小球藻中16:0,16:2和LA丰富，还包含有16：3n-6和LNA。微绿球藻脂肪酸的组成，反映了作为食物，N期富含16：0和EPA，还包含16：1n-7，18:1，LA，LNA和AA。而且20：1和二十二碳五烯酸不饱和脂肪酸（22：5n-3）同样存在，尽管这两种脂肪酸在微绿球藻中很少。DPA在极性脂肪酸中的比例高于非极性脂肪酸。N+FC期富含16：0，LA和EPA，但是18：1，AA，EPA，DPA则降低，而16：2，LA和20：2n-6则比N期升高。FC期16：0，16：2和LA异常丰富，但是16：1n-7，EPA和DPA则明显低于N+FC期。微绿球藻，淡水小球藻，N期，N+FC期，FC期的Sn-6 /Sn-3-values价值分别为0.3，5.7-5.8，0.4，0.9-1.0和6.6-8.4。
在最近的研究中，半持续性的微绿球藻的培养获得了200*106 个/毫升（Fig1.）的密度，这大约是原先采用套管式温度设备的普通开放式池塘的养殖密度的6-10倍，与以前采用管式设备时的研究结果相似。高密度的微绿球藻的极性脂和非极性脂都含有超过25%的EPA(Table 4)，这就表明无菌培养的微绿球藻不包含轮虫生长的必需营养成分，这些营养成分是来自于室外养殖水体。轮虫持续培养的研究成果表明微绿球藻的养殖水体中含有轮虫生长所必需的维他命B12、A、D和E。因此，微绿球藻在轮虫的实际培养中是可以利用的。
以不同的饵料（N→N+FC→FC）持续饲喂轮虫已经获得成功，而以前的研究表明，在饵料充足的基础上，投喂微绿球藻或者淡水小球藻会取得相同的投喂效果，而轮虫密度也会相应的改变。在实践中，L型轮虫持续培养系统的适宜密度应为个/mL，因此，不管是喂养微绿球藻还是微绿球藻与淡水小球藻混合投喂都必须使如此高密度的轮虫保持其稳定性。从最近的研究可以看出，持续喂养的轮虫能够适应从单饵料到混合饵料的转变，而且混合投喂还可以提高轮虫密度。单独投喂微绿球藻会比其他两种投喂方法获得更高的轮虫日生产率，尤其是比投喂淡水小球藻高，这也与之前的研究工作相呼应。所以，这说明投喂微绿球藻的轮虫生产率会比投喂淡水小球藻高。
至于脂肪酸方面，喂养微绿球藻的轮虫（N-R）的非极性脂中EPA超过25%，而极性脂中超过20%（这与原先的研究结果相同），至于非极性脂中DPA超过3.5%，极性脂中超过7.5%。换言之，就是N-R的极性脂中DPA占有更大的比重。虽然根据Kayama所说，轮虫的n-3系列脂肪酸中能够合成DPA，但是研究中却未在新陈代谢中发现DPA。总所周知，一些种类的浮游植物和鳟鱼的代谢生成DHA，其步骤如下：LNA→20：3n-3→20：4n-3→EPA→DPA，然后通过24：5n-3→24：6n-3→22：6n-3（DHA）。由此可得出，代谢中微绿球藻的n-3系列脂肪酸转化成EPA，而在N-R中则转化成DPA。因此，我们需要更注重于研究仔鱼养殖中富含DPA和富含DHA的轮虫的不同效用。事实上，在正常条件下，如果只饲喂N-R的话，很难培育出健康的海水类仔鱼。而且，因为通常情况下极性脂只存活于生物膜和细胞膜中，但我们却在死去的轮虫中发现DPA的成分有所提高，这就表明DPA是累积在磷脂质中的。这个结果已经在有关包含DPA的高度不饱和脂肪酸的报告中被证实了。
因为饲喂轮虫的时候在微绿球藻中添加了淡水小球藻而在轮虫中发现了较高水平的16：2、LA和20：2n-2。这表明轮虫摄入微绿球藻的同时也摄入淡水小球藻。相比之下，18：1、AA、EPA和DPA的含量呈现下降趋势。从轮虫的中间脂肪酸含量可以体现出微绿球藻和淡水小球藻的脂肪酸含量概况。此外，由于投喂微绿球藻或淡水小球藻，轮虫中 / 的比例大致相等。因此，在轮虫的持续喂养中，混合投喂可以有效的控制 / 的比例。这些轮虫也可以当做某些对n-3HUFA要求不高的淡水或半咸水鱼类的养殖饵料。
正如Table 4的脂肪酸所示，如果仅投喂淡水小球藻的话，会使16：0、16：2和LA的含量较高，这也与以前的一项研究相符合。
综上所述，研究表明持续喂养的轮虫从单饵料转换到混合饵料的过程中能够产生适应能力而且混合饵料还可以提高轮虫的密度。而且轮虫同时摄入微绿球藻和淡水小球藻，并从中获得较高含量的脂肪酸。再者，使用新型套管式温度控制系统可以和管式温度控制系统一样形成微绿球藻的高密度养殖，所以可以说新型的微藻养殖系统已经获得成功。因此，将来的研究不应只注重于微绿球藻和轮虫的养殖，还应关注于轮虫养殖废水的处理和回收利用，这样或许可以提高轮虫培养系统的养殖效率。将来一旦轮虫养殖废水循环利用系统能够可行，富营养化的轮虫养殖废水也许可以循环再利用于微绿球藻的培养。
【关键词】褶皱臂尾轮虫，连续培养，二十二碳五烯酸，二十碳五烯酸，脂肪酸组成，微绿球藻。&
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小球藻营养液投喂轮虫效果的研究
通过小球藻营养液和活性干酵母单独或混合投喂褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)的对比试验,从轮虫的生长状况、抱卵率和怀卵量的变化,比较不同饵料及投喂方式对轮虫生长繁殖的影响,结果表明:①投喂小球藻营养液和酵母的干重比为2:1(小球藻营养液53 g·亿个-1·d-1、酵母10 g·亿个-1·d-1)的轮虫增长密度最高;②投喂小球藻营养液和酵母的干重比为1:1(小球藻营养液40 g·亿个-1·d-1、酵母15 g·亿个-1·d-1)的轮虫抱卵率最高;③单独或混合投喂小球藻营养液的轮虫培养桶内水质保持良好,水色呈浅褐色,且水中颗粒状物少;④水温28C比23C时轮虫增长快、抱卵率高,但易长红色真菌和聚缩虫.
CHEN Xue-hao
WU Zhong-qiang
作者单位：
集美大学水产学院,水生生物技术研究所,福建,厦门,361021
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基金项目：
福建省科技厅科研项目
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万方数据电子出版社小球藻浓缩液培养轮虫 | 上海光语生物科技有限公司
2014 年 4 月 27 日
轮虫广泛分布于湖泊、池塘、江河、近海等各类淡、咸水水体中。甚至潮湿土址和苔藓丛中也有它们的踪迹。轮虫因其极快的繁殖速率，生产量很高，在生态系结构、功能和生物生产力的研究中具有重要意义。轮虫是大多数经济水生动物幼体的开口饵料。在渔业生产上有颇大的应用价值。
培养轮虫是每个水产区域内育苗以及养殖过程中首要事项，培养轮虫使用面包酵母投喂，但是会造成营养不足，需要补充小球藻等绿藻才能促进轮虫的营养全面发育，上海光语生物科技有限公司为培养轮虫所开发的，根据轮虫需要调控营养构成，富含蛋白，多糖，维生素和不饱和脂肪酸等营养成分。
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轮虫饵用特点
1）生活力强：易培养，喜欢有机质较丰富的水体。
2）繁殖快：环境条件适宜时，日生长率达30%。
3）营养丰富：干物质中蛋白质含量57%、脂肪20%、钙1.8%、磷15%。
4）大小适宜：约150×250μ，为大多数有鳍鱼类的开口饵料。
1）、温度：适温25-35℃，繁殖临界水温10℃，低于5℃和高于40℃不能存活。日本把在不同温度下培养的轮虫分为S型和L型轮虫。 S型轮虫：个体小，适宜较高水温下培养（30-35℃），但不耐低温。L型轮虫：个体大，适宜较低水温下培养（20-25℃）。
2）、盐度：生活为2-50‰，适宜盐度10-30‰，最适盐度15-25‰（18‰，比重1.016），不适应盐度的突然变化。
3）、光照：有光照下培养比黑暗好，适宜光照LX。因为光照能抑制原生动物繁殖，并促进单胞藻和光合细菌生长。
4）、溶氧：保持1.5mg/l以上即可，耐力强。
5）、种群密度：密度大，则卵少、繁殖慢；密度小，则卵多、繁殖快。但密度太小易被敌害侵入，一般密度达200个/毫升即要间疏采收。
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