可以用转染某一基因的过表达真核细胞基因表达调控再做同一基因的沉默吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-14 05:05 标签： 基因过表达步骤和沉默
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项目名称稳定沉默NOR1、NF-κB基因表达对肝癌细胞侵袭和转移的影响及作用机制研究
批准金额20 万元
所属类别青年科学基金项目
NOR1是课题组克隆的一个与化学因素致癌相关的基因，前期研究表明NOR1基因与核转录因子NF-κB可能存在相互作用引起细胞粘附分子E-选择素的表达上调从而参与肝癌的发生及转移。本课题拟利用激光共聚焦荧光显微技术和免疫共沉淀分析、报告基因法和点突变技术分析、染色质免疫沉淀等方法明确NOR1基因和NF-κB的相互作用以及与E-选择素启动子结合的作用机制研究；考察利用以miR-30结构为基础的第二代shRNA即shRNAmir高效、稳定沉默NOR1或/和NF-κB基因的表达后对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响，并进一步建立肝癌裸鼠移植瘤模型，利用磁共振灌注成像等技术在体内考察NOR1、NF-κB被抑制后对肿瘤组织微血管形成及侵袭能力的改变。本项目通过对环境因素致癌相关基因NOR1的研究将形成研究肿瘤形成遗传因素和环境因素的交叉点，为肝癌的综合治疗和预防提供理论和实验依据。
结题摘要【NOR1基因在肝癌发生和发展过程中的作用】
我们利用在含HBV信息的肝正常、肝炎、肝硬化、肝癌组织芯片，采用原位杂交，免疫组化试验检测NOR1在mRNA水平和蛋水平的表达差异。结果表明NOR1基因在肝正常、肝炎、肝硬化、肝癌组织中表达逐步增强，进一步证实了NOR1基因在肝癌发生、发展过程中所起的作用。
【NOR1促进CB1954细胞杀伤机制研究】
NOR1 是一个与亚硝胺类化合物致鼻咽癌、肝癌相关的新基因， NOR1基因转染能使肝癌细胞HepG2中生长因子受体结合蛋白2(Grb2) 在mRNA水平的表达增加约4.8倍，Grb2蛋白水平上调大约在8.7倍左右，有显著的变化。结果证实HepG2过转NOR1基因能够加速CB1954对细胞凋亡现象，细胞出现了明显杀伤作用。随后本研究发现NOR1过表达之后CB1954诱导的Caspase-9的表达明显提高，说明NOR1的确促进了CB1954诱导的细胞凋亡的发生。
【NOR1基因在HepG2细胞中呈现高甲基化水平】
目前认为NOR1基因启动子区高甲基化是导致其下调的主要原因，我们通过亚硫酸氢盐修饰直接测序法（BSP）检测了NOR1基因在HepG2细胞中的甲基化水平，发现了甲基化率高达94.4%。在以后的研究中，我们也将检测NOR1基因在不同肝癌分期的患者的甲基化水平，并分析甲基化与化疗药物耐药性、病人预后的相关性，寻找肝癌个体化治疗的分子标记。
【MicroRNA-199a-5p通过靶向作用于NOR1抑制VEGF诱导的肿瘤发生】
用microRNA微阵列技术对HepG2和TMLE-3细胞进行分析，鉴定microRNA的表达异常，结果显示，miR-199A-5P在HepG2细胞下调中起重要作用。我们证实了miR-199A-5P在VEGF过表达的HepG2细胞受到抑制，且呈剂量和时间依赖性。此外，MTT和细胞迁移实验证明miR-199A-5P能够抑制细胞的增殖和迁移。NOR1是miR-199A-5P的下游靶基因，NOR1的上调在miR-199A-5P介导的VEGF诱导HepG2细胞的增殖和迁移的抑制过程中有关键作用。结果表明miR-199A-5P在人类HepG2细胞中，通过NOR1上调和靶向作用在调节细胞增殖和迁移过程中起关键作用。
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rna干扰沉默id1基因在c2c12细胞中表达的研究
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山东农业人学硕士学位论文 RNA干扰沉默脚J基因在C2C12细胞中表达的研究 摘 要 随着人们生活水平的不断提高，消费者和生产者越来越重视猪肉的品质。衡量猪肉 品质的一个重要的指标是肌内脂肪 IMF 的含量，它对肉的嫩度、多汁性和风味有明 显的正效应，目前关于调控猪肌内脂肪沉积的机理还不清楚，主效基因还没有确定。PIDl 基因在脂肪细胞增殖中起重要作用，在肥胖人群中呈高丰度表达。本实验室研究了PIDI 基因在莱芜猪、鲁莱黑猪、大白猪三个猪种的背膘、背最长肌和肝脏中的表达差异以及 的方式，构建以U6启动子控制下能产生针对PIDl的短发夹环状小干扰RNA表达载体， 将干扰载体转染进C2C12成肌细胞中，采用RT-PCR和Western 扰载体对C2C12细胞中PIDI mRNA和蛋白表达的下调作用，为进一步研究验证PIDl 基因影响IMF沉积的功能奠定基础。 interactiondommn 为了构建和筛选对小鼠PIDI phosphotyrosinecontainingl， PIDI 基因RNA干扰的PIDl．shRNA表达载体。根据小鼠PIDI eDNA序列，优化设计 A．C、pGPU6／GFP／Neo-shRNA．D和pGPU6／GFP／N 细胞，采用RT．PCR和Westernblot检测shRNA对C2C12细胞PIDImRNA和蛋白表达 编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。构建的4个表达 载体分别转染C2C12细胞，24 h后细胞中PIDI 1+2．O 56．8
和pGPU6／GFP／lq_eo-shRNA-D表达载体能高效抑制转染细胞PID．1mRNA和蛋白的表达， ． 为进一步研究验证PIDI基因的功能奠定了基础。 关键词：小鼠；PIDl基因：RNA干扰：表达载体 12细胞中表达的研究 RNA干扰沉默PIDI基因在C2C ‘ ’ ?? ? ．： ?。
． ．。 二 of RNA SilencePIDl interferencein 12 gene using C2C expression ’ ceilline‘ 。 Abstract Witllthe and ofthe standard，consumers
more improvement living producers
正在加载中，请稍后...如何让一个细胞过度表达某种基因,来观察此基因的作用,瞬时转染和稳定转染都用什么方法转染时每个细胞只近入一个质粒还是很多质粒,过度表达的标准是什么呢
苏不萌受CBO
转染的话一般是以克数来规范转染的质粒数量,所以会有很多质粒.一般转染的质粒除了带有需要过表达的基因以外,还需要带有标记基因.标记基因可以被特定的抗体检测,从而判断是否有效表达.如果你要过表达的是某种蛋白,也可以直接通过该蛋白的抗体检测,对照是没有转染的同种细胞,这样表达效果就可以通过WESTERN BLOT看见了.过表达倒没什么标准,每种蛋白表达量也不一致,选择适合自己的浓度就好.顺转的话,我们实验室采用lipo2000,具体步骤百度文库有,英文的protocol在lipo2000的说明书上也能看到.稳转的话一般需要在质粒上构建某个抗性基因,如嘌呤霉素抗性.这样用抗性培养基多次筛选就可以筛选出稳转的细胞株,但是比较难.
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